海洋生物體中金剛烷胺的測定　液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

海洋生物體中金剛烷胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法警告：實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液、有機(jī)溶劑等均具有一定的毒性和揮發(fā)性，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)避免與其直接接觸，樣品前處理過程應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。范圍本文件描述了海洋生物體中金剛烷胺液的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，包括原理、試劑及配制、儀器和設(shè)備、樣品、分析步驟、結(jié)果計(jì)算與表示、準(zhǔn)確度、質(zhì)量控制和質(zhì)量保證、廢物處置等。本文件適用于海洋生物體魚、蝦、海參、海帶和貝類中金剛烷胺的測定。當(dāng)稱樣量為3.00?g時(shí)，金剛烷胺檢出限為0.5?μg/kg，測定下限為1.0?μg/kg。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。原理海洋生物體樣品用1%乙酸乙腈提取后，經(jīng)固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標(biāo)法定量。試劑及配制實(shí)驗(yàn)室用水：GB/T6682，一級。甲醇（CH3OH）：色譜純。甲酸（HCOOH）：色譜純。乙腈（CH3CN）：色譜純。氨水（NH4OH）：優(yōu)級純。乙酸（CH3COOH）：優(yōu)級純。1%乙酸乙腈溶液（體積分?jǐn)?shù)）。取1?mL乙酸，用乙腈定容至100?mL。5%氨水甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)）。取5?mL氨水，用甲醇定容至100?mL。0.1%甲酸溶液（體積分?jǐn)?shù)）。取0.10?mL甲酸，用水定容至100?mL。0.1%甲酸乙腈定容液（體積分?jǐn)?shù)）。將1?mL甲酸與300?mL乙腈，加入到700?mL水中。金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS號768-94-5，純度大于99.0%。D15-金剛烷胺內(nèi)標(biāo)溶液：CAS號33830-10-3，1?mg/mL。金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液。稱取金剛烷胺0.010?0?g，用乙腈溶解，并定容至10?mL，配制成1.0?mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20?℃下避光保存，有效期為90?d。金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液。移取100μL金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液（5.13），用乙腈溶解，并定容至100?mL，配制成1.0?μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，4?℃下避光保存，有效期為30?d。D15-金剛烷胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液。移取100?μLD15-金剛烷胺內(nèi)標(biāo)溶液（5.12），用乙腈溶解，并定容至100?mL，配制成1.0?μg/mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液，4?℃下避光保存，有效期為30?d。D15-金剛烷胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。移取1?mLD15-金剛烷胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液（5.15），用乙腈定容至10?mL，配制成100?μg/L內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，4?℃下避光保存，有效期為7?d。儀器和設(shè)備液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧電離源（ESI源）。天平：感量分別為0.01?g和0.000?1?g。均質(zhì)機(jī)。高速離心機(jī)：10?000?r/min。超聲波清洗器。渦旋混合器。固相萃取裝置。固相萃取柱：MCX（混合型陽離子固相萃取柱），60?mg/3?mL，或相當(dāng)者。氮吹儀。聚丙烯離心管：50?mL。濾膜：聚偏氟乙烯濾膜，孔徑為0.22?μm。樣品制備魚，去鱗、去皮，沿脊背取肌肉，將鱗、皮單獨(dú)收集；蝦，去頭、去殼、去腸腺，取肌肉部分；海參、海帶、貝等取可食部分，樣品充分?jǐn)囁?、混勻。如不能及時(shí)檢測，-18?℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量新鮮或解凍的空白或供試組織，絞碎，并使均質(zhì)。提取稱取3.00（±0.01）g樣品至50?mL離心管中，加入100?μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.16）和15?mL1%乙酸乙腈溶液（5.7），渦旋30?s，超聲提取15?min，8?000?r/min離心10?min，待凈化。凈化MCX固相萃取柱經(jīng)6?mL甲醇（5.2）和6?mL水（5.1）活化后，取5?mL上清液移入固相萃取柱，3?mL水（5.1）淋洗，6?mL5%氨水甲醇溶液（5.8）洗脫，全程控制流速為2?mL/min～3?mL/min。收集洗脫液，用氮吹儀于40?℃下吹至近干，用定容液（5.10）定容至1?mL，過濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析?？瞻自嚇拥闹苽涑患釉嚵贤猓瓷鲜鰷y定步驟進(jìn)行。分析步驟液相色譜質(zhì)譜條件液相色譜條件：色譜柱：C18（100?mm×2.1?mm，1.8?μm），或相當(dāng)者；色譜柱溫度：40?℃；流速：0.25?mL/min；進(jìn)樣量：10?μL；流動相：A為乙腈（5.4）；B為0.1%甲酸溶液（5.9）；流動相梯度洗脫程序見表1。流動相梯度洗脫程序表時(shí)間min流速mL/min流動相A%流動相B%0.000.255950.500.255950.600.259555.000.259555.100.255957.000.25595質(zhì)譜條件：離子化模式：ESI+；電離電壓：2.50?kV；錐孔電壓：25?V；離子源溫度：140?℃；錐孔反吹氣流速：50?L/h；脫溶劑氣溫度：400?℃；脫溶劑氣流速：700?L/h；氬氣流速：0.12?mL/min；測定方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（SRM），定量離子和定性離子參數(shù)見表2。待測物定量離子和定性離子參數(shù)化合物母離子m/z子離子m/z錐孔電壓V碰撞能量eV金剛烷胺152932530135a2517金剛烷胺內(nèi)標(biāo)167141a2517表示定量離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立移取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.14）10μL、20μL、40μL、50μL、100μL于進(jìn)樣瓶中，分別加入100

μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.16），用定容液（5.10）定容至1mL，使金剛烷胺濃度分別為10.0?μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、50.0?μg/L、100?μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。以各標(biāo)準(zhǔn)工作液金剛烷胺峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以各標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣測定按照儀器條件（8.1），分別測定金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（8.2）、試樣（7.3）、空白試樣（7.4），金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖參見附錄A。結(jié)果計(jì)算與表示定性分析在同樣測試條件下，陽性樣品的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測物的保留時(shí)間偏差在±2.5%以內(nèi)，在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的特征離子均應(yīng)出現(xiàn)，且檢測到的離子的相對豐度，應(yīng)與濃度相當(dāng)?shù)男Ｕ龢?biāo)準(zhǔn)溶液相對豐度一致。定性確證時(shí)相對離子豐度的允許偏差應(yīng)符合表3的要求。定性確證時(shí)相對離子豐度的允許偏差相對離子豐度%允許偏差%＞50±20＞20～50±25＞10～20±30≤10±50定量分析按8.1設(shè)定儀器條件，待儀器穩(wěn)定后，根據(jù)表2中的定量離子分別對金剛烷胺和內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測定，記錄保留時(shí)間和峰面積，以峰面積比按內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)定量，標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液中待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)。結(jié)果計(jì)算樣品中金剛烷胺的含量按公式（1）計(jì)算： （AUTONUM）式中：x

——樣品中金剛烷胺的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；c

——試樣溶液中金剛烷胺的濃度，單位為微克每升（μg/L）；c0——空白試樣溶液中金剛烷胺的濃度，單位為微克每升（μg/L）；V

——試樣溶液的定容體積，單位為毫升（mL）；m——樣品的濕重，單位為克（g）。結(jié)果表示計(jì)算結(jié)果扣除空白值，測XX果用兩次平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。準(zhǔn)確度精密度本方法批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。詳見表B.1。正確度金剛烷胺在添加濃度1.0?μg/kg～100?μg/kg時(shí)，回收率為70%～120%。詳見表B.2。質(zhì)量控制和質(zhì)量保證空白試驗(yàn)每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）應(yīng)至少分析1個空白試驗(yàn)，空白中金剛烷胺的濃度應(yīng)低于方法檢出限。校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立應(yīng)與批樣測定同時(shí)進(jìn)行；每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）應(yīng)至少分析1個中間點(diǎn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定值與該點(diǎn)初始濃度的相對誤差應(yīng)≤30%；金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r一般應(yīng)大于0.99。平行樣每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）應(yīng)至少測定一個平行樣。平行樣測XX果的相對偏差應(yīng)在±10以內(nèi)。基體加標(biāo)每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）應(yīng)至少測定一個基體加標(biāo)樣品，金剛烷胺回收率應(yīng)在70%～120%之間，見附錄B。廢物處置實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢液和廢物應(yīng)分類收集，集中保管，委托有資質(zhì)的單位進(jìn)行處理。

（資料性）

色譜圖圖A.1、圖A.2、圖A.3給出了金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、空白樣品色譜圖和加標(biāo)樣品色譜圖。金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（10.0?μg/L）空白樣品色譜圖金剛烷胺加標(biāo)樣品色譜圖（金剛烷胺添加量為5.0?μg/kg）

（資料性）

方法的準(zhǔn)確度方法精密度和正確度匯總數(shù)據(jù)見表B.1、表B.2?？瞻讟悠芳訕?biāo)方法精密度序號名稱加標(biāo)量μg/kg實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差%實(shí)驗(yàn)室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差%重復(fù)性限r(nóng)μg/kg再現(xiàn)性限Rμg/kg1大菱鲆101.962.631.010.85502.593.064.653.681002.503.339.587.282刺參101.772.931.050.94503.973.404.983.691002.853.408.977.983海帶103.873.341.030.82502.282.155.023.651002.192.899.268.264南美白對蝦102.542.711.040.86504.603.315.134.981003.363.059.648.265四角蛤蜊104.014.251.060.75503.476.385.264.951005.876.178.797.69空白樣品加標(biāo)方法正確度序號名稱加標(biāo)量μg/kg加標(biāo)測定平均值μg/kg加標(biāo)回收率%加標(biāo)回收率最終值%1大菱鲆109.5495.495.4±1.875048.496.796.7±2.5110094.194.194.1±2.362刺參109.3393.393.3±1.655046.292.592