實(shí)驗(yàn)五、簡(jiǎn)單染色與革蘭氏染色教學(xué)材料

實(shí)驗(yàn)五

簡(jiǎn)單染色與革蘭氏染色

一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的操作技術(shù)；2、掌握細(xì)菌單染色和革蘭氏染色的方法；3、初步掌握無(wú)菌操作技術(shù)；4、掌握革蘭氏染色反應(yīng)原理、操作步驟和意義。二實(shí)驗(yàn)原理——簡(jiǎn)單染色常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，這是因?yàn)樵谥行浴A性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，在顯微鏡下更易于識(shí)別。常用作簡(jiǎn)單染色的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。當(dāng)細(xì)菌分解糖類(lèi)產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，此時(shí)可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。

革蘭氏染色法所以能將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性，是由這兩類(lèi)細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類(lèi)脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類(lèi)脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類(lèi)脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來(lái)，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。二實(shí)驗(yàn)原理——革蘭氏染色四實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單染色制片→染色→水洗→干燥→鏡檢（1）制片：取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、自然干燥、加熱固定；（2）染色：將固定過(guò)的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復(fù)紅染色1-2min。（3）水洗：用水洗去涂片上的染色液。（4）干燥：將洗過(guò)的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。（5）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅瑢⒏弑剁R轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。注意無(wú)菌操作制片→初染（結(jié)晶紫1min）→水洗→媒染（碘液1min）→水洗→脫色（乙醇20-30s）→水洗→復(fù)染（番紅2min）→水洗→干燥→觀察

革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)完畢后的處理①將浸過(guò)油的鏡頭按下述方法擦拭干凈：a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許乙醚-乙醇混合液將鏡頭擦2-3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。將顯微鏡小心輕拿，按號(hào)放入顯微鏡柜中。②觀察后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈，放入回收容器內(nèi)。五注意事項(xiàng)1、載玻片要潔凈無(wú)油跡。涂片時(shí)，滴水不要過(guò)多，挑菌量宜少，涂片要均勻，菌膜宜薄。2、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。3、染色過(guò)程中勿使染色液干涸。4、選用幼齡的細(xì)菌。5、用接種環(huán)將菌體與染液混合時(shí)不要?jiǎng)×彝磕?，以免破壞?xì)胞；6、滴加染液要適中，否則用蓋玻片覆蓋時(shí)，染液過(guò)多會(huì)溢出，過(guò)少會(huì)產(chǎn)生大量氣泡；7、蓋玻片要緩慢傾斜覆蓋，以免產(chǎn)生氣泡。六思考1、簡(jiǎn)單染色和