可經(jīng)輸血傳播感染病原體核酸篩查技術(shù)要求

前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素 25核酸檢測試劑性能 36試劑批質(zhì)檢 47應(yīng)用常見問題 5附錄A（規(guī)范性附錄）分析靈敏度建立的基本方案 7參考文獻 9II前??言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2020給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)代替T/CSBT009—2019《可經(jīng)輸血傳播感染病原體核酸篩查技術(shù)要求》，與T/CSBT009—2019相比，除結(jié)果調(diào)整和編輯性改動外，主要技術(shù)變化如下：——更改了本標(biāo)準(zhǔn)的“轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增”、“檢出限”的名詞和英文縮寫（見3.2、3.5，2019年版的3.2、3.5）；——更改了5.2.2“內(nèi)源性干擾物質(zhì)驗證”（見5.2.2，2019年版的5.2.2）；——更改了6.2“實驗室試劑驗收”（見6.2，2019年版的6.2）；——更改了7.3.2“氣溶膠污染監(jiān)測”（見7.3.2，2019年版的7.3.2）；——更改了附錄A的方案名稱及內(nèi)容（見附錄A，2019年版的附錄A）；——更改了參考文獻中的“1、2、4”（見參考文獻1、2、4,2019年版的參考文獻1、2、4）。本標(biāo)準(zhǔn)由中國輸血協(xié)會輸血傳播疾病專業(yè)委員會提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京醫(yī)院、北京市紅十字血液中心、河北省血液中心、廣州血液中心、深圳市血液中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:王露楠、常樂、葛紅衛(wèi)、王素玲、鄭優(yōu)榮、曾勁峰、黃力勤、鄭欣?？山?jīng)輸血傳播感染病原體核酸篩查技術(shù)要求范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了可經(jīng)輸血傳播感染病原體核酸篩查技術(shù)的關(guān)鍵影響因素和性能驗證要求，包括核酸篩查試劑的性能要求以及應(yīng)用中常見問題分析。核酸篩查方法包含聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)與轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增（TMA）技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于核酸篩查試劑的驗證評價及日常檢測的質(zhì)量控制。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。EP17-A2EvaluationofDetectionCapabilityforClinicalLaboratoryMeasurementProcedures;ApprovedGuideline—SecondEdition術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。聚合酶鏈反應(yīng)polymerasechainreaction，PCR一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。在特異性核酸模板、引物、DNA聚合酶、dNTP等必要條件存在時，通過變性、退火、延伸不同溫度變化的重復(fù)循環(huán)，使模板片段擴增放大數(shù)百萬倍。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增transcription-mediatedamplification，TMA一種目的核酸的等溫擴增方法，使用RNA轉(zhuǎn)錄（RNA聚合酶）和DNA合成（反轉(zhuǎn)錄），按照目標(biāo)核酸序列產(chǎn)生RNA擴增子。RNA和DNA都可以使用TMA方法擴增。信噪比signal-to-noiseratio,SNRorS/N核酸檢測過程中，目的核酸的靶信號與背景噪音信號的比值。通常PCR反應(yīng)的信噪比在2-5:1時，可以將靶信號與背景信號區(qū)分開。分析靈敏度analyticalsensitivity檢測系統(tǒng)或方法可檢測的最低分析物濃度。在核酸檢測中，分析靈敏度常用檢出限（LoD）表示。檢出限limitofdetection，LOD樣本中可被檢測到的分析物的最低濃度。注1：也被稱為“最低檢出限”或“最小可檢O濃度（劑量或量值）”，有時也代表“分析靈敏度”；注2：分析物可被穩(wěn)定檢出（通常在常規(guī)實驗條件下，>=95%的樣本）的最低濃度。分析特異性analyticalspecificity在定性檢測中，分析特異性是指檢測方法檢測出特定核酸分子的能力。分析特異性通常取決于檢測系統(tǒng)的抗干擾能力。影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素核酸純化方法對核酸純化方法的評估應(yīng)考慮以下幾個因素：每一步驟試劑殘留對結(jié)果的影響，提取過程發(fā)生污染的風(fēng)險，提取反應(yīng)的體積，樣本混合過程的影響，樣本提取過程是否有分管提取最后合并的步驟，操作過程中溶液是否有氣泡產(chǎn)生（是否有表面活性劑），是否有高溫加熱步驟，設(shè)備移液的準(zhǔn)確性，移液步驟是否有滴液的現(xiàn)象。引物探針的設(shè)計和驗證因為引物的設(shè)計是產(chǎn)品研發(fā)過程的一個重要環(huán)節(jié)，上市后不能隨意變更，產(chǎn)品使用者只能對產(chǎn)品的引物和探針的設(shè)計是否合理進行驗證。對于PCR反應(yīng)體系，驗證主要參數(shù)包括擴增效率，常見亞型的檢出能力，檢出限時的信噪比。對于TMA反應(yīng)體系，驗證參數(shù)主要包括不同濃度的信噪比，常見亞型的檢出能力。反應(yīng)抑制物和干擾物核酸擴增的效率有賴于酶的活性和離子濃度等條件。影響核酸擴增檢測效率（包括逆轉(zhuǎn)錄效率）的因素包括內(nèi)源性的，即樣本本身有抑制物；同時也包括外源性的，例如采血管里的某些成分、純化過程中引入的鰲合劑、表面活性劑、有機溶劑等。此外樣本裂解純化方法設(shè)計不合理或操作不當(dāng)，也有可能造成在樣本提取過程中核酸的降解，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。內(nèi)源性抑制因素內(nèi)源性抑制物是指樣本本身含有的可以抑制核酸擴增過程中酶活性，降低擴增效率的物質(zhì)。在血液樣本中最常見的是血清或血漿中人基因組DNA、血紅素及其代謝產(chǎn)物，因此在啟用核酸檢測系統(tǒng)前，應(yīng)對不同溶血程度的溶血樣本對檢測的干擾進行評估。外源性抑制因素外源性抑制因素主要來自于兩個途徑：一是采血管；二是提取純化過程。采血管不能采用肝素作為抗凝劑，因為肝素是DNA聚合酶的抑制劑；但采用EDTA抗凝的采血管時，應(yīng)考慮到EDTA有鰲合反應(yīng)體系中的錳離子和鎂離子的作用，同時采血管可能還有其他干擾反應(yīng)的成分或采血管材料可能會對病原體有吸附作用，應(yīng)該在做檢測系統(tǒng)的確認(rèn)時，對采血管的適用性做出評估。純化過程有可能引入的包括試劑EDTA、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)、異硫氰酸胍和鹽酸胍以及一些有機溶劑，核酸純化如果不能有效去除這些溶劑，勢必影響擴增檢測效率。提取方法和操作因素有效的核酸提取純化方法應(yīng)該是使病毒充分裂解釋放出病毒核酸序列，同時又能保證該序列在后續(xù)步驟中不被降解或極少降解；最后得到純化核酸不應(yīng)含有內(nèi)源和外源性抑制物。檢測試劑適用設(shè)備對于使用開放設(shè)備的產(chǎn)品，對混樣和核酸純化的設(shè)備要進行抗污染能力驗證（即高濃度樣本和陰性樣本交錯放置），對熒光PCR儀要定期進行校準(zhǔn)，對可以使用不同型號熒光PCR儀的試劑，要對不同型號的熒光PCR儀的等效性進行評估（算法，通道干擾等因素）。對于封閉式設(shè)備，要定期對設(shè)備內(nèi)部關(guān)鍵部位進行污染監(jiān)測，也可定期做交叉污染驗證。檢測耗材對結(jié)果的影響耗材（吸頭，深孔板，PCR反應(yīng)板，封口膜等）對核酸篩查產(chǎn)品的結(jié)果重復(fù)性影響很大。使用非指定耗材，應(yīng)對耗材進行評估測試（靈敏度，重復(fù)性，抑制物，批間差），可由試劑生產(chǎn)廠家或耗材生產(chǎn)廠家提供評估報告或提供評估檢測方法（不能采用抽檢的方式來測試耗材）。核酸檢測試劑性能產(chǎn)品基本性能指標(biāo)產(chǎn)品基本性能指標(biāo)應(yīng)由產(chǎn)品生產(chǎn)方建立并驗證，將數(shù)據(jù)提供給使用方。應(yīng)驗證的指標(biāo)主要包括：分析靈敏度產(chǎn)品試劑盒說明書中或補充材料中應(yīng)提供基于國際標(biāo)準(zhǔn)品或國際標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)品進行的建立分析靈敏度的方案，包括陽性樣本的來源，濃度稀釋梯度的信息，以及最終的針對每個靶標(biāo)95%檢出最低檢出限（LOD95%）的均值及95%置信區(qū)間。建議選擇濃度梯度時應(yīng)參考EP17中的要求（附錄A）。基因型/亞型的分析靈敏度和檢出限試劑說明書中或補充材料中應(yīng)提供可覆蓋的基因型/亞型，并提供相應(yīng)的驗證數(shù)據(jù)（我國主要的病毒基因型/亞型，表1）。我國主要的HBV/HCV/HIV基因型/亞型HBVHCVHIV-1M組B1bCRF07_BCC2aCRF01_AEC/D3aCRF08_BCD3bB’6aB1aBC早期檢出能力試劑說明書中或補充材料中應(yīng)提供該產(chǎn)品基于血清轉(zhuǎn)換盤的針對早期感染檢出能力的評估。特異性1）潛在的交叉反應(yīng)性和干擾性微生物產(chǎn)品試劑盒說明書中或補充材料中應(yīng)提供可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)性的病原微生物（包括細菌，病毒等）清單以及驗證的結(jié)果。2）內(nèi)源性干擾物質(zhì)產(chǎn)品試劑盒說明書中或補充材料中應(yīng)提供內(nèi)源性干擾物質(zhì)驗證的數(shù)據(jù)，如過高水平的甘油三酯、血紅蛋白、非結(jié)合性膽紅素、白蛋白及人類基因組DNA等。3）外源性干擾物質(zhì)如果可能，產(chǎn)品試劑盒說明書中或補充材料宜提供外源性干擾物質(zhì)的驗證數(shù)據(jù)。例如血液中有可能出現(xiàn)的高濃度撲熱息痛、乙酰水楊酸、抗壞血酸、阿伐他汀、布洛芬、枸櫞酸鈉等。核酸檢測系統(tǒng)性能驗證血站血液檢測實驗室在將核酸檢測系統(tǒng)在投入常規(guī)使用前，應(yīng)對其性能進行驗證，以確定檢測系統(tǒng)安裝調(diào)試到位，確保在血站實驗室環(huán)境中運行的性能與廠家聲明的性能一致。分析靈敏度驗證用可溯源的質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)品進行驗證。驗證方案：選擇病毒濃度為3倍檢測試劑LOD濃度的樣本，在同一套檢測系統(tǒng)上，由同一個操作員每天進行不少于6個重復(fù)檢測，連續(xù)三天進行檢測，獲得不少于20個檢測結(jié)果。所有重復(fù)檢測結(jié)果均為反應(yīng)性，并滿足每一批試劑的質(zhì)量檢測報告、產(chǎn)品試劑盒說明書中或補充材料中有關(guān)3倍LOD的要求。內(nèi)源性干擾物質(zhì)驗證收集產(chǎn)品說明書聲稱的不存在內(nèi)源性干擾的相應(yīng)濃度的血漿樣本（如過高水平的甘油三酯、血紅蛋白、非結(jié)合性膽紅素）并在不加入HBV、HCV和HIV和加入HBV、HCV和HIV至濃度為每種病毒LOD的3倍的情況下，使用試劑進行檢測，檢測結(jié)果沒有顯著差異。重復(fù)性將陰性血漿和3倍最低檢出限濃度的HBV、HCV和HIV核酸陽性血漿各3份組成樣本盤，使用同一名操作人員在同一臺設(shè)備上，連續(xù)檢測5天，統(tǒng)計樣本的檢測情況。若實驗室有多臺設(shè)備的，可由不同的操作人員各在一臺設(shè)備上實驗，連續(xù)檢測5天，統(tǒng)計不同人員、不同設(shè)備下各濃度樣本的檢測情況。檢測結(jié)果應(yīng)均為反應(yīng)性，對信號值進行統(tǒng)計分析，其變異應(yīng)小于試劑批間變異。穩(wěn)定性驗證包括實時穩(wěn)定性，開瓶穩(wěn)定性，模擬日常檢測過程試劑測試穩(wěn)定性。開瓶有效期內(nèi)檢測性能和日常檢測過程中處于不同排序樣本的檢測性能應(yīng)與產(chǎn)品生產(chǎn)方聲稱的性能相符。檢測樣本量較大的實驗室應(yīng)采用檢出限濃度的樣本進行日常檢測可能的最大通量檢測，進行加樣穩(wěn)定性評估。穩(wěn)定性應(yīng)確保檢測通量最大時達到要求的分析靈敏度。試劑批質(zhì)檢試劑批質(zhì)量報告試劑生產(chǎn)廠商應(yīng)提供每一批試劑的質(zhì)量檢測報告，至少應(yīng)包括包裝規(guī)格，外觀狀況以及分析靈敏度驗證數(shù)據(jù)。其中分析靈敏度驗證數(shù)據(jù)至少應(yīng)包括0.5倍、1倍LOD驗證數(shù)據(jù)中的1個和2-3倍LOD的驗證數(shù)據(jù)。PCR檢測方法應(yīng)提供CT值的變異范圍，TMA方法應(yīng)提供S/CO值的比值變異范圍。實驗室試劑驗收實驗室應(yīng)根據(jù)實際情況，選擇適合的檢測試劑和檢測系統(tǒng)，除了試劑參數(shù)外，還要考慮場地環(huán)境、檢測量、人員、實驗室流程等因素。實驗室應(yīng)根據(jù)廠家說明書或補充材料中提供的技術(shù)參數(shù)來確認(rèn)驗收方法和流程。實驗室應(yīng)對每個運輸批次的試劑進行驗收。驗收內(nèi)容應(yīng)包括外觀包裝的完整性、生產(chǎn)日期、效期、運輸?shù)臏囟鹊?；還應(yīng)進行至少包括陰性樣本、陽性樣本、室內(nèi)質(zhì)控品在內(nèi)的檢測實驗。實驗室應(yīng)建立驗收標(biāo)準(zhǔn)，以確保試劑的有效使用。驗收的指標(biāo)還應(yīng)包括分析靈敏度以及室內(nèi)質(zhì)控檢測信號比值，信號比指標(biāo)變化應(yīng)控制在30%以內(nèi)或參考試劑生產(chǎn)廠商提供的技術(shù)參數(shù)。應(yīng)用常見問題結(jié)果分析對于封閉檢測體系，應(yīng)對內(nèi)標(biāo)和弱陽質(zhì)控品信號的變化進行監(jiān)測。如果是開放式體系，則要考慮軟件的設(shè)定對結(jié)果的影響，同時還要考慮到是否用參比熒光或者背景熒光作為參照，消除光路和耗材對結(jié)果的影響。假陽性產(chǎn)生的原因及處理措施假陽性結(jié)果主要有三方面原因1）樣本間的交叉污染陽性樣本、陽性對照和陽性質(zhì)控都有可能成為交叉污染的污染源。由于交叉污染經(jīng)常是偶然發(fā)生的事件，發(fā)生后很難被發(fā)現(xiàn)。2）擴增產(chǎn)物（擴增子）的污染擴增產(chǎn)物是很小的核酸片段，它們可以存在于空氣中，也可以附著在儀器或操作臺表面。3）非特異擴增檢測系統(tǒng)也可能會出現(xiàn)非特異的擴增，原因有可能是檢測體系本身的問題，如檢測系統(tǒng)不同熒光通道間的干擾，也可能是樣本中存在的干擾物質(zhì)造成。此外基線波動，當(dāng)信號超過閾值時也會出現(xiàn)非特異反應(yīng)性，原因包括反應(yīng)體系未充分混勻、熒光探針質(zhì)量等。假陽性結(jié)果解決措施樣本交叉污染應(yīng)重新審核檢測過程。措施應(yīng)包括對開蓋、樣本匯集、加樣、核酸純化等環(huán)節(jié)進行交叉污染風(fēng)險評估；在操作要求中應(yīng)該有避免上述污染產(chǎn)生的措施，包括陽性對照開蓋后應(yīng)更換手套、使用帶濾芯的吸頭等。發(fā)生擴增產(chǎn)物污染，應(yīng)對污染區(qū)域用含氯消毒液進行徹底消毒，連續(xù)做三次沉降和擦拭測試均合格后，方可以繼續(xù)進行檢測。對于非特異擴增應(yīng)分析來源，即樣本、試劑、設(shè)備等，然后采取相應(yīng)的解決措施。污染監(jiān)測方法樣本交叉污染監(jiān)測棉簽沾去離子水（無RNA酶和DNA酶）分別擦拭生物安全柜外延左、中、右及中央4個位置、樣本架隨機位置4個，開蓋機接觸采血管部位、樣本處理區(qū)冰箱門等，將棉簽浸泡于2mL陰性漿3min，旋渦震蕩混勻后進行核酸檢測。確定出現(xiàn)樣本污染，暫停相關(guān)實驗，對實驗室進行清潔。清潔完成后，重復(fù)上述監(jiān)測步驟，直至實驗結(jié)果均呈陰性。氣溶膠污染監(jiān)測將裝有陰性血漿或去離子水（無RNA酶和DNA酶）的離心管敞口放置于試劑準(zhǔn)備區(qū)臺面、生物安全柜（開風(fēng)機）內(nèi)、樣本處理區(qū)實驗臺面、核酸提取設(shè)備內(nèi)部、核酸擴增儀放置的臺面等處。放置離心管包括兩種方式，一是在核酸檢測過程中放置，即動態(tài)放置，一般放置6-8小時；二是靜態(tài)放置，即非檢測時間放置，一般不少于16個小時。將放置后的離心管旋渦震蕩混勻后進行核酸檢測。確認(rèn)出現(xiàn)氣溶膠污染時，暫停相關(guān)實驗，對實驗室進行清潔和/或通風(fēng)。重復(fù)上述監(jiān)測實驗，直至實驗結(jié)果呈陰性。

（規(guī)范性附錄）

分析靈敏度建立和驗證的基本方案根據(jù)EP17的建議，產(chǎn)品生產(chǎn)方建立分析靈敏度的實驗方案至少應(yīng)包括：1）2個批號試劑；2）1套檢測系統(tǒng)；3）預(yù)期LOD值附近的4個低濃度水平樣本(0.25倍LOD,0.5倍LOD,1倍LOD,2倍LOD,4倍LOD中的至少4個)4）實驗應(yīng)至少在不同的3天進行；5）樣本在每套檢測系統(tǒng)中，每天使用每個批號的試劑重復(fù)檢測2次；6）最終整個實驗應(yīng)獲得至少20個分析靈敏度水平的重復(fù)值。評估時也可評估影響實驗結(jié)果的因素后，在基本實驗方案的基礎(chǔ)上，增加更多的潛在影響因素（如操作人員、試劑開瓶時間、儀器維護等），以增加重復(fù)檢測次數(shù)，獲得更多的檢測結(jié)果，建立客觀的性能驗證方案，準(zhǔn)確進行分析靈敏度驗證。實驗結(jié)果可通過計算的檢出率來判斷性能驗證是否通過。檢出率，即檢出結(jié)果與預(yù)計結(jié)果一致的樣本個數(shù)占總樣本數(shù)的比值。檢出率應(yīng)達到相應(yīng)水平的臨界值。檢出率的臨界值與重復(fù)檢測次數(shù)密切相關(guān)。通常，隨著實驗次數(shù)的增加，檢出率臨界值呈上升趨勢。CLSI推薦的當(dāng)采用分析靈敏度及LOD95%濃度的樣本進行重復(fù)檢測時，檢出率臨界值與重復(fù)檢測次數(shù)關(guān)系見表A.1。如果實驗測得檢出率低于表中相應(yīng)的臨界值，即可判斷性能驗證失敗，需要及時分析、查找影響結(jié)果的因素。檢出率臨界值與重復(fù)檢測次數(shù)關(guān)系實驗檢測次數(shù)檢出比臨界值2085%3087%4088%5088%6090%7090%8090%9091%10091%15092%20092%25092%30093%40093%50093%100094%血液檢測實驗室也可以根據(jù)自身情況，增加更多的評估因素，以獲得更多的檢測結(jié)果，最后通過Probit分析，建立實驗室核酸檢測體系常規(guī)使用情況下的LOD和95%置信區(qū)間。參考文獻[1]中華人民共和國衛(wèi)生和計劃生育委員會.《血站技術(shù)操作規(guī)程（2019版）》.2019年4月.[2]CLSI.MolecularDiagnosticMethodsforInfecti