實驗五-SDS-PAGE檢測微生物有機磷降解酶的誘導表達

實驗五SDS檢測微生物有機磷降解酶的誘導表達實驗目的：1．觀察重組表達蛋白在IPTG誘導下的表達過程2．掌握蛋白質(zhì)的SDS電泳原理和實驗技術實驗材料：1．材料30%丙烯酰胺溶液，1.5mol/LTris-HCl（pH8.8)，10%SDS，10%過硫酸銨，1.0mol/LTris-HCl(pH6.8),5×蛋白質(zhì)電泳緩沖液，考馬斯亮藍染色液，脫色液，lmol/L的IPTG溶液，2×上樣緩沖液，蛋白質(zhì)分子量標樣。2．儀器電泳儀，垂直電泳槽，超聲波破碎儀，高速低溫冷凍離心機。實驗原理:表達產(chǎn)物可以通過SDS電泳來分析檢測，蛋白質(zhì)與SDS結合后形成帶有大量負電荷的橢球形結構，所有的蛋白質(zhì)均帶有大量負電荷（可以忽略不同蛋白質(zhì)間荷電數(shù)的差異），在電場作用下按相對分子量大小在板狀膠上排列。通過SDS檢測可以發(fā)現(xiàn)外源蛋白隨誘導時間的增加表達量增加，條帶濃度加深。目前在蛋白質(zhì)電泳中最廣泛使用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按雙丙烯酰胺：丙烯酰胺為1：29配制，它能分離大小相差只有3%的多肽。凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時所使用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。實驗內(nèi)容：1．微生物有機磷降解酶在大腸埃希菌中的誘導表達從LB（含50mg/mL卡那霉素）平板上挑取E.coliBL21（DE3）/pET28-yjl單菌落于50mLLB培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按2%接種量接種至1.2L新鮮LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)約2.5h后，OD600增至約0.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每隔30min取10mL培養(yǎng)液，4℃、6000r/min2．菌體破碎收集的菌體重懸于lmLTE(pH8.0)緩沖液中，進行超聲波破碎，破碎時間6min，30s脈沖，30s間歇，菌體裂解液4℃10000g離心10min，取上清液進行PAGE3．SDS聚丙烯酰胺凝膠制備與電泳確定所需凝膠溶液體積，在三角瓶中配制濃度10%的丙烯酰胺分離膠溶液，依次混合各成分。一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應立即快速旋動混合物并進入下一步操作。迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注積層膠所需空間（梳子的齒長再加lcm)。用巴斯德吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層0.1%SDS。將凝膠垂直放置于室溫下。分離膠聚合完全后(30min），傾出覆蓋層液體，用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的丙烯酰胺。盡可能排去凝膠上的液體，再用紙巾的邊緣吸盡殘留液體。在一個一次性塑料試管中制備3mL濃度5%的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。一旦加入TEMED，立即快速旋動混合物并進入下一步操作。在已聚合的分離膠上直接灌注積層膠，立即在積層膠溶液中插入干凈的Teflon梳子。小心避免混入氣泡，再加入積層膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。當積層膠發(fā)生聚合時，把樣品置于1×SDS凝膠加樣緩沖液中，在100℃加熱3min積層膠聚合完全后（30min)，小心移出Teflon梳子，使用能噴射水流的瓶子，立即用去離子水洗滌加樣槽以除去未聚合的丙烯酰胺。使用接于注射器的平頭注射針頭把積層膠上加樣槽之間的齒弄直。把凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液。必須設法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡，為此最好使用接上注射器的彎形注射針頭。按預定順序加樣，每樣品加15ml。最后在所有不用的樣品孔中加上等體積的1×將電泳裝置與電源相接（正極應接下槽），凝膠上所加電壓為8V/cm。當染料前沿進入分離膠后，把電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至澳酚藍到達分離膠底部（約需4h)，然后關閉電源。從電泳裝置上卸下玻璃板，放在紙巾上，用刮勺撬開玻璃板。4．用考馬斯亮藍對SDS來丙烯酰胺凝膠進行染色在90mL甲醇：水（1:1，V/V）和10mL冰乙酸的混合液中溶解0.25g考馬斯亮藍8250.用Whatman1號濾紙過濾染液以去除顆粒狀物質(zhì)。用至少5倍體積的染液浸泡凝膠，放