實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作步驟以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考：

1樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

②兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2RNA質(zhì)量檢測(cè)

1）紫外吸收法測(cè)定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液濃度和純度。

①濃度測(cè)定

A260下讀值為1表示40μgRNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40μg/ml。具體計(jì)算如下：

RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測(cè)得A260=0.21

RNA濃度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl

取5ul用來測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35μl，剩余RNA總量為：

35μl×0.84μg/μl=29.4μg

②純度檢測(cè)

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

2）變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定

①制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10ml的10×MOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度??成分

0.4M??MOPS，pH7.0

0.1M??乙酸鈉

0.01M??EDTA

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

②準(zhǔn)備RNA樣品

取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。

④紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。

3樣品cDNA合成

①反應(yīng)體系

序號(hào)??反應(yīng)物??劑量

1??逆轉(zhuǎn)錄buffer??2μl

2??上游引物??0.2μl

3??下游引物??0.2μl

4??dNTP??0.1μl

5??逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV??0.5μl

6??DEPC水??5μl

7??RNA模版??2μl

8??總體積??10μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

4梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因（β-actin）實(shí)時(shí)定量PCR

①β-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

②反應(yīng)體系如下：

標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

序號(hào)??反應(yīng)物??劑量

1??SYBRGreen1染料??10μl

2??陽(yáng)性模板上游引物F??0.5μl

3??陽(yáng)性模板下游引物R??0.5μl

4??dNTP??0.5μl

5??Taq酶??1μl

6??陽(yáng)性模板DNA??5μl

7??ddH2O??32.5μl

8??總體積??50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

管家基因反應(yīng)體系：

序號(hào)??反應(yīng)物??劑量

1??SYBRGreen1染料??10μl

2??內(nèi)參照上游引物F??0.5μl

3??內(nèi)參照下游引物R??0.5μl

4??dNTP??0.5μl

5??Taq酶??1μl

6??待測(cè)樣品cDNA??5μl

7??ddH2O??32.5μl

8??總體積??50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

③制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃2分鐘，然后93℃1分鐘，55℃2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。

5制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板

①針對(duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

反應(yīng)體系：

序號(hào)??反應(yīng)物??劑量

1??10×PCR緩沖液??2.5ul

2??MgCl2溶液??1.5ul

3??上游引物F??0.5ul

4??下游引物R??0.5ul

5??dNTP混合液??3ul

6??Taq聚合酶??1ul

7??cDNA??1ul

8??加水至總體積為??25ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個(gè)PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）；72oC延伸5分鐘。

②PCR產(chǎn)物與DNALadder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

③將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋:將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋:設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。

6待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR

①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系。

體系配置如下：

序號(hào)??反應(yīng)物??劑量

1??SYBRGreen1染料??10ul

2??上游引物??1ul

3??下游引物??1ul

4??dNTP??1ul

5??Taq聚合酶??2ul

6??待測(cè)樣品cDNA??5ul

7??ddH2O??30ul

8??總體積??50ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于RealtimePCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。

7實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表

引物設(shè)計(jì)軟件：PrimerPremier5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。

8電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與DNALadder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView?染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。實(shí)時(shí)熒光定量PCR組織RNA提?。阂话阏J(rèn)為100mg肝組織提取RNA500ng，100mg肺提取RNA200ng，腦內(nèi)的RNA豐度適中，100mg腦組織，提取RNA5-200ng。所以一個(gè)10mg的海馬可勻出RNA約為20ng。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照TaKaRaRT-PCR說明書。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下。37°C15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85°C5sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）RealTimePCR反應(yīng)選用腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）為目標(biāo)基因，核糖體18SrRNA(18SrRNA)做為內(nèi)參。基因引物序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度NR2BNR2B(+)CCGCAGCACTATTGAGAACA213bpNR2B(–)ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18srRNA18srRNA(+)tttgttggttttcggaactga198bp18srRNA(–)cgtttatggtcggaactacga1）按下列組份配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行）。試劑使用量終濃度SYBR?PremixExTaqTM（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）1μl0.4μMPCRReversePrimer（10μM）1μl0.4μM模板（cDNA溶液）0.5μldH2O10μlTotal25μl全班40人，分為5組，每組做8管。4管做BDNF，4管做18SrRNA。4管BDNF或者18SrRNA，采用相應(yīng)的正反PCR引物。每種基因做兩個(gè)模板，一個(gè)模板采用原液濃度，一個(gè)模板采用稀釋一倍濃度，體積均為0.5μl。2）三步法PCR首先95°C作用3min。PCR進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。步驟溫度時(shí)間變性95°C30秒退火58°C30秒延伸72°C30秒融解曲線溫度時(shí)間變溫速度95°C0秒20°C/秒55°C15秒20°C/秒95°C0秒0.1°C/秒PCR疑難解答當(dāng)PCR結(jié)果不甚滿意時(shí)，首先檢查以下幾方面并遵照?qǐng)?zhí)行：?

1將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。?

2當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動(dòng)”開始循環(huán)時(shí)，切記在加入酶后稍3微振蕩一下，因?yàn)樵?.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。?

4不要隨意減少dNTP的用量，它是一個(gè)系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。?

5對(duì)于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。?

沒有擴(kuò)增產(chǎn)物：?

1在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無(wú)MgCl2的緩沖液以0.5mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。?

2泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。?

3檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。?

4檢查模板和引物的用量。?

5增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。?

泳道中出現(xiàn)模糊條帶：?

1減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。?

2提高退火溫度，但不要超過68℃。?

3重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長(zhǎng)的引物。?

其他值得注意的條件：?

1建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時(shí)不能有效地使模板變性。?

2最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對(duì)蓋子加熱的PCR儀可以不加）。?

3大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。?

4建議使用1.75mmol/LMgCl2∶350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2∶500mmol/LdNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。?

5基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)DNA的長(zhǎng)度。DNA片段長(zhǎng)度可以超過50kb，傳統(tǒng)的HYPERLINK基因組DNA能擴(kuò)增片段至10kb。?

6要擴(kuò)增更長(zhǎng)的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請(qǐng)查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻(xiàn)。?

7降低二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增時(shí)，引物長(zhǎng)度一般為24~34個(gè)核苷酸，溶點(diǎn)在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長(zhǎng)片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。?

8變性：第一步變性在94℃下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時(shí)間（94℃下進(jìn)行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對(duì)于所需擴(kuò)增的HYPERLINK基因組DNA片段終長(zhǎng)度超過12kb時(shí)，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。?

9延伸：68--72℃下進(jìn)行延伸操作。?

10循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無(wú)此功能，則必須增加延伸的時(shí)間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時(shí)，延伸時(shí)間用10分鐘替代原來的8分鐘。?

11長(zhǎng)片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3’-末端帶有一個(gè)突出的A，因此建議采用T/AHYPERLINK克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。?

12測(cè)序時(shí)因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進(jìn)行測(cè)序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。?13在無(wú)菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣：

14反應(yīng)物加樣順序體積(μl)終濃度

去離子水129.4

10×BufferB251×10×PCR?Buffer成分：Tris-HClpH8.5100mMKCl500mMMgCl15mM

4×dNTP混合物35各200μmol/L?

MgCl2?431.5mmol/L

有義引物52.60.25μmol/L

反義引物62.60.25μmol/L

模板720.1μg

TaqDNA聚合酶80.41unit

2.??用微量可調(diào)加樣器和一次性Tip向每一管中加50μl礦物油。每加一管換一次Tip。

3.??振蕩每只管，然后短暫離心。

4.??將管放到預(yù)熱的熱循環(huán)中，按下列程序開始循環(huán)：

預(yù)變性94℃4分鐘1次

變性94℃1分鐘

退火37-65℃1分鐘

延伸72℃1分鐘

循環(huán)30次

終延伸72℃7分鐘1次

保存4℃?討論1.假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有Taq酶抑制劑，②在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。③模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，有可能是模板核酸提取過程出了毛病，可使用陽(yáng)性對(duì)照的DNA模板配合檢查模板質(zhì)量。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率，退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

2.假陽(yáng)性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)HYPERLINK基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

3.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

4.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。?PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺(tái)期的到來是不可避免的。

??PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。基因表達(dá)譜基因表達(dá)譜(geneexpressionprofile)：指通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫(kù),大規(guī)模cDNA測(cè)序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群體組成,從而描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息,這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因表達(dá)譜基因表達(dá)譜的獲得與表示在基因芯片的實(shí)驗(yàn)中，首先選取來自不同狀態(tài)的樣本，如正常組織與腫瘤組織、不同發(fā)育階段組織，或用藥前后的細(xì)胞或組織等。其中一種被稱為實(shí)驗(yàn)樣本，另一種就是相應(yīng)地被稱為參考樣本。實(shí)驗(yàn)樣本和參考樣本mRNA在逆轉(zhuǎn)錄過程中，分別用不同的紅、綠熒光基團(tuán)標(biāo)記，并將它們混合，與微陣列上的探針序列進(jìn)行雜交，經(jīng)過適當(dāng)?shù)南疵摬襟E后，用激光掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，獲得對(duì)應(yīng)于每種熒光的熒光強(qiáng)度圖像，通過專用的圖像分析軟件，可獲得微陣列上每個(gè)點(diǎn)的紅、綠熒光強(qiáng)度（Cy5和Cy3），其比值（Cy5/Cy3）稱為該基因在實(shí)驗(yàn)樣本中的表達(dá)水平。Step1：基因芯片的制備。在硅膠、玻璃片、聚丙烯或尼龍膜等載體上按特定的排列方式固定大量的探針，形成DNA芯片。芯片種類較多，制備方法也不盡相同，基本上可以分為兩大類：原位合成和直接點(diǎn)樣法。Step2：熒光標(biāo)記探針的制備。將待分析的基因探針在芯片雜交之前進(jìn)行純化、逆轉(zhuǎn)錄或擴(kuò)增級(jí)熒光標(biāo)記。最普遍的熒光標(biāo)記法是用Cye3-dUTP(綠色熒光)標(biāo)記對(duì)照樣本，Cye5-dUTP(紅色熒光)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)室樣本。Step3：標(biāo)記探針與芯片雜交。選擇雜交條件，將制備的熒光探針與芯片進(jìn)行雜交，一定時(shí)間以后，洗去未結(jié)合探針，然后進(jìn)行熒光信號(hào)的掃描與分析。Step4：雜交芯片的掃描。雜交后的芯片用特定波長(zhǎng)的激光進(jìn)行激發(fā)，此時(shí)芯片上的探針會(huì)發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光。用共聚焦激光掃描儀檢測(cè)探針的熒光強(qiáng)度，可以得到Cy5和Cy3的兩幅單色圖像。分別對(duì)這兩幅圖像進(jìn)行偽色彩處理，然后疊加稱為一幅圖像，這就是實(shí)驗(yàn)所得到的原始數(shù)據(jù)——雜交圖像。圖像中樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度值間接給出了基因芯片中對(duì)應(yīng)探針的相對(duì)豐度值。如果來自測(cè)試樣本的表達(dá)豐度高，那么樣點(diǎn)呈紅色；如果來自參考細(xì)胞樣本的表達(dá)豐度高，那么樣點(diǎn)呈綠色；如果兩者豐度相當(dāng)，樣點(diǎn)就呈黃色；如果二者沒有進(jìn)行雜交反應(yīng)，則樣點(diǎn)保持背景黑色不變。通過這種方法，取自兩個(gè)不同樣本的基因相對(duì)表達(dá)水平差異就可以表現(xiàn)出來。Step5：將基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)從雜交圖像中提取出來，即將原始雜交圖像轉(zhuǎn)化為基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。研究意義腫瘤在組織形態(tài)學(xué)上被劃分為多種不同的類型和亞型，而腫瘤亞型的準(zhǔn)確診斷對(duì)腫瘤的臨床治療具有重要意義，然而腫瘤的分型在臨床上一直處于難以處理的狀態(tài)，許多形態(tài)學(xué)上相似的腫瘤，如白血病的許多亞型等都會(huì)有相似的臨床癥狀，但卻需要不同的治療方法，從分子生物學(xué)的角度上看，腫瘤是由于某些染色體上DNA損傷致使細(xì)胞內(nèi)基因異常表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控、缺乏分化和異常增生的一類復(fù)雜基因疾病。正因?yàn)槟[瘤發(fā)展機(jī)制的復(fù)雜性，100多年來的研究仍未揭開其中的奧秘。研究腫瘤基因表達(dá)譜、選取信息基因是從信息學(xué)角度出發(fā)以尋找腫瘤相關(guān)基因、發(fā)現(xiàn)腫瘤基因表達(dá)特征的直接手段。腫瘤基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯著特點(diǎn)是樣本的位數(shù)高而樣本很小、噪聲冗余大而信息基因少。每個(gè)樣本都記錄了組織細(xì)胞中所有可測(cè)基因的表達(dá)水平，但實(shí)際上只有少數(shù)基因才真正同樣本類別相關(guān)，它包含了樣本分類的信息。信息基因選取問題是腫瘤基因表達(dá)譜分析的核心內(nèi)容。它既是建立有效分類模型的關(guān)鍵，也是發(fā)現(xiàn)腫瘤分類與分型的基因標(biāo)記物以及藥物治療潛在靶點(diǎn)的重要手段，目前人們對(duì)該問題已進(jìn)行了一定程度的探索。然而，如何在基因表達(dá)譜的成千上萬(wàn)個(gè)基因中有效選出樣本的分類特征，一直是腫瘤基因表達(dá)譜分析中的難點(diǎn)所在，這個(gè)問題仍有待深入研究。當(dāng)前的腫瘤分類技術(shù)高度依賴病理學(xué)工作者對(duì)腫瘤組織的主觀判斷，而基于微陣列技術(shù)，即使一些組織沒有顯著變化，利用基因表達(dá)譜也能夠?qū)χ龀鲈缙谠\斷；基于基于基因表達(dá)譜的腫瘤分型和分類研究為理解腫瘤的發(fā)生的機(jī)制，以及腫瘤的臨床治療提供了重要依據(jù)；研究人員可以根據(jù)基因表達(dá)譜的變化來區(qū)分形態(tài)學(xué)上相似的腫瘤，而腫瘤類型的精確診斷將有助于制定配套的最佳治療方案。表達(dá)譜基因芯片實(shí)驗(yàn)操作流程一、試劑1.TRIzol2.異丙醇3.氯仿4.75%乙醇（RNase-free）5.Milli-Q水（RNase-free）6.無(wú)水乙醇7.dNTPs8.Cy5-dCTP和Cy3-dCTP9.雜交試劑110.標(biāo)記試劑I11.雜交試劑212.標(biāo)記試劑II13.反轉(zhuǎn)錄酶14.標(biāo)記試劑III15.反轉(zhuǎn)錄引物16.洗片試劑117.反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液18.洗片試劑219.DTT20.洗片試劑3*試劑7～20為產(chǎn)品芯片雜交試劑盒中的組分。二、儀器與設(shè)備1.電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)2.電子天平3.低溫高速離心機(jī)4.低溫高速臺(tái)式離心機(jī)5.超凈工作臺(tái)6.制冰機(jī)7.電熱恒溫水槽8.電泳槽9.電泳儀10.微波爐11.凝膠成像儀12.臺(tái)式離心機(jī)13.核酸定量分析儀14.移液槍15.可調(diào)電爐16.旋渦混合器17.雜交箱18.雜交艙19.S-200純化柱20.真空濃縮儀21.蓋玻片22.芯片掃描儀三、總RNA提取1)將超低溫保存的樣品除去樣品袋，在電子天平上稱重后，轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的碾缽中，用杵子碾磨組織，其間不斷加入液氮，直至碾磨成粉末狀。2)將碾磨成粉末狀的樣品，轉(zhuǎn)移至已經(jīng)加入適量TRIzol試劑的勻漿管中，把勻漿管置于冰浴中，在組織勻漿粉碎機(jī)上進(jìn)行勻漿。勻漿至勻漿液不粘且無(wú)顆粒即可。3)將勻漿液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，于4℃，12000g，離心10min。4)小心吸取上清液轉(zhuǎn)入新的15ml離心管，在15～30℃放置5min。5)向勻漿液中加入氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管，在15～30℃放置3min。6)于4℃，12000g，離心15min。7)從離心機(jī)中小心地取出離心管，吸取上清至另一15ml離心管。8)向上清加入異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，在15～30℃放置10min。9)于4℃，12000g，離心10min。10)棄去上清，緩慢地沿管壁加入75%乙醇5ml，輕輕顛倒洗滌離心管管壁，小心棄去乙醇。11)再加入75%乙醇10ml，在渦旋器上短暫渦旋；于4℃，8000g離心10min。12)小心棄上清，短暫離心，用移液槍吸去所有上清，在超凈工作臺(tái)中干燥沉淀5min。13)加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃保存。四、探針標(biāo)記與雜交1、預(yù)雜交1)配制預(yù)雜交液：雜交試劑1加入到的Eppenderf管中，振蕩混勻后，加入雜交試劑2混勻。2)將配制好的預(yù)雜交液放入95℃水浴鍋內(nèi)變性2min，將待預(yù)雜交的玻片放入95℃水浴鍋內(nèi)變性30sec，玻片取出后即放入無(wú)水乙醇中30sec，晾干。3)將已變性的預(yù)雜交液加到玻片的點(diǎn)樣區(qū)域內(nèi)，蓋上蓋玻片，放入雜交箱內(nèi)42℃預(yù)雜交5～6hr。2、標(biāo)記探針（以下在冰浴中進(jìn)行）1)于一已滅菌的1.5mlEppendorf管內(nèi)依次加入以下試劑（反應(yīng)終體積為50μl，以下試劑均為RNase-free）：ddH2O23μl逆轉(zhuǎn)錄引物5μl總RNA50～100μg振蕩混勻，置于70℃水浴10min。取出后，迅速置于冰上。2)分別加入以下試劑：逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液10μlDTT5μldNTPs4μl3)而后在暗室中加入以下試劑：逆轉(zhuǎn)錄酶2μlCy5-dCTP或Cy3-dCTP3μl4)用手指彈打管壁以混勻樣品，手浴2min。將Eppendorf管置于42℃水浴2hr。5)依次在Eppendorf管中加入標(biāo)記試劑I4μl，65℃水浴10min后加入標(biāo)記試劑II4μl?；靹颍喜?duì)照組、實(shí)驗(yàn)組。避光，真空抽干至50μl左右。6)使用DNA純化柱（或乙醇沉淀）純化DNA。7)將柱體在旋渦混合器上劇烈振蕩搖勻，懸浮內(nèi)溶的樹脂。將柱頂端的小帽旋松四分之一圈，掰斷柱下端的密封頭。8)將柱置于一個(gè)1.5ml的Eppendorf管中，以3000rpm離心1min將柱置于另一個(gè)新的1.5mlEppendorf管中，去掉頂端的帽，將樣品慢慢加到樹脂上表面的中間，注意不要攪動(dòng)柱體。以3000rpm離心2min，經(jīng)純化的樣品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。9)加入標(biāo)記試劑III8μl，真空抽干。3、雜交1)在抽干的探針管中加6.5μl雜交試劑I，充分混勻，使探針溶解。再加入6.5μl雜交試劑II，混勻備用。2)將預(yù)雜交的玻片取出，用ddH2O沖去蓋玻片。3)將探針置于95℃水浴中變性2min；玻片置于95℃水浴中變性30sec，玻片取出浸無(wú)水乙醇30sec，探針取出后迅速置于冰上。4)將探針置于芯片上，用蓋玻片覆蓋，置于雜交艙中，用Parafilm密封，放入42℃雜交箱內(nèi)雜交過夜（16～18h）。4、洗片1)用0.5%的洗滌液1沖洗玻片，去除蓋玻片。2)準(zhǔn)備兩個(gè)染色缸，分別裝有0.5%的洗片試劑1+2%的洗片試劑2、5%的洗片試劑3，放入60℃水浴鍋中。3)將玻片依次浸入以上兩個(gè)染色缸中洗滌10min。4)用0.5%的洗滌液1沖洗玻片，晾干后掃描?；蛐酒夹g(shù)原理及其在表達(dá)譜中的應(yīng)用摘要：基因芯片（Genechip），又稱DNA