《卷煙 側(cè)流煙氣中主要酚類化合物的測定 高效液相色譜法試驗報告》

PAGEPAGE7《卷煙側(cè)流煙氣中主要酚類化合物的測定高效液相色譜法》研究報告鄭州煙草研究院甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司云南煙草科學(xué)研究院2011年8月卷煙側(cè)流煙氣中主要酚類化合物的測定高效液相色譜法研究報告1概述酚類化合物是卷煙煙氣中存在的一類重要物質(zhì)，主要包括對苯二酚、鄰苯二酚、間苯二酚、苯酚、間甲酚、對甲酚和鄰甲酚，與煙草的品質(zhì)密切相關(guān)，酚類化合物本身無致癌性，但是具有明顯的促癌作用[1,2]，因此，煙氣中酚類化合物的研究一直受到人們的廣泛關(guān)注，卷煙主流煙氣中酚類化合物的分析研究工作開展較早，卷煙煙氣是一個非常復(fù)雜的混合物體系，其中含有的化合物超過5000種，卷煙煙氣中酚類物質(zhì)有40多種，很多種分析技術(shù)，都曾經(jīng)應(yīng)用于卷煙煙氣中酚類的分析，如復(fù)雜的液-液萃取、柱層析和衍生化[3-5]，但由于卷煙煙氣是非常復(fù)雜的混合物，而且酚類的含量很低，因此酚類化合物的準(zhǔn)確定量一直都是很困難的工作。在早期的定性研究中，氣相色譜法[6]是卷煙煙氣中酚類物質(zhì)分析中應(yīng)用較多的技術(shù)，但是由于酚類成分容易被氧化，并且具有較強(qiáng)的活性，應(yīng)此對其定量必須采用衍生化處理，操作較為繁瑣。2004年謝復(fù)煒等[7]利用高效液相色譜法熒光檢測器進(jìn)行了卷煙主流煙氣中酚類成分的分析測定，該方法不需要衍生化，可以直接進(jìn)行樣品測定，簡化了分析步驟，提高了定量的可靠性。同時由于采用熒光檢測，大大提高分析的靈敏度。并在該方法的基礎(chǔ)上，形成了煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T255-2008“卷煙主流煙氣中主要酚類化合物的測定高效液相色譜法”[8]隨著側(cè)流煙氣捕集裝置的發(fā)展，魚尾瓶吸收裝置因易與吸煙機(jī)連接且不影響卷煙的燃燒過程，從而成為CORESTA推薦的卷煙側(cè)流煙氣收集裝置。1999年加拿大衛(wèi)生部公布了卷煙側(cè)流煙氣中酚類物質(zhì)的測定，該方法利用改裝直線型吸煙機(jī)，添加魚尾瓶裝置，將濾片放置于魚尾瓶收集卷煙的側(cè)流煙氣，透過濾片的部分煙氣用100ml1%乙酸溶液捕集，再用20ml1%乙酸溶液洗滌魚尾瓶兩次，合并洗滌液，振蕩萃取，進(jìn)行液相色譜-熒光檢測器分析，2001年謝復(fù)煒等人[9]用魚尾瓶收集卷煙側(cè)流煙氣，用高效液相色譜－紫外檢測器進(jìn)行了定量分析。煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T185-2004“卷煙側(cè)流煙氣中焦油和煙堿的測定”[10]也采用了魚尾瓶作為捕集側(cè)流煙氣的方法。目前卷煙主流煙氣中主要酚類化合物的測定標(biāo)準(zhǔn)方法[8]在2008年發(fā)布，而卷煙側(cè)流煙氣中主要酚類化合物的測定方法目前還沒有建立標(biāo)準(zhǔn)。2實驗2.1儀器和試劑CeruleanSM405-SV型側(cè)流吸煙機(jī)；Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent)，配備自動進(jìn)樣器、柱溫箱、熒光檢測器；CP224S電子天平(感量0.000lg，德國Sartorius)；KQ-700DE型超聲波振蕩器(中國舒美)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。乙腈、乙酸、異丙醇(均為色譜純)；對苯二酚，間苯二酚，鄰苯二酚，苯酚，鄰-甲酚，間-甲酚和對-甲酚，純度應(yīng)大于98%。（標(biāo)樣，F(xiàn)luka）；魚尾罩，吸收瓶，具塞錐形瓶。樣品卷煙A（烤煙型，卷煙危害性評價參比卷煙，焦油12mg）；樣品卷煙B（混合型，卷煙危害性評價參比卷煙，焦油8mg）；樣品卷煙C（烤煙型，國產(chǎn)某品牌，焦油13mg）；樣品卷煙D（烤煙型，國產(chǎn)某品牌，焦油8mg）。2.2抽吸卷煙按GB/T19609規(guī)定調(diào)節(jié)煙支和濾片水分，調(diào)節(jié)和測試大氣應(yīng)符合GB/T16447的規(guī)定，并確定和標(biāo)記抽吸卷煙的煙蒂長度。按照YC/T185中側(cè)流煙氣抽吸方法，調(diào)節(jié)側(cè)流吸煙機(jī)的抽吸流量為3000mL/min，抽吸2支卷煙，用魚尾罩和玻璃纖維濾片捕集側(cè)流煙氣總粒相物，氣相部分中的主要酚類化合物用一個吸收瓶（使用1%乙酸水溶液作為吸收液）進(jìn)行捕集，吸收瓶中的1%乙酸水溶液體積為20mL。2.3樣品分析2.3.1清洗魚尾罩用50mL1%乙酸水溶液均勻清洗魚尾罩，清洗液收集到200mL錐形瓶中，并對錐形瓶中收集到的魚尾罩清洗液進(jìn)行稱重，確定清洗液的體積。2.3.2樣品萃取將收集有側(cè)流煙氣粒相物的玻璃纖維濾片放入收集有魚尾罩清洗液的錐形瓶中，再加入50mL1%乙酸水溶液，室溫下超聲萃取40min，靜置5min，經(jīng)0.45um水相濾膜過濾進(jìn)行色譜分析。使用裝有20ml1%乙酸水溶液的吸收瓶對側(cè)流煙氣的氣相部分進(jìn)行捕集，待抽吸結(jié)束后，搖勻，過水相濾膜進(jìn)行液相色譜分析。2.3.3色譜柱：150×4.6mm固定相C18（LUNA）填料粒度5μm。流動相A：1%乙酸水溶液流動相B：乙酸:乙腈:水（1/30/69）v/v/v柱溫：30柱流量：1ml/min進(jìn)樣體積：10μL梯度：0分鐘:流動相B20%,15分鐘:流動相B60%,23分鐘:流動相B100%,35分鐘:流動相B100%,40分鐘:流動相B20%檢測器：熒光檢測器條件如表1所示。表1熒光檢測器條件時間（分鐘）激發(fā)波長（nm）發(fā)射波長（nm）028433252753158277319122723092027332340284332結(jié)果與討論玻璃纖維濾片捕集效率考察由于側(cè)流吸煙機(jī)抽吸過程中空氣流速達(dá)到3000mL/min，而且側(cè)流煙氣TPM遠(yuǎn)高于主流煙氣TPM，因此酚類化合物有可能穿透玻璃纖維濾片。在捕集器后串聯(lián)2個分別裝有20mL1%乙酸水溶液的吸收瓶對氣相成分進(jìn)行捕集，抽吸2支卷煙，將吸收瓶中的溶液搖勻，過水相濾膜進(jìn)行液相色譜分析。實驗結(jié)果如表2所示。第一個吸收瓶中能夠檢測到間苯二酚和苯酚，分別占比100%和1%左右，第二個吸收瓶中未檢出酚類化合物。因此需要連接一個吸收瓶，并加入20ml1%乙酸水溶液作為吸收液。表2吸收瓶分析結(jié)果實驗次數(shù)第一個吸收瓶第二個吸收瓶含量（ug/cig）占比含量（ug/cig）間苯二酚苯酚間苯二酚苯酚間苯二酚苯酚第一次5.82.8100%1.27%ndnd第二次5.92.1100%0.87%ndnd第三次6.42100%0.83%ndnd第四次6.52.8100%1.26%ndnd魚尾罩清洗試劑及用量的選擇分別選擇1%乙酸水溶液、異丙醇和去離子水作為魚尾罩淋洗試劑，依次加入20mL、20mL、10mL對魚尾罩進(jìn)行清洗。結(jié)果顯示（表3）：用異丙醇和1%乙酸水溶液作清洗試劑結(jié)果相對較好。從實驗現(xiàn)象可以看出，使用20mL異丙醇基本上能將魚尾罩上的酚類化合物全部清洗下來，后面兩次試驗均未檢測出酚類化合物；使用1%乙酸溶液進(jìn)行清洗時，第一次試驗?zāi)軌蚯逑吹艚^大部分的酚類化合物，但第二次試驗時在清洗液中還能檢測到少量的苯酚。再次使用10mL1%乙酸水溶液進(jìn)行清洗時，在清洗液里未檢測出酚類化合物；而使用去離子水作為清洗試劑時，三次實驗均能在清洗液中檢出酚類化合物。由于后續(xù)使用1%的乙酸水溶液對濾片進(jìn)行萃取處理，考慮到標(biāo)準(zhǔn)方法的易操作性，最終選擇1%乙酸水溶液作為魚尾罩的清洗試劑。清洗體積為50mL。表3 魚尾罩清洗試劑及用量的選擇酚類化合物鄰苯二酚苯酚（對、間）-甲酚鄰-甲酚1%乙酸水溶液+20ml0.852.921.250.24+20mlnd0.09ndnd+10mlndndndnd異丙醇+20ml0.862.891.220.22+20mlndndndnd+10mlndndndnd去離子水+20ml0.862.861.250.23+20mlnd0.1ndnd+10mlnd0.08ndnd濾片萃取時間的選擇由于卷煙側(cè)流煙氣中主要酚類化合物的釋放量相對較大，因此樣品萃取時間進(jìn)行了研究考察，實驗結(jié)果如表4所示，隨著萃取時間的增加，酚類化合物的釋放量明顯增加，但當(dāng)萃取時間為40分鐘后，酚類化合物的釋放量基本沒有變化，最終選定萃取時間為40分鐘。表4 萃取時間的選擇時間對苯二酚ug/cig鄰苯二酚ug/cig苯酚ug/cig（對、間）-甲酚ug/cig鄰-甲酚ug/cig20min157.8126.319469.321.430min176.6142211.67822.840min189149.7218.679.923.750min191.1151.2219.780.123.260min191.6152.3219.980.123.6分析方法評價方法回收率取卷煙樣品A，以其平行五次測定的平均值作為計算酚類化合物的原始含量的依據(jù)，添加高中低三個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行回收試驗。由表5可見，卷煙側(cè)流煙氣中酚類化合物的回收率在97.8%~100.2%之間，說明本方法的準(zhǔn)確性較高。表5方法回收率酚類化合物回收率/%低濃度中濃度高濃度對苯二酚99.599.8100.1間苯二酚97.898.999.6鄰苯二酚99.599.499.8苯酚99.699.4100.2（對、間）-甲酚98.999.399.6鄰-甲酚98.899.599.9方法精密度實驗考察了本方法的日內(nèi)日間精密度。結(jié)果如下表所示：表6方法的精密度試驗（1）測定次數(shù)日內(nèi)檢測(μg/cig)對苯二酚間苯二酚鄰苯二酚苯酚（對、間）-甲酚鄰-甲酚1191.36.1153.7245.187.626.821966.4151.9238.489.327.23192.36.1151.1247.688.126.34181.87146.1228.687.428.85209.46.8156.9233.694.428平均值194.16.5152238.789.427.4RSD5.15%6.27%2.60%3.30%3.25%3.59%表7方法的精密度試驗（2）測定次數(shù)日間檢測(μg/cig)對苯二酚間苯二酚鄰苯二酚苯酚（對、間）-甲酚鄰-甲酚1189.35.9152.8245.184.6282182.86.4150.3238.487.826.23192.65.9157.6249.686.928.54208.56.4147.8229.689.526.45184.86.9158.7227.693.628.5平均值191.66.3153.4238.188.527.5RSD5.32%6.64%3.04%4.01%3.80%4.12%可以看出，本方法對卷煙樣品的測試精密度較好。工作曲線及檢測限稱取約200mg的鄰-苯二酚，對-苯二酚，苯酚，約100mg的鄰-甲酚、間-甲酚，約50mg的間-苯二酚（精確至0.0001g），加入約30mL1%乙酸水溶液，待完全溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL的棕色容量瓶中，用1%乙酸水溶液定容至刻度。得到酚類化合物儲備溶液。準(zhǔn)確移取10.00mL儲備溶液至100mL容量瓶中，用1%乙酸水溶液稀釋至刻度，得到一級標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取10mL一級標(biāo)準(zhǔn)溶液至100mL棕色容量瓶中，用1%乙酸水溶液定容至刻度。得到二級標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確移取1mL、2mL、5mL二級標(biāo)準(zhǔn)溶液，1mL、2mL一級標(biāo)準(zhǔn)溶液(至50mL棕色容量瓶中，用1%乙酸水溶液定容至刻度。此五個標(biāo)準(zhǔn)溶液及二級標(biāo)準(zhǔn)溶液為系列標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液。將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行色譜分析，得到酚類化合物的積分峰面積，用酚類化合物濃度比值作為橫坐標(biāo)，用酚類化合物峰面積比值作為縱坐標(biāo)，建立酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表8方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限①和定量限②酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)檢測限/(μg/支）定量限/(μg/支）對苯二酚Y=40.56x-2.990.99990.0260.078間苯二酚Y=22.37x-0.490.99990.0050.015鄰苯二酚Y=15.93x-0.680.99990.05040.1512苯酚Y=41.63x-0.670.99990.08320.2496（對、間）-甲酚Y=29.55x-0.380.99990.07440.2232鄰-甲酚Y=34.62x+0.340.99990.07920.2376注：①以最低濃度標(biāo)樣重復(fù)10次測試標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計算；②以最低濃度標(biāo)樣重復(fù)10次測試標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍計算實際樣品的測定應(yīng)用本方法對多種卷煙樣品進(jìn)行了側(cè)流煙氣中主要酚類化合物的分析測定，結(jié)果見表9。表9實際卷煙樣品側(cè)流煙氣中主要酚類化合物釋放量(μg/支）卷煙樣品對苯二酚間苯二酚鄰苯二酚苯酚（對、間）-甲酚鄰-甲酚國產(chǎn)烤煙1175.935.76173.48253.28115.7638.79國產(chǎn)烤煙2146.713.89160.29270.78102.3328.87國產(chǎn)烤煙3169.026.60145.61249.35104.5131.18國產(chǎn)烤煙4148.335.87119.41224.73108.0431.86國產(chǎn)烤煙5154.275.03140.65230.43101.9224.81國產(chǎn)烤煙6245.537.17164.63258.4997.6133.80國產(chǎn)烤煙7155.835.84131.65234.0696.7736.60國產(chǎn)烤煙8204.806.88168.48265.36106.8734.58國產(chǎn)烤煙9168.456.48150.28234.68102.4032.57國產(chǎn)混合184.873.2373.44202.9278.6126.92國產(chǎn)混合283.593.0382.87184.5675.6124.15國產(chǎn)混合395.863.99103.04229.6292.9529.32國產(chǎn)混合493.823.4285.50223.6194.9929.98國產(chǎn)混合5128.034.0092.39224.63107.7737.03國產(chǎn)混合6121.932.97119.11205.0577.3330.26國外卷煙1125.814.4088.61202.7884.4823.92國外卷煙2161.324.31128.31279.56109.0531.85國外卷煙3152.253.61129.54240.91102.2026.68國外卷煙4151.752.58108.55227.0597.4334.39國外卷煙5145.203.32111.02233.2498.0335.43不同實驗室之間實驗結(jié)果比較為了驗證本方法在不同實驗室的應(yīng)用情況，本項目組織了6家實驗室采用該方法對4個不同類型的樣品卷煙進(jìn)行了分析測定，實驗結(jié)果見表10-13。4個驗證樣品的主要酚類化合物在不同實驗室間測定結(jié)果的變異系數(shù)在3.0%～8.8%之間，說明方法再現(xiàn)性良好。實驗結(jié)果表明，應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法，不同實驗室得到了較為一致的分析結(jié)果，對不同類型卷煙樣品具有良好的測試效果。說明本方法可操作性強(qiáng)，易于推廣。表10不同實驗室之間側(cè)流煙氣主要酚類化合物測定結(jié)果比較（μg/支）（A卷煙）實驗室編號對苯二酚間苯二酚鄰苯二酚苯酚（對、間）-甲酚鄰-甲酚1＃平均值245.07.2167.2255.198.635.5rsd（％）2＃平均值241.27.0163.1253.697.933.3rsd（％）3＃平均值228.56.8159.5240.799.330.5rsd（％）4＃平均值231.36.7156.8242.993.232.4rsd（％）6.06.16.25＃平均值228.66.4148.8235.688.932.2rsd（％）6＃平均值231.66.3150.3238.891.231.3rsd（％）匯總統(tǒng)計總平均值234.36.7157.6244.594.932.5各實驗室平均值RSD（％）3.04.65.3表11不同實驗室之間側(cè)流煙氣主要酚類化合物測定結(jié)果比較（μg/支）（B卷煙）實驗室編號對苯二酚間苯二酚鄰苯二酚苯酚（對、間）-甲酚鄰-甲酚1＃平均值117.74.5134.4245.591.831.3rsd（％）2＃平均值120.84.3132.9248.289.732.7rsd（％）3＃平均值112.44.1124.6235.483.227.8rsd（％）6.76.06.44＃平均值124.84.6135.7241.290.328.3rsd（％）5＃平均值124.63.9122.1231.279.929.4rsd（％）6＃平均值116.24.3126.4224.684.631.4rsd（％）匯總統(tǒng)計總平均值119.44.3129.3237.786.630.2各實驗室平均值RSD（％）表12不同實驗室之間側(cè)流煙氣主要酚類化合物測定結(jié)果比較（μg/支）（C卷煙）實驗室編號對苯二酚間苯二酚鄰苯二酚苯酚（對、間）-甲酚鄰-甲酚1＃平均值152.25.7126.0222.193.935.7rsd（％）3.84.05.32＃平均值156.85.6129.0238.594.034.6rsd（％）5.04.17.13＃平均值152.95.8129.5237.698.537.5rsd（％）4＃平均值147.85.3120.6220.489.531.2rsd（％）5.05.86.25＃平均值142.65.0117.5218.686.734.8rsd（％）6＃平均值158.45.3122.4215.793.233.8rsd（％）匯總統(tǒng)計總平均值151.85.5124.2225.592.634.6各實驗室平均值RSD（％）表13不同實驗室之間側(cè)流煙氣主要酚類化合物測定結(jié)果比較（μg/支）（D卷煙）實驗室編號對苯二酚間苯二酚鄰苯二酚苯酚（對、間）-甲酚鄰-甲酚1＃平均值94.74.2101.1229.798.629.9rsd（％）2＃平均值98.04.1104.6215.593.530.7rsd（％）6.34.06.33＃平均值87.64.1108.4225.492.328.8rsd（％）4＃平均值96.63.7111.1232.892.931.7rsd（％）5.05.06.45＃平均值91.13.8108.2218.087.528.3rsd（％）6＃平均值96.63.7111.1