第十章 高效液相色譜法課件

2025/1/118高效液相色譜法第十章

高效液相色譜法第一節(jié)固定相和流動(dòng)相

第二節(jié)高效液相色譜儀

第三節(jié)液-固色譜法

第四節(jié)化學(xué)鍵合相色譜法

第五節(jié)離子交換色譜法

第六節(jié)尺寸排阻色譜法

第七節(jié)分離方式的選擇及應(yīng)用

2025/1/118高效液相色譜法色譜法分類(lèi)示意圖2025/1/118高效液相色譜法概述高效液相色譜法是在氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上70年代初期發(fā)展起來(lái)的一種以液體做流動(dòng)相的新色譜技術(shù)。現(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒(méi)有本質(zhì)的區(qū)別。不同點(diǎn)僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率和實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化

操作。經(jīng)典的液相色譜法，流動(dòng)相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長(zhǎng)。而現(xiàn)代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9

107Pa）；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬(wàn)或幾十萬(wàn)）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動(dòng)化等特點(diǎn)。所以人們稱(chēng)它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。2025/1/118高效液相色譜法一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動(dòng)相柱效低（H↑，n↓）分析周期長(zhǎng)無(wú)法在線檢測(cè)2．HPLC：分離和分析

柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動(dòng)相柱效高（H↓，n↑）分析時(shí)間大大縮短可以在線檢測(cè)2025/1/118高效液相色譜法二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別1．分析對(duì)象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測(cè)占有機(jī)物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)用途廣泛，占有機(jī)物的80%2025/1/118高效液相色譜法2．流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只與固定相作用HPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用流動(dòng)相種類(lèi)較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?025/1/118高效液相色譜法第一節(jié)

固定相和流動(dòng)相一、固定相二、流動(dòng)相2025/1/118高效液相色譜法一、固定相

1.高效液相色譜固定相以承受高壓能力來(lái)分類(lèi)，可分為剛性固體和硬膠兩大類(lèi)。（1）剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.0

108

～

1.0

109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。（2）硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5

108Pa。2025/1/118高效液相色譜法

2.固定相按孔隙深度分類(lèi)，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類(lèi)。（1）表面多孔型固定相

它的基體是實(shí)心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。這類(lèi)固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)到平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受到限制。2025/1/118高效液相色譜法（2）全多孔型固定相由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類(lèi)固定相由于顆粒很細(xì)（5～10

m），孔較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。2025/1/118高效液相色譜法

表10-1兩類(lèi)固定相的性能比較2025/1/118高效液相色譜法二、流動(dòng)相

對(duì)流動(dòng)相的要求是：1.純度高由于高效液相色譜靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。2.粘度低若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過(guò)低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。2025/1/118高效液相色譜法3.化學(xué)穩(wěn)定性好

不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑4.

溶劑沸點(diǎn)要高于55℃

低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)度大，容易使流動(dòng)相濃度或組成發(fā)生變化，也容易產(chǎn)生氣泡5.

溶劑要能完全浸潤(rùn)固定相溶劑對(duì)所測(cè)定的組分要有合適的極性，最好選擇樣品的溶劑作流動(dòng)相，否則發(fā)生溶劑與流動(dòng)相不相混溶的情況，使分離變壞2025/1/118高效液相色譜法6.溶劑與檢測(cè)器匹配

對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，所選擇的溶劑在檢測(cè)器的工作波長(zhǎng)下不能有紫外吸收。

對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)到最高靈敏度。2025/1/118高效液相色譜法第二節(jié)

高效液相色譜儀

highperformanceliquidchromatograph一、液相色譜儀器二、流程及主要部件

2025/1/118高效液相色譜法一、液相色譜儀器

highperformanceliquidchromatograph2025/1/118高效液相色譜法液相色譜儀（2）2025/1/118高效液相色譜法液相色譜儀（3）2025/1/118高效液相色譜法液相色譜儀（4）2025/1/118高效液相色譜法二、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程2025/1/118高效液相色譜法高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測(cè)器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置圖10-1高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)方塊圖2025/1/118高效液相色譜法2.主要部件高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等五大部分組成。分析前，選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動(dòng)相，開(kāi)泵，沖洗柱子，待柱子達(dá)到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進(jìn)樣口，流動(dòng)相把試樣帶入色譜柱進(jìn)行分離，分離后的組分依次流入檢測(cè)器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當(dāng)有樣品組分流過(guò)流通池時(shí)，檢測(cè)器把組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，經(jīng)過(guò)放大，用記錄器記錄下來(lái)就得到色譜圖。色譜圖是定性、定量和評(píng)價(jià)柱效高低的依據(jù)。

2025/1/118高效液相色譜法（1）高壓輸液系統(tǒng)溶劑貯存器高壓泵梯度洗脫裝置壓力表

2025/1/118高效液相色譜法A.溶劑貯存器

溶劑貯存器一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2L，用來(lái)貯存足夠數(shù)量、符合要求的流動(dòng)相。

2025/1/118高效液相色譜法B.高壓輸液泵

高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關(guān)鍵部件之一，其功能是將溶劑貯存器中的流動(dòng)相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過(guò)程。由于液相色譜儀所用色譜柱徑較細(xì)，所填固定相粒度很小，因此，對(duì)流動(dòng)相的阻力較大，為了使流動(dòng)相能較快地流過(guò)色譜柱，就需要高壓泵注入流動(dòng)相。對(duì)泵的要求：輸出壓力高、流量范圍大、流量恒定、無(wú)脈動(dòng)，流量精度和重復(fù)性為0.5%左右。此外，還應(yīng)耐腐蝕，密封性好。

2025/1/118高效液相色譜法續(xù)前高壓輸液泵，按其性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵兩大類(lèi)。恒流泵是能給出恒定流量的泵，其流量與流動(dòng)相粘度和柱滲透無(wú)關(guān)。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。2025/1/118高效液相色譜法C.梯度洗脫裝置

梯度洗脫就是在分離過(guò)程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。

梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過(guò)不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來(lái)調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過(guò)色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過(guò)溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來(lái)達(dá)到。

2025/1/118高效液相色譜法梯度洗脫裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2025/1/118高效液相色譜法圖示2025/1/118高效液相色譜法（2）進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。2025/1/118高效液相色譜法進(jìn)樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2025/1/118高效液相色譜法（3）分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2~6mm，柱長(zhǎng)為10~50cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿(mǎn)微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。2025/1/118高效液相色譜法高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2025/1/118高效液相色譜法（4）檢測(cè)器檢測(cè)器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對(duì)檢測(cè)器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對(duì)溫度和流量的變化不敏感等。在液相色譜中，有兩種類(lèi)型的檢測(cè)器，一類(lèi)是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。屬于此類(lèi)檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等；另一類(lèi)是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)。屬于此類(lèi)檢測(cè)器有示差折光檢測(cè)器等。2025/1/118高效液相色譜法a.紫外檢測(cè)器

應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL）；

對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

2025/1/118高效液相色譜法b.光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2025/1/118高效液相色譜法2025/1/118高效液相色譜法c.示差折光檢測(cè)器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；2025/1/118高效液相色譜法d.熒光檢測(cè)器

（fluorescencedetector）高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類(lèi)化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)；2025/1/118高效液相色譜法第三節(jié)

液-固色譜法一、原理二、固定相三、流動(dòng)相l(xiāng)iquid-solidadsorptionchromatograph2025/1/118高效液相色譜法液固色譜的固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，位于其表面的原子、離子或分子的性質(zhì)是多少不同于在內(nèi)部的原子、離子或分子的性質(zhì)的。表層的鍵因缺乏覆蓋層結(jié)構(gòu)而受到擾動(dòng)。因此，表層一般處于較高的能級(jí)，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心

。因此，液固色譜法是根據(jù)各組分在固定相上的吸附能力的差異進(jìn)行分離，分離前提：K不等或k不等,故也稱(chēng)為液固吸附色譜。

一、原理2025/1/118高效液相色譜法

吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質(zhì)，試樣的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。組分與吸附劑的性質(zhì)相似時(shí)，易被吸附，呈現(xiàn)高的保留值；當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時(shí)，易于吸附。從而使吸附色譜成為分離幾何異構(gòu)體的有效手段；不同的官能團(tuán)具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對(duì)同系物沒(méi)有選擇性（即對(duì)分子量的選擇性?。荒苡迷摲ǚ蛛x分子量不同的化合物。2025/1/118高效液相色譜法二、固定相

液固色譜法采用的固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性?xún)煞N類(lèi)型。1.極性吸附劑：包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。特點(diǎn)：峰易拖尾;適用：分離極性化合物極性吸附劑可進(jìn)一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧和吡咯衍生物等。2025/1/118高效液相色譜法2.非極性吸附劑：

最常見(jiàn)的是活性炭。

各種吸附劑中，最常用的吸附劑是硅膠，其次是氧化鋁。特點(diǎn)：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物在現(xiàn)代液相色譜中，硅膠不僅作為液固吸附色譜固定相，還可作為液液分配色譜的載體和鍵合相色譜填料的基體。2025/1/118高效液相色譜法三、流動(dòng)相液-固色譜的流動(dòng)相必須符合下列要求：

1.能溶解樣品，但不能與樣品發(fā)生反應(yīng)。

2.與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)。

3.粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效。

4.應(yīng)與所用檢測(cè)器相匹配。例如利用紫外檢測(cè)器時(shí)，溶劑要不吸收紫外光。

5.容易精制、純化、毒性小，不易著火、價(jià)格盡量便宜等。在液-固色譜中，選擇流動(dòng)相的基本原則是極性大的試樣用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的則用低極性流動(dòng)相。2025/1/118高效液相色譜法流動(dòng)相組成：底劑（烷烴）+有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷或庚烷+氯仿---影響k的因素：與固定相性質(zhì)和流動(dòng)相性質(zhì)有關(guān)溶質(zhì)分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑

溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時(shí)間出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%分配色譜硅膠失活→載體吸附的水→固定液2025/1/118高效液相色譜法第四節(jié)

化學(xué)鍵合相色譜法一、概述二、化學(xué)鍵合相三、反相鍵合相色譜法四、正相鍵合相色譜法2025/1/118高效液相色譜法一、概述

將固定液機(jī)械地涂漬在擔(dān)體上組成固定相。盡管選用與固定液不互溶的溶劑作流動(dòng)相，但在色譜過(guò)程中固定液仍會(huì)有微量溶解。以及流動(dòng)相經(jīng)過(guò)色譜柱的機(jī)械沖擊，固定相會(huì)不斷流失，即使將流動(dòng)相預(yù)先用固定相液體飽和或在色譜柱前加一個(gè)前置柱，使流動(dòng)相先通過(guò)前置柱，再進(jìn)入色譜柱，但仍難以完全避免固定液的流失。

2025/1/118高效液相色譜法續(xù)前70年代初發(fā)展了一種新型的固定相—化學(xué)鍵合固定相。這種固定相是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)把各種不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，代替機(jī)械涂漬的液體固定相。這不僅避免了液體固定相流失的困擾，還大大改善了固定相的功能，提高了分離的選擇性，化學(xué)鍵合色譜適用于分離幾乎所有類(lèi)型的化合物。2025/1/118高效液相色譜法

根據(jù)鍵合相與流動(dòng)相之間相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。在極性鍵合相色譜中，由于流動(dòng)相的極性比固定相極性要小，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說(shuō)的反相色譜系指非極性鍵合色譜。反相色譜在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛。2025/1/118高效液相色譜法二、化學(xué)鍵合相化學(xué)鍵合固定相一般都采用硅膠（薄殼型或全多孔微粒型）為基體。在鍵合反應(yīng)之前，要對(duì)硅膠進(jìn)行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機(jī)物或有機(jī)硅化合物起反應(yīng)，制備化學(xué)鍵合固定相。2025/1/118高效液相色譜法鍵合相可分為四種鍵型：A硅酸酯型（=Si-O-C=）鍵合相

將醇與硅膠表面的羥基進(jìn)行酯化反應(yīng)，在硅膠表面形成（=Si-O-C=）鍵合相。反應(yīng)生成單分子層鍵合相。一般用極性小的溶劑洗脫，分離極性化合物。B硅氮型（=Si-N=）鍵合相

如果用SOCl2將硅膠表面的羥基先轉(zhuǎn)化成鹵素（氯化），再與各種有機(jī)胺反應(yīng)，可以得到各種不同極性基因的鍵合相?？捎梅菢O性或強(qiáng)極性的溶劑作為流動(dòng)相。2025/1/118高效液相色譜法C硅碳型（=Si-C=）鍵合相將硅膠表面氯化后，使Si-Cl鍵轉(zhuǎn)化為Si-C鍵。在這類(lèi)固定相中，有機(jī)基團(tuán)直接鍵合在硅膠表面上。D硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）鍵合相

將硅膠與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)制備。這類(lèi)鍵合相具有相當(dāng)?shù)哪蜔嵝院突瘜W(xué)穩(wěn)定性，是目前應(yīng)用最為廣泛的鍵合相。2025/1/118高效液相色譜法三、反相鍵合相色譜法

在反相色譜中，一般采用非極性鍵合固定相，如硅膠-C18H37（簡(jiǎn)稱(chēng)ODS或C18）硅膠-苯基等，用強(qiáng)極性的溶劑為流動(dòng)相，如甲醇/水，乙腈/水，水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液等。目前，對(duì)于反相色譜的保留機(jī)制還沒(méi)有一致的看法，大致有兩種觀點(diǎn)：一種認(rèn)為屬于分配色譜，另一種認(rèn)為屬于吸附色譜。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。分配色譜的作用機(jī)制是假設(shè)混合溶劑（水+有機(jī)溶劑）中極性弱的有機(jī)溶劑吸附于非極性烷基配合基表面，組分分子在流動(dòng)相中與被非極性烷基配合基所吸附的液相中進(jìn)行分配。2025/1/118高效液相色譜法吸附色譜的作用機(jī)制是把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用水與有機(jī)溶劑所組成的極性溶劑為流動(dòng)相來(lái)分離有機(jī)化合物時(shí)，一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會(huì)從水中被“擠”出來(lái)，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，使它離開(kāi)固定相，減少保留值，此即解締過(guò)程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。一般地，固定相的烷基配合基或分離分子中非極性部分的表面積越大，或者流動(dòng)相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強(qiáng)，分配比也越大，保留值越大。

2025/1/118高效液相色譜法四、正相鍵合色譜法

在正相色譜中，一般采用極性鍵合固定相，硅膠表面鍵合的是極性的有機(jī)基團(tuán)，鍵合相的名稱(chēng)由鍵合上去的基團(tuán)而定。最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）鍵合相。流動(dòng)相一般用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機(jī)溶劑，如烴類(lèi)溶劑，或其中加入一定量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度。通常用于分離極性化合物。2025/1/118高效液相色譜法

一般認(rèn)為正相色譜的分離機(jī)制屬于分配色譜。組分的分配比k值，隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相中極性調(diào)節(jié)劑的極性增大（或濃度增大）而降低。同時(shí)，極性鍵合相的極性越大，組分的保留值越大。該法主要用于分離異構(gòu)體，極性不同的化合物，特別是用來(lái)分離不同類(lèi)型的化合物。2025/1/118高效液相色譜法化學(xué)鍵合色譜具有下列優(yōu)點(diǎn)：

A.適用于分離幾乎所有類(lèi)型的化合物。一方面通過(guò)控制化學(xué)鍵合反應(yīng)，可以把不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過(guò)改變流動(dòng)相的組成合乎種類(lèi)來(lái)有效地分離非極性、極性和離子型化合物。

B.由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來(lái)的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。2025/1/118高效液相色譜法續(xù)前C.鍵合固定相對(duì)不太強(qiáng)的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。D.固定相柱效高，使用壽命長(zhǎng)，分析重現(xiàn)性好。2025/1/118高效液相色譜法1．分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異2．固定相：載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法）缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用

固定液——極性→NLLC

固定液——非極性→RLLC3．正相色譜——固定液極性>流動(dòng)相極性（NLLC）

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分反相色譜——固定液極性<流動(dòng)相極性（RLLC）

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分液液分配色譜法（LLC）2025/1/118高效液相色譜法（一）常規(guī)化學(xué)鍵合相利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面

1．分離機(jī)制：分配+吸附（以LLC為基礎(chǔ)）

2．特點(diǎn)：不易流失熱穩(wěn)定性好化學(xué)性能好載樣量大適于梯度洗脫4、化學(xué)鍵合固定相2025/1/118高效液相色譜法（二）反相鍵合相固定相1．分離機(jī)制：疏溶劑理論正相——流動(dòng)相與溶質(zhì)排斥力強(qiáng)，作用時(shí)間↑，k↑，組分tR↑

反相——流動(dòng)相與溶質(zhì)排斥力弱，作用時(shí)間↓，k↓，組分tR↓2．固定相：極性小的烷基鍵合相

C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC約80%問(wèn)題）3．流動(dòng)相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動(dòng)相極性>固定相極性底劑+有機(jī)調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑）

例：水+甲醇，乙腈，THF2025/1/118高效液相色譜法4．流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑5．出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱6．適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問(wèn)題）（三）正相鍵合相色譜1．分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力2．固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3．流動(dòng)相：極性?。ㄍ琇SC）底劑+有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇2025/1/118高效液相色譜法4．流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍?。┓蛛x物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性分析極性大物質(zhì)、糖類(lèi)等2025/1/118高效液相色譜法第五節(jié)

離子交換色譜法一、原理二、固定相三、流動(dòng)相四、離子色譜法ion-exchange

chromatograph2025/1/118高效液相色譜法

離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，因此應(yīng)用范圍較廣。

2025/1/118高效液相色譜法一、原理

離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹(shù)脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：

陽(yáng)離子交換：陰離子交換：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A2025/1/118高效液相色譜法對(duì)于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，一價(jià)離子的選擇性順序?yàn)椋?/p>

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二價(jià)離子的順序?yàn)椋?/p>

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+對(duì)于陰離子交換樹(shù)指，各陰離子的選擇性順序?yàn)椋?/p>

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-

＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－2025/1/118高效液相色譜法二、固定相

作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類(lèi)：合成樹(shù)脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽(yáng)離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分（見(jiàn)下表）表10-2離子交換劑上的官能基2025/1/118高效液相色譜法

常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：1.多孔型離子交換樹(shù)脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5～20μm，有微孔型和大孔型之分2.薄膜型離子交換樹(shù)脂

它是在直徑約為30μm的固體情性核上，凝聚1～2μm厚的樹(shù)脂層。3.表面多孔型離子交換樹(shù)脂

它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹(shù)脂。2025/1/118高效液相色譜法4.離子交換鍵合固定相它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類(lèi)型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來(lái)實(shí)現(xiàn)快速分離。2025/1/118高效液相色譜法三、流動(dòng)相離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。通過(guò)改變流動(dòng)相中鹽離子的種類(lèi)、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競(jìng)爭(zhēng)吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度可通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值來(lái)控制。增大pH值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無(wú)論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留值增大。

2025/1/118高效液相色譜法四、離子色譜法

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來(lái)的一種分離方法。離子交換色譜法在無(wú)機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對(duì)于那些不能采用紫外檢測(cè)器的被測(cè)離子，如采用電導(dǎo)檢測(cè)器，由于被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號(hào)淹沒(méi)而無(wú)法檢測(cè)。為了解決這一問(wèn)題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測(cè)定多種無(wú)機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)：2025/1/118高效液相色譜法續(xù)前他們?cè)陔x子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱(chēng)為離子色譜。若樣品為陽(yáng)離子，用無(wú)機(jī)酸作流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽(yáng)離子交換劑的分離柱后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng)：2025/1/118高效液相色譜法R+－OH＋H+Cl-→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl-→M+OH－＋R+－Cl-

由反應(yīng)可見(jiàn)：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽(yáng)離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測(cè)陽(yáng)離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。

2025/1/118高效液相色譜法續(xù)前在分離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱(chēng)為抑制型離子色譜或稱(chēng)雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過(guò)抑制柱后會(huì)加寬，降低了分離度。后來(lái)，F(xiàn)rits等人提出采用非抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·L-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動(dòng)相，稱(chēng)為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。2025/1/118高效液相色譜法1.離子色譜法原理離子色譜原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：采用交換容量非常低的特制離子交換樹(shù)脂為固定相；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用抑制柱來(lái)消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無(wú)機(jī)離子混合物；各種抑制裝置及無(wú)抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。2025/1/118高效液相色譜法2.離子色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)（1）分析速度快

可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；（2）分離能力高

在適宜的條件下，可使常見(jiàn)的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱2025/1/118高效液相色譜法3.離子色譜法裝置：2025/1/118高效液相色譜法第六節(jié)

尺寸排阻色譜法一、原理二、固定相三、流動(dòng)相size-exclusionchromatograph2025/1/118高效液相色譜法

尺寸排阻色譜法又稱(chēng)凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。

2025/1/118高效液相色譜法尺寸排阻色譜具有其他液相色譜所沒(méi)有的特點(diǎn)：

（1）保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。(2)保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可采用靈敏度較低的檢測(cè)器。（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長(zhǎng)。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量差別必須大于10％才能得以分離。2025/1/118高效液相色譜法一、原理

尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)——凝膠，它類(lèi)似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過(guò)程模型見(jiàn)圖20-7。2025/1/118高效液相色譜法2025/1/118高效液相色譜法

二、固定相

排阻色譜固定相種類(lèi)很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類(lèi)。所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。

1.軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜用在高效液相色譜中。

2025/1/118高效液相色譜法2.半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）