DB3301T 1120-2023 三葉青種質(zhì)資源鑒定技術規(guī)程 SSR標記法

33012023-02-28發(fā)布I 3 3 4 6 8本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定1三葉青種質(zhì)資源鑒定技術規(guī)程SSR標記法hemsleyanumDielsetGilg）不同種質(zhì)資源鑒定的原理、儀器設備及試劑、溶液配制、操作程序及判定方法。本文件適用于三葉青種質(zhì)資源SSR指紋數(shù)據(jù)采集及種質(zhì)GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和在核酸合成反應時，作為多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的一小段單鏈脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid，DNA具有所用SSR位點上不同等位變異的品種。參照種質(zhì)資源用于輔助確定送檢樣品的等位變異，校正ChainReaction，PCR）擴增及電泳方2e)高速冷凍離心機(最大離心力不小于20000g);f)電子天平(精度為千分之一);5.3所用試劑i)DNA標準分子量標記(marker);3選取三葉青幼嫩葉片，每份樣品檢測5張葉片的混合樣，并設置三4e)重復b)～d),共35個循環(huán)；g)4℃保存。7.4PCR產(chǎn)物檢測7.4.1.1凝膠準備凝膠制備應按照如下步驟進行：a)將垂直夾心式電泳裝置的玻璃板與膠皮套裝在一起，取微波爐煮沸后的1%瓊脂糖封膠液約5mL封住玻璃板底部的縫隙，制成鑄膠槽；合液，超純水14.8mL,搖勻后加入200μL10%過硫酸銨和12μL四甲基二乙胺(TEMED),攪拌混勻后注滿鑄膠槽，隨即插好樣孔梳，于室溫下靜置直至凝膠完全聚合后使用。去掉封口的瓊脂糖膠，將膠板固定于垂直電泳槽中，在電泳槽中加滿1×TBE緩沖液，小心抽出樣孔梳，用移液器吸取TBE緩沖液沖洗每個點樣孔2次，然后向加樣孔中點入1.5μLPCR反應產(chǎn)物；同時，在一側加樣孔中加入DNA標準分子量標記(marker)。按樣品向正極遷移接通電源，以5V/cm(正負極間距離)恒壓電泳約2.5h。電泳完畢后關閉電源，取下玻璃板。小心分開兩塊玻璃板，取下聚丙烯酰胺凝膠，用蒸餾水沖洗凝膠30s~60s,放入染色液中，輕搖5min~10min進行染色；然后將凝膠從染色液中取出，用蒸餾水快速漂洗2次，每次30s~60s,放入顯影液中，輕搖至顯色出清晰帶紋，取出凝膠用蒸餾水沖洗2遍，瀝干后掃描或拍攝成像。7.5數(shù)據(jù)處理應根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳圖譜，在相同遷移位置處，有電泳條帶記為“1”,無條帶記為“0”,生成矩陣。以此來實現(xiàn)電泳帶型的數(shù)據(jù)化，并鑒定參試材料。8判定方法按照由帶型數(shù)據(jù)賦予的數(shù)字化指紋，可單獨或聯(lián)合使用的標記鑒定材料材料的異同，具體如下：a)當樣品間差異位點數(shù)≥2,判定為“不同”;b)當樣品間差異位點數(shù)=1,判定為“高度相似”;5c)當樣品間差異位點數(shù)=0，判定為極近似或相同。6A.1DNA提取溶液的配制移至1000mL容量瓶中，用超純水定容至1000mL，在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20mA.1.3三氯甲烷-異戊醇（24:1）A.1.475%乙醇溶液A.3聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制至1000mL容量瓶中，用超純水定容至1A.3.25×TBE緩沖液二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液，加入800mL超純水溶解，調(diào)整pH為8.0，轉移至1000mL容量瓶中，用量取5×TBE緩沖液200mL于1000mL容量瓶中，用超純水定容至1000A.3.440%丙烯酰胺溶液分別稱取丙烯酰胺190.0g和甲叉雙丙烯酰胺10.0g于500mL燒杯中，加7A.4銀染溶液的配制量取100mL冰醋酸于1000mL容量瓶中，加超純水定容至1A.4.2染色液