第8章 高效液相色譜課件

8高效液相色譜第8章高效液相色譜8.1概述8.2HPLC儀器包括：高壓輸液裝置;進(jìn)樣系統(tǒng);分離系統(tǒng);檢測(cè)系統(tǒng);輔助系統(tǒng)8.3流動(dòng)相和固定相簡(jiǎn)介8.4高效液相色譜方法簡(jiǎn)述分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜8高效液相色譜8.1概述高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動(dòng)相的色譜方法。

按照固定相不同可分為：液-液分配色譜；吸附色譜(液-固色譜)；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜)。此外，還有親和色譜、平板色譜(薄層色譜)等。早期液相色譜，包括Tswett的工作，都是在直徑1~5cm,長(zhǎng)50~500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在150~200m范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低(<1mL/min)，分析時(shí)間仍然很長(zhǎng)！當(dāng)加壓增加流速(真空或空氣泵)時(shí)，盡管分析時(shí)間減少，但柱塔板高度Hmin也相應(yīng)增加了！或者說柱效下降了。為了解決分析時(shí)間及柱效問題，人們認(rèn)識(shí)到：最為有效地增加柱效的唯一方法是減小填充物的粒徑（3~10m

）！

8高效液相色譜1.高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測(cè)器——10-11g。2.HPLC與GC的比較分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點(diǎn)有機(jī)物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。流動(dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用??；HPLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機(jī)會(huì)多。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即流動(dòng)相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。結(jié)論：從色譜分析的發(fā)展來看，HPLC比GC更為有用、更具發(fā)展前途！8高效液相色譜3.應(yīng)用由于HPLC分離分析的高靈敏度、定量的準(zhǔn)確性、適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，因此，在工業(yè)、科學(xué)研究，尤其是在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機(jī)物等分析，大多是通過HPLC來完成的。右圖是各種HPLC方法的應(yīng)用范圍及對(duì)象極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過濾分子量8高效液相色譜8.2HPLC儀器

HPLC儀器包括：高壓輸液裝置;

進(jìn)樣系統(tǒng);

分離系統(tǒng);

檢測(cè)系統(tǒng);

此外還配有梯度淋洗、自動(dòng)進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理裝置。其工作過程如圖所示。8高效液相色譜He儲(chǔ)液瓶分布器過濾2

m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過濾器反壓調(diào)節(jié)壓力計(jì)注樣閥分離柱到檢測(cè)器HPLC儀器詳解8高效液相色譜1.高壓輸液系統(tǒng)（150～350×105Pa）1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔徑約2m，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。2）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去（氣泡會(huì)影響檢測(cè)）。3）高壓泵：對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。

恒壓泵(類似于風(fēng)箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動(dòng)時(shí)，會(huì)引起脈動(dòng)，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。

恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī)械往復(fù)式兩種。應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)式恒流泵(見下圖。每分鐘往復(fù)25~100次，因此脈動(dòng)小。對(duì)流量變化敏感的檢測(cè)器也會(huì)有噪聲干擾，此時(shí)可連接一脈動(dòng)阻尼器)。8高效液相色譜馬達(dá)往復(fù)式拉動(dòng)密封溶劑球閥脈動(dòng)阻尼器到色譜柱機(jī)械往復(fù)柱塞泵示意圖4）梯度淋洗裝置：在分離過程中逐漸改變流動(dòng)相組成或極性（從而改變分配比k值）的裝置。如果只有一個(gè)泵，可采用低壓混合設(shè)計(jì)（將兩種或以上的溶劑按一定比例混合，再由高壓泵輸出）；如果有兩個(gè)或以上泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。8高效液相色譜2.進(jìn)樣系統(tǒng)與GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對(duì)要小些。即，HPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器的死體積。進(jìn)樣裝置包括兩種。1）隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。2）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱8高效液相色譜3.色譜柱1）對(duì)色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長(zhǎng)多為10~30cm，內(nèi)徑為4~5mm(尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內(nèi)徑更大)；2）柱的填充：主要采用勻漿法。根據(jù)使用勻漿試劑的性質(zhì)不同可分為：填充方法：填充時(shí)，按上述方法制作勻漿液，用流動(dòng)相充滿色譜柱及其延長(zhǎng)管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無空氣進(jìn)入(影響填充均勻性)。8高效液相色譜4.檢測(cè)器液相色譜檢測(cè)器包括紫外吸收、熒光發(fā)射、示差折光和安培檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器等。1）紫外檢測(cè)器其檢測(cè)原理和UV-Vis方法一樣。只是此時(shí)所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10

L。

HPLC分析中，約有80%的物質(zhì)可以在254nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測(cè)器應(yīng)用很廣。

在選擇測(cè)量波長(zhǎng)時(shí)注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長(zhǎng)不能小于溶劑的最低使用波長(zhǎng)。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液8高效液相色譜2）熒光檢測(cè)器許多有機(jī)物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。熒光檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。3）示差折光檢測(cè)器原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對(duì)光的折射率不同，其中一束光（通常是通過樣品+溶劑相）因?yàn)榘l(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強(qiáng)度差發(fā)生變化，將此差示信號(hào)放大并記錄，該信號(hào)代表樣品的濃度。為通用型檢測(cè)器，靈敏度為10-7g/mL。但對(duì)溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。光源調(diào)零光學(xué)零參比樣品平面鏡透鏡光電轉(zhuǎn)換記錄儀放大器遮光板8高效液相色譜4）安培檢測(cè)器由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積為1~5

L）組成。如圖。該檢測(cè)器是利用待測(cè)物流入反應(yīng)池時(shí)在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電流通過，此電流大小與待測(cè)物濃度成正比。采用安培檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)隋性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測(cè)器只能檢測(cè)具有電活性的物質(zhì)。接參比電極和對(duì)電極接色譜柱Teflon塑料塊1cm工作電極(Pt,Au,碳糊)8高效液相色譜5）電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子色譜的檢測(cè)。其原理是基于待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來測(cè)量電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)檢測(cè)器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當(dāng)pH>7時(shí)，該檢測(cè)器不夠靈敏。其它檢測(cè)器還包括：MS、IR、Evaporativelightscatteringdetector(光散射)、極譜等。8高效液相色譜8.3HPLC流動(dòng)相和固定相簡(jiǎn)介一、流動(dòng)相與GC流動(dòng)相不同，HPLC流動(dòng)相為溶劑，它既有運(yùn)載作用，又和固定相一樣，參予對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)，因此溶劑的選擇對(duì)分離十分重要。

理想的溶劑應(yīng)有下列特性：1）對(duì)待測(cè)物具一定極性和選擇性；2）和檢測(cè)器匹配。使用UV檢測(cè)器時(shí)，溶劑截止波長(zhǎng)要小于測(cè)量波長(zhǎng)(溶劑截止波長(zhǎng)指低于此波長(zhǎng)時(shí)，溶劑的吸收會(huì)影響溶質(zhì)的測(cè)定)；使用折光率檢測(cè)器，溶劑的折光率要與待測(cè)物的折光率有較大差別；3）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時(shí)可使截止波長(zhǎng)增加；4）化學(xué)穩(wěn)定性好；5）適宜的粘度。粘度過高，柱壓增加；過低，易產(chǎn)生氣泡。

8高效液相色譜1.按承受壓力分剛性固體：SiO2為基質(zhì)，耐壓為7.0×108~1.0×109Pa。可制成直徑、形狀和孔隙深度不同的顆粒；主要用于吸附、分配和鍵合色譜；硬膠：以聚合物為基質(zhì)(常用苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成)，耐壓上限為3.5×108Pa,主要用于離子交換和尺寸排阻色譜。2.按孔隙深度分表面多孔型：以實(shí)心玻璃珠為基體，在基體表面覆蓋一層多孔活性材料(如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的顆粒大(易裝柱)、多孔層厚度小且孔淺(滲透性好，出峰快)；但交換容量小。適于常規(guī)分離分析。全多孔型：全部由硅膠或氧化鋁微粒聚集而成，因顆粒極細(xì)，因而孔徑小、傳質(zhì)快、柱效高。特別適于復(fù)雜混合物的分離。3.按分離原理分：

分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等二、固定相載體8高效液相色譜8.4高效液相色譜方法理論按分離原理可將HPLC分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等。現(xiàn)在作分別介紹。一、分配色譜原理：根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過程。2.流動(dòng)相:HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜（流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。8高效液相色譜正相色譜：低極性流動(dòng)相—C先流出反相色譜：高極性流動(dòng)相—A先流出中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測(cè)物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系00008高效液相色譜3.固定相原則上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：

,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撐二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鯊?fù)?SQ)。

根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機(jī)械涂漬型和化學(xué)鍵合型，后者應(yīng)用更為廣泛。1）機(jī)械涂漬固定相：將固定液通過機(jī)械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。

為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動(dòng)相進(jìn)入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。8高效液相色譜2）化學(xué)鍵合固定相：化學(xué)鍵合固定相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。這種固定相分離機(jī)理既不是簡(jiǎn)單的吸附，也不是單一的液液分配，而是二者兼而有之。化學(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對(duì)多數(shù)鍵合相來說，以分配機(jī)理為主。通常，化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：Si-O-R：對(duì)熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會(huì)水解，使酯鏈斷裂，因此只適于以不含水或醇的流動(dòng)相。Si-R(或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使用水溶液作流動(dòng)相時(shí)，其pH應(yīng)在4-8之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定。8高效液相色譜4.正相和反相鍵合色譜法

正相鍵合色譜中，隨流動(dòng)相極性增加，組分分配比k增加。8高效液相色譜時(shí)間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)（極性越?。?，分離效果越好。8高效液相色譜二.液固色譜（吸附色譜）原理：根據(jù)固體吸附劑活性位點(diǎn)對(duì)不同組分吸附作用的強(qiáng)弱分離。組分的吸附力強(qiáng)弱取決于吸附劑的表面性質(zhì)、溶質(zhì)結(jié)構(gòu)和流動(dòng)相性質(zhì)。固定相：固體吸附劑：多孔硅膠，氧化鋁等；活性炭，石墨化炭黑，高分子微球。應(yīng)用：溶質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)空間效應(yīng)和官能團(tuán)之間的相互作用對(duì)保留值影響很大，順式結(jié)構(gòu)具有更高的保留，大體積取代基會(huì)降低組分的保留。常用于同分異構(gòu)體或順反異構(gòu)體的分離。8高效液相色譜三、離子交換色譜此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測(cè)定各類陰、陽離子的分離分析方法。它既適于無機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。1.原理：利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。待測(cè)離子與離子交換樹脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：

8高效液相色譜ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Temporalcourse離子交換分離機(jī)理ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋8高效液相色譜慢中等快色譜分離Temporalcourse淋洗液8高效液相色譜分離常見陰離子0246810121416Retentiontime(min)08mSF-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-8高效液相色譜2.固定相按離子交換劑類型分四種：

8高效液相色譜3.流動(dòng)相離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強(qiáng)