DB33T 2287-2020 羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1 檢測(cè)規(guī)程　

DB33羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1檢測(cè)規(guī)程DetectionprotocolsforMacrobrachiumrosenbergiidicistrovirus-1浙江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：潘曉藝、沈錦玉、藺凌云、姚嘉本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意如下事實(shí)，聲明符合本標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可能涉及到6.10-6.11中引物與《羅氏1羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1檢測(cè)規(guī)程子病毒-1檢測(cè)程序的構(gòu)成、試劑和材料、器材與設(shè)備、操作步驟和結(jié)本標(biāo)準(zhǔn)適用于羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1的檢測(cè)及關(guān)聯(lián)疾病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和監(jiān)GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格SC/T7103水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采SC/T7202.1斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒病診斷規(guī)程第1部分：壓片顯羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1Macrobrtaihuvirus，MrTV），屬于小R30nm的二十面體球形顆粒，核酸類型為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約10.3kb。其主要侵染羅氏沼蝦幼體甲殼下上皮組織和神經(jīng)節(jié)，造成肝臟和結(jié)締組織出現(xiàn)強(qiáng)嗜堿性細(xì)胞質(zhì)包涵體。4縮略語(yǔ)DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacidNTP：脫氧核苷三磷酸（DeoxyribonucleosidetDB33/T2287—2020dTTP:脫氧胸苷三磷酸(Deoxythymidinetriphosphate)M-MLV:莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavi1樣品的準(zhǔn)備(見(jiàn)8.1)1樣品的準(zhǔn)備(見(jiàn)8.1)2RNA模板的提取(見(jiàn)8.2)3.1cDNA合成(見(jiàn)8.3.1)4瓊脂糖電泳(見(jiàn)8.4)(見(jiàn)9.1)4實(shí)驗(yàn)有效(見(jiàn)9.1)3.3第二輪PCR擴(kuò)增(見(jiàn)8.3.3)3.2第一輪PCR擴(kuò)增(見(jiàn)8.3.2)4結(jié)果判定(見(jiàn)9)236.3RNA酶抑制劑：40U/L20℃保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。6.4M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶：200U/L20℃保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。6.7TaqDNA聚合酶：5U/L20℃保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。6.8DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：DNAMarkerDL200020℃保存。6.12陽(yáng)性對(duì)照為已知受MrTV感染且RT-PCR結(jié)果顯示強(qiáng)陽(yáng)性的蝦組6.13陰性對(duì)照為已知未受MrTV感染且RT-PCR結(jié)果顯示陰性的蝦組織87.5低溫高速離心機(jī)：溫度可設(shè)置范圍0℃~40℃,最高可設(shè)定轉(zhuǎn)速≥15000轉(zhuǎn)/分鐘。4鮮活幼體、仔蝦及體長(zhǎng)在3cm以下稚蝦個(gè)體樣品約30mg～50mg(去掉稚蝦眼)；成蝦取約30mg~），8.3RT-PCR操作對(duì)每一份樣品，在一支無(wú)RNA酶的0.2mLPCR管中，加入1.5L10M引物MrTV572R1，2.5L無(wú) L5×M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、1LRNasin(40U/L)、0.5L10mmol/LdNTPs、0.5LM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/L)，42℃保溫1小時(shí)，以合成cDNA，然后于80對(duì)每一份樣品，取一支無(wú)RNA酶的0.2mLPCR管，加入2.5L10×PCR緩沖液、0.5L10mmol/L18.5L無(wú)RNA酶水和2L8.3.1步驟的逆轉(zhuǎn)0.5L10M引物MrTV472F2、0.5L10M引物MrTV472R2、1LTaqDNA聚合酶(5U/L)、41.0L無(wú)RNA酶水，最后加入1L8.3.2步驟的擴(kuò)增產(chǎn)物5用1×電泳緩沖液（1×電泳緩沖液的配制按附錄A中A.3進(jìn)行）配制2%的瓊脂糖凝膠（含0.5g/mL緩沖液剛好淹沒(méi)膠面，將5LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和1L6×載樣緩沖液（6×載樣緩沖液配制按附錄A中A.5進(jìn)行）混勻后加入樣品孔，在電泳時(shí)設(shè)立DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。5V/cm電泳約0.5小時(shí)，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部9結(jié)果判定照在572bp處無(wú)任何條帶，以無(wú)RNA酶水為模板設(shè)立的空白對(duì)照無(wú)任何條帶第二輪PCR擴(kuò)增：陽(yáng)性對(duì)照在472bp處會(huì)有特定條帶出現(xiàn)；陽(yáng)性樣品在在472bp處無(wú)任何條帶，以無(wú)RNA酶水為模板設(shè)立的空白對(duì)照無(wú)任何條帶出3．逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成份抑制PCR。陰性對(duì)照組或空白對(duì)照組在第一二次PCR擴(kuò)增后在472bp處有條帶出62.檢查逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑，重新合成性對(duì)照和樣品出現(xiàn)較多雜帶或明顯的1．未注意低溫操作，使PCR出現(xiàn)非特2．酶活性變化、dNTPs濃度變化或107試劑配制方法在無(wú)RNA酶的玻璃量筒中配制，混勻，按1.0mL/支分裝于無(wú)RNA酶的1.5mL微量離心管中，保存于-20℃待用。A.2無(wú)RNA酶的水蓋上瓶塞，用磁力攪拌器于37℃劇烈攪拌12小時(shí)，按50mL/瓶～200mL/瓶分裝于無(wú)瓶?jī)?nèi)，透氣高壓蒸汽滅菌15分鐘，冷卻A.31×電泳緩沖液Tris4.A.56×載樣緩沖液8外源性的RNA酶污染是指來(lái)自于水、玻璃制品、塑料器皿、電泳槽、操作人員和微生物等?？赏ㄟ^(guò)DEPC、氯仿、干熱烘烤等方法來(lái)消除。本附錄主高壓蒸汽滅菌15分鐘。不能用DEPC處理的試劑(如含有Tris的溶液)或者不能經(jīng)高壓蒸汽滅菌的試劑，應(yīng)使用經(jīng)DEPC處理的水配制，然后經(jīng)無(wú)RNA酶的0.22m微孔濾膜過(guò)濾除菌。玻璃器皿洗凈后，在180℃烘烤4小時(shí)可徹底除去器皿上沾污的RNA酶。不得用任何在180℃下可DEPC的水中浸泡12小時(shí)，然后經(jīng)高壓蒸汽滅菌，最后烘干。可購(gòu)買無(wú)RNA酶的一次性塑料制品，如塑料離心管、PCR管、槍沫、落塵帶入RNA酶的污染，必要的情況下戴口罩和實(shí)驗(yàn)帽，或在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行所有接觸RNA的試劑和材料都應(yīng)保持無(wú)菌，一旦有微生物污9羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《?1套式RT-PCR檢測(cè)產(chǎn)物序列4524ATGTAGAGCGTGGAGGAGTAAAAGTAGATATAGTTATTTGCGAATTAGGTGCTTCTATTTMrTV572F14582CGGCTCGTAAGGGTATAGTGTCTTATTTTCCGCGCGTGAATGAGTTGTCTAGTCTTAGTG4642GTTTAATGGCTAACGGTGAGTTAAGAGTATTTACAACAACCAATTTTGGTAAATTCAATT4702TTCTAATTCCCAAAGATTCTTCTGCTATCTTTACTAGGGTTGTGGATCATGTAGAGTCTA4762GATCACCAGAAGGTTCTTCGTATTATATAAGGCAAGGTTTTGAAGCAAAGGGAAATTCTG4822TTCATGGTGATTGTTGTGCTCCCTACATAATGTTTAATCCGTCTTCGCGTGCTAAGATTG4882TGGGTCTCCATTGTGCTGGATTTGCTCAGACATCTCGAGTGTTTGCTCAAATGATAACGC4942AGGAGGATATTGCTA