義翹講堂《高通量SPRBLI技術在藥物大規(guī)模篩選和表征中的應用》

王旭曼高級質控經理北京義翹神州科技股份有限公司高通量SPR/BLI技術在藥物大規(guī)模篩選及表征中的應用CONTENT義翹神州123高通量篩選技術在藥物研發(fā)進程中的應用及重要性SPR/BLI技術原理、優(yōu)勢及應用高通量SPR/BLI應用案例分享01義翹神州高通量篩選技術在藥物研發(fā)進程中的應用及重要性義翹神州藥物研發(fā)流程藥物靶點研究

藥物設計

結構優(yōu)化

活性篩選藥物制備研究

藥代動力學

藥物安全性

毒理學研究

Ⅰ期臨床Ⅱ期臨床Ⅲ期臨床新藥申請批準上市上市后監(jiān)測藥物研發(fā)階段臨床前研究新藥發(fā)現臨床研究新藥上市藥物篩選105~106個分子<10個分子1個藥物101~102個分子3-6年6-7年0.5-2年周期藥物研發(fā)周期長，成本高工作量大，成功率低義翹神州高通量篩選技術高通量篩選技術是將多種技術方法有機結合而形成的一種新技術體系，它以微孔板、微流控、芯片形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行實驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗數據，以計算機對數以千計的樣品數據進行分析處理，從而得出科學準確的實驗結果。結合活性生物活性WesternblotIHCFCMSPR/BLIELISACDC細胞增殖、分泌、遷移中和活性檢測酶、激酶活性ADCC&ADCP02義翹神州SPR/BLI技術原理、優(yōu)勢及應用義翹神州技術原理SPR實時傳感圖SPR原理BLI原理BLI實時傳感圖ABC義翹神州分析范圍SizeMW1000nm200nm75nm7nm1nm0.1nm1,0001,000,000100,0001501細胞細菌病毒免疫球蛋白抗體抗原蛋白質脂質納米材料糖類肽類核酸小分子化合物細胞-蛋白細菌-蛋白病毒-蛋白抗體-抗原蛋白-蛋白核酸-蛋白蛋白-脂類蛋白-糖類蛋白-肽類蛋白-小分子化合物多分子相互作用蛋白濃度定量SPR檢測小分子無分子量下限，靈敏度更高，檢測親和力范圍mM~fMBLI分子量檢測下限為150Da，檢測親和力范圍mM~pM弱結合中等強度強結合mM10-3μM10-6nM10-9?親和素-生物素結合：10-14M?強的抗原-抗體結合：10-8~10-10M?DNA與蛋白的結合：10-8~10-10M?蛋白與小分子結合：10-3~10-6M親和力(Affinity,KD)義翹神州互作信息有無結合(YesorNo)結合的特異性和選擇性(Specificity)兩種分子的結合強度--親和力(Affinity)結合和解離的快慢--動力學(Kinetics)目標分子活性含量的檢測(Concentration)技術優(yōu)勢無需標記靈敏度高

實時監(jiān)測動力學數據

高通量SPR分析溫度為4~40℃，可提供熱力學信息BLI分析溫度為室溫~40℃，不適用于給定相互作用的熱力學參數義翹神州固定配體法：將配體直接或間接的固定于芯片/傳感器表面。直接偶聯(lián)（Immobilization）捕獲（Capture）分析方法芯片/傳感器SPR：CM系列，CM5、CM3、CM7BLI：AR2G傳感器芯片/傳感器捕獲Mab/Fab：

ProA、ProG、ProLAHC、AMC、Fab捕獲標簽：NTA、anti-his、SA配體共價偶聯(lián)芯片/傳感器表面常用氨基偶聯(lián)的方法捕獲分子共價偶聯(lián)芯片/傳感器表面捕獲分子通過親合作用偶聯(lián)配體LigandAnalyteLigandAnalyteCapture義翹神州分析流程BaselineLoadingBaselineAssociationDissociationBLI分析流程：SPR分析流程：固定配體樣品進樣芯片再生數據分析義翹神州樣品要求01樣品充分水溶，均一、不聚集02純度（>90%），蛋白濃度>0.2mg/mL明確等電點/分子量信息03抗體亞型及蛋白標簽類型04氨基偶聯(lián)的配體溶液中不能含有Tris、NaN3、甘氨酸等成分SPR分析物樣品中不能含有甘油、蔗糖、咪唑等高折光的成分BLI對樣品buffer組分兼容性較好，可檢測血清、培養(yǎng)液及裂解液等復雜樣品SPR流路系統(tǒng)BLI蘸取式義翹神州Biacore8KOctetRH16高通量設備檢測通道：16通道KD范圍：mM~pM分析溫度：室溫~40℃分子量檢測下限：150Da

樣品/試劑載量：2×96或384孔板檢測通道：8根進樣針，16通道KD范圍：mM~fM

分析溫度：4~40℃分子量檢測下限：無

樣品/試劑載量：4×96或384孔板義翹神州SPR/BLI的應用抗體藥物Fc受體及C1q結合活性表征國產PD-1單抗NDA申報——信達生物2018年PD-1單抗國內上市，速度非凡2019年唯一進入醫(yī)保名錄的國產PD-1抗體PreclinicalcharacterizationofSintilimab,afullyhumananti-PD-1therapeuticmonoclonalantibodyforcancer.AntibodyTherapeutics.義翹神州SPR/BLI的應用生物反應器中細胞抗體表達量——MedImmuneAmbr15生物反應器罐體2×107cells/mL（左）1×108cells/mL

（右）連續(xù)20天Titer監(jiān)控Enhancingthefunctionalityofamicroscalebioreactorsystemasanindustrialprocessdevelopmenttoolformammalianperfusionculture.BiotechnologyandBioengineering.藥物活性濃度定量篩選義翹神州SPR/BLI的應用基于Biacore垂釣實驗來篩選中藥活性成分——第二軍醫(yī)大學聯(lián)合上海大學AstrategyofscreeningandbindinganalysisofbioactivecomponentsfromtraditionalChinesemedicinebasedonsurfaceplasmonresonancebiosensor.PharmaceuticalAnalysisFig.3.AffinitiesofthebioactivecandidatestowardsTNF-R1determinedbysurfaceplasmonresonance(SPR)affinityassay.(A)Sensorgramsofserialconcentrationsofpaeoniflorin(0-33.3μM).(B)Affinityconstantofpaeoniflorin.(C)Sensorgramsofserialconcentrationsofpaeonol(0-33.3μM).(D)Affinityconstantofpaeonol.分子垂釣--新靶點發(fā)現義翹神州SPR/BLI的應用batchka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)12.95E+059.23E-053.13E-1023.09E+058.46E-052.74E-1033.11E+058.29E-052.67E-1043.04E+058.55E-052.81E-1053.06E+058.75E-052.86E-1063.13E+058.26E-052.64E-10Average3.06E+058.59E-052.81E-10STDEV6.33E+033.63E-061.78E-11CV（%）2.07%4.22%6.33%6批次藥物與PCSK9蛋白親和力質控放行藥物生產、質控與批次放行Time(s)ResponseTime(s)ResponseTime(s)ResponseTime(s)ResponseTime(s)ResponseTime(s)Response03義翹神州高通量SPR/BLI應用案例分享義翹神州項目背景：針對蛋白靶點，AI設計抗體序列并重組表達，篩選陽性且親和力高的抗體案例分享1：高通量SPR在AI設計重組抗體的篩選中的應用篩選策略：親和力KD檢測二抗抗原重組抗體ELISA上清bindingSPR上清rankingproteinA芯片重組抗體重組抗體：200重組抗體：56陽性上清表達純化抗原義翹神州上清SPRranking結果上清SPR親和力排序結果純化抗體SPR親和力篩選結果KD=1.9E-09KD=1.59E-09mAb-34mAb-51案例分享1：高通量SPR在AI設計重組抗體的篩選中的應用Time(s)ResponseTime(s)Response義翹神州案例分享2：高通量SPR在抗體表位分析中的應用抗原第一抗體第二抗體表位分析方法：項目背景：針對7株鼠單抗進行表位分析常用且節(jié)省抗原的方法：TandemAssayTandemAssaySandwichAssayPremixAssay抗原第一抗體第二抗體抗原第二抗體抗原第一抗體第二抗體義翹神州案例分享2：高通量SPR在抗體表位分析中的應用TheheatmapTandemAssay結果解析：兩株抗體是競爭關系兩株抗體是非競爭關系抗體自我競爭兩株抗體正向與反向競爭不一致，此方向為競爭兩株抗體正向與反向競爭不一致，此方向為非競爭Thebinchartbin1bin2bin3bin3中的3株抗體與bin2中的抗體2單向競爭帶箭頭的線：表示抗體2作為第一抗體，與箭頭指向方向的抗體作為第二抗體單向競爭bin1中的7株抗體與bin2中的抗體2相互競爭不帶箭頭的線：雙向相互競爭義翹神州案例分享2：高通量SPR在抗體表位分析中的應用mAb7mAb6mAb5mAb4mAb3mAb2mAb1mAb1為單獨表位，與其他抗體無競爭關系

其余6株抗體為完全競爭關系，抗體表位相同7株抗體表位檢測結果：抑制率mAb1mAb2mAb3mAb4mAb5mAb6mAb7mAb15.5%83.7%83.7%85.1%62.9%77.6%97.3%mAb296.6%5.1%10.4%5.5%5.2%19.1%16.6%mAb393.6%11.4%11.5%16.8%15.9%4.9%15.2%mAb4108.4%12.9%17.7%15.3%16.2%15.7%7.5%mAb5117.7%11.9%16.9%17.1%6.1%15.6%10.8%mAb690.3%13.9%15.7%19.4%12.3%10.2%18.1%mAb7104.1%11.1%13.2%13.4%13.4%13.8%12.4%抑制率20%-60%，部分競爭抑制率<20%，完全競爭，如果有一個方向達到這個標準，則認為兩個抗體有競爭抑制率>60%，完全不競爭義翹神州案例分享3：高通量BLI在納米抗體（VHH）親和力成熟中的應用篩選策略：目標：親和力提升至少5倍野生型抗體：納米抗體VHH-Fc項目背景：強陽性上清親和力KD檢測二抗抗原VHFc納米抗體VHH-Fc上清ELISA上清bindingBLI上清rankingVHFcAgProteinAsensorAg表達純化義翹神州Kakd(1/s)上清篩選結果純化抗體鑒定親和力提高一個數量級案例分享3：高通量BLI在納米抗體（VHH）親和力成熟中的應用Response(nm)Time(sec)野生型VHHResponse(nm)Time(sec)KD=1.18E-08MmAb-63Response(nm)Time(sec)KD=1.22E-09M義翹神州案例分享4：高通量BLI在抗體表位分析中的應用項目背景：針對23株鼠單抗進行表位分析注：1.需要樣品量較大，因為要用到飽和濃度。2.盡量選擇固化高度（飽和信號）相近的抗體比較。

先檢測1（ligand）與2和3（analyte）間單獨的相互作用2需要與1結合比較強2樣品需要飽和

比較3在有無2的情況下的信號表位分析方法義翹神州

MAb16MAb6MAb19MAb22MAb17MAb9MAb15MAb5MAb1MAb3MAb18MAb10MAb21MAb20MAb7MAb4MAb12MAb13MAb8MAb14MAb2MAb11MAb23MAb16-2.0%2.8%2.8%2.0%82.2%78.1%97.0%102.2%82.1%92.6%104.4%116.2%101.5%178.6%113.9%113.4%127.1%84.9%91.6%92.8%89.0%86.9%MAb66.9%-5.6%3.3%-3.2%87.5%85.6%98.3%102.4%96.4%99.8%108.1%125.6%103.4%185.7%114.2%109.7%128.1%87.1%94.6%94.7%92.7%78.6%MAb195.7%2.4%-4.6%2.6%70.7%73.9%94.9%102.7%81.8%94.0%97.1%117.3%103.0%172.6%111.0%108.9%122.1%2.4%92.7%90.6%94.2%86.9%MAb224.0%1.6%1.1%--3.7%83.5%81.9%102.8%100.6%93.3%98.5%106.4%106.6%96.0%182.5%111.7%109.3%125.5%91.7%92.7%93.3%88.5%87.4%MAb173.3%0.3%4.2%3.7%-91.6%103.8%106.4%109.7%98.1%107.5%106.3%126.4%114.2%207.8%124.2%118.8%127.0%103.5%98.3%103.5%96.3%101.0%MAb992.5%86.1%78.5%88.7%79.6%-12.9%18.2%25.3%16.8%14.7%2.7%27.3%78.4%115.3%116.0%114.4%131.6%105.3%105.0%104.0%101.1%80.9%MAb1581.6%79.2%73.9%79.3%76.7%9.7%-12.3%10.6%9.3%9.3%13.8%17.8%83.3%115.8%120.4%114.9%135.1%87.3%100.4%93.5%96.1%76.2%MAb580.1%73.1%71.0%86.4%64.3%3.4%1.6%-4.1%0.1%3.2%1.9%5.8%3.5%92.0%100.8%106.2%103.4%81.5%86.3%84.9%70.6%66.1%MAb168.8%60.7%70.6%86.1%55.8%3.5%-0.04%2.6%--0.4%-0.2%-0.8%7.6%3.1%84.2%93.9%84.1%103.0%71.6%69.9%79.5%67.8%62.8%MAb373.7%67.2%72.1%83.8%62.8%8.7%-0.5%0.3%5.9%-5.8%9.4%11.3%7.0%88.3%99.2%98.3%106.4%75.0%80.6%83.5%78.9%63.9%MAb1869.2%70.1%69.7%84.7%67.0%5.1%0.5%2.1%3.1%1.1%-3.7%7.4%5.3%92.0%99.6%90.8%104.2%80.5%78.3%81.9%79.8%78.4%MAb1073.4%67.9%70.5%82.2%64.1%6.2%2.6%2.7%1.7%2.6%-0.4%-6.7%2.4%80.9%88.7%92.1%104.6%70.9%74.6%75.4%75.2%56.8%MAb2152.1%51.9%59.8%61.0%53.9%1.0%-0.8%-2.5%-1.1%-2.3%-0.1%-0.9%-6.1%67.6%78.8%78.7%93.4%60.1%61.5%60.2%61.6%62.5%MAb2073.1%66.1%71.4%74.0%64.3%41.8%47.5%-0.5%-1.1%-1.5%0.3%-0.3%3.4%-92.0%94.5%95.6%111.2%79.9%81.0%77.0%85.0%80.5%MAb730.0%31.0%33.2%39.6%29.3%2.9%1.2%2.2%2.3%2.1%4.2%1.6%5.5%4.2%-44.3%43.1%44.2%1.6%2.6%3.1%1.9%3.5%MAb464.6%68.5%67.2%70.0%62.6%69.6%73.8%78.9%80.0%72.7%71.6%84.8%97.4%83.1%147.8%-10.0%7.6%75.8%75.5%76.6%65.9%55.0%MAb1264.6%64.1%60.7%65.2%56.9%56.9%58.6%73.2%78.6%67.6%71.4%82.0%96.2%76.9%129.9%6.1%-12.6%82.0%69.9%71.1%71.0%53.3%MAb1363.7%59.1%62.1%64.8%59.9%53.5%56.0%65.3%69.8%62.8%70.0%73.8%90.1%77.2%118.8%10.6%8.8%-73.8%63.7%64.6%61.3%49.2%MAb878.4%72.1%72.0%79.1%59.4%75.9%75.6%79.9%86.1%75.2%79.7%91.8%107.1%96.2%89.3%102.2%101.0%110.0%-3.9%5.3%0.5%3.0%MAb1462.7%61.7%75.8%80.9%71.4%66.9%64.0%72.1%79.0%68.7%82.8%83.3%103.1%100.9%77.0%96.7%90.1%100.9%-