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DB33DB33/T783—2010脫毒芋艿種芋（苗）病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程Rulesforvirusdetectionofvirus-freeseed(seedling)taros2010-04-07發(fā)布2010-05-07實(shí)施浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布1NY/T401-2000脫毒馬鈴薯種薯（苗）病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T402-2000脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程24檢測(cè)對(duì)象脫毒核心種苗、擴(kuò)繁脫毒苗和脫毒原原種芋脫毒率：100%。脫毒原種芋脫毒率：≥98%。生產(chǎn)用用于檢驗(yàn)芋花葉病毒（DsMV檢測(cè)方法按附錄A執(zhí)行。用于檢驗(yàn)芋花葉病毒（DsMV）和黃瓜花葉病毒（CMV檢測(cè)方法按附錄B執(zhí)行。采用芋花葉病毒（DsMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）商品檢測(cè)試劑盒，進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè)，檢測(cè)方法按NY/T401-2000中附錄1hm2取樣500株；≥1hm2，劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本規(guī)程規(guī)定的面積取樣。每株取葉片1g～5g，4℃冰球莖膨大期，采用隨機(jī)取樣法，抽樣方法按NY/T402-2000的4.2.2磷鎢酸2g用雙蒸餾水定容至100mL，1mol/L的NaOH調(diào)取新鮮葉片1g～5g，加雙蒸餾水充分研磨，獲得組織汁液。銅網(wǎng)經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染色1min后，吸去多余染色液，銅網(wǎng)置于透射電鏡下觀察，芋花葉病毒（DsMV）為馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）成員，病毒粒子22%四氧化鋨水溶液5mL充分搖動(dòng)10min，靜置1d～2d，使未溶解部分自然沉淀，取上清液使用。溶液呈鮮黃色用2.5%戊二醛固定液于4℃冰箱中固定1h～2h，經(jīng)0.1mo溫下用1%的四氧化鋨固定液固定1h～2h。100%的乙醇梯度脫水各15min（4℃);室溫下丙酮置換2次，各30min。用Spurr低粘度環(huán)氧樹脂進(jìn)行滲透和包埋，分別用包埋劑：丙酮=1：1滲透1h，包埋劑：丙酮=1：3滲透3h后，置換新管，純包埋劑滲透過夜。用純包埋劑包埋后70℃聚合8h。包埋好的樣品修塊后，在超薄切片機(jī)上切成7超薄切片分別經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色液各4原
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