動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞1干細(xì)胞的有關(guān)特性一、形態(tài)和生化特征形態(tài)上通常呈圓形或橢圓形、體積小、核質(zhì)比例較大干細(xì)胞具有較高的端粒酶活性，具有較強(qiáng)的增殖能力二、增殖緩慢性－－利于細(xì)胞對(duì)特定的外界信號(hào)作出反應(yīng)，以決定進(jìn)行增殖還是進(jìn)入特定的分化程序。還可減少基因發(fā)生突變的可能性。自穩(wěn)性－－干細(xì)胞自我更新維持自身數(shù)目的恒定。這是干細(xì)胞區(qū)別于腫瘤細(xì)胞的本質(zhì)特征。2干細(xì)胞（stemcell）是一類具有自我復(fù)制能力（self-renewing）的多潛能細(xì)胞，它可以分化成多種功能細(xì)胞。根據(jù)其發(fā)育階段，可以分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。根據(jù)其分化潛能的大小，可分為：①全能干細(xì)胞。它具有形成完整個(gè)體的分化潛能，可以無(wú)限制地增殖，能分化成成體的200多種細(xì)胞類型，從而可以形成任何組織和器官。胚胎干細(xì)胞屬于此類。②多能干細(xì)胞。它具有分化成多種細(xì)胞組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，如間充質(zhì)干細(xì)胞。③定向干細(xì)胞。只能向一種或密切相關(guān)的細(xì)胞類型分化，如造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等。三、分化潛能與干細(xì)胞的種類3干

細(xì)

胞45干細(xì)胞的分裂6正常干細(xì)胞發(fā)育78胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞包括ES細(xì)胞（embryonicstemcell）和EG細(xì)胞（embryonicgermcell）。ES細(xì)胞：當(dāng)受精卵分裂發(fā)育至囊胚期，胚胎細(xì)胞在囊胚腔內(nèi)成團(tuán)存在，稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmass）。將細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞分離出來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，在一定條件下這些細(xì)胞可在體外“無(wú)限期”地增殖傳代，同時(shí)還保持其全能性。EG細(xì)胞是由原始生殖細(xì)胞（primordialgermcell,PGC）培養(yǎng)分離得到。ES是一種高度分化細(xì)胞，具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官，包括生殖細(xì)胞。ES細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)成為永久性細(xì)胞系，人們可以在體外對(duì)其進(jìn)行各種遺傳操作，通過(guò)核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。9胚胎干細(xì)胞10胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES）是已知的分化潛能最廣的一類干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的研究歷史可以追溯到1958年，Stevens等將小鼠附植體胚胎異位移植到腎臟的被膜下，得到一種能夠連續(xù)傳代的多潛能細(xì)胞系，稱為胚胎癌細(xì)胞（embryoniccarcinomacell）或畸胎瘤（teratocarcinomacell），簡(jiǎn)稱EC細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞系建立于1981年。英國(guó)劍橋大學(xué)的Evans和Kaufman，美國(guó)加州大學(xué)的Martin分別成功地分離和體外培養(yǎng)了小鼠的胚胎干細(xì)胞。此后，一系列其它動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞相繼分離和建系，如金黃地鼠、大鼠（1988）、豬（1990）、牛（1992）、水貂和兔（1993）等。

1995年Thomson等從恒河猴的囊胚中分離建立了世界上第一株靈長(zhǎng)類動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的研究概況111998年他們?cè)诮㈧`長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞取得成功的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，從接受不孕癥治療的夫婦所捐贈(zèng)的處于囊胚階段的早期胚胎中分離出人的ES細(xì)胞。同年，Gearhart從選擇性流產(chǎn)所得到的胚胎生殖腺中分離出人的EG細(xì)胞。2000年，澳大利亞的Reubinoff和新加坡的體外受精專家合作，又成功地從人胚泡中建立了8株未分化的人胚胎干細(xì)胞，并在體外分化實(shí)驗(yàn)中成功地得到了神經(jīng)干細(xì)胞。12胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特征：a．形態(tài)學(xué)特征在培養(yǎng)基中，圓形或卵圓形的細(xì)胞單層或多層堆積，呈島狀或巢狀，細(xì)胞界限不清楚；細(xì)胞體積小，核大，胞漿少，有一個(gè)或多個(gè)核仁。b．發(fā)育全能性標(biāo)志具有發(fā)育階段特異性胚胎抗原（stage-specificembryonicantigen，SSEA）；堿性磷酸酶（AKP）活性較高；OCT-4基因表達(dá)，OCT-4基因是一種發(fā)育全能性的標(biāo)志基因；端粒酶活性很高。13胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性（P142－143）1ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與核型2ES細(xì)胞的生長(zhǎng)特性3ES細(xì)胞的高度分化潛能14ES細(xì)胞的全能性表現(xiàn)：1形成畸胚瘤，將ES細(xì)胞注入同源動(dòng)物皮下可形成畸胚瘤，包括三個(gè)胚層細(xì)胞。2形成類胚體，將ES細(xì)胞在非黏附底物中懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目，能夠生成類胚體，是一個(gè)與畸胚瘤相似的多種系混雜的集合體，具有三個(gè)胚層組織。3直系分化，通過(guò)控制ES細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境或遺傳操縱特定基因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞。如NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞可分化為神經(jīng)細(xì)胞。4形成嵌合體，將ES細(xì)胞注射到同種動(dòng)物囊胚腔中后，可以形成嵌合體。15ES細(xì)胞的調(diào)控ES細(xì)胞的調(diào)控是指給出適當(dāng)?shù)囊蜃訔l件，對(duì)ES細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)行調(diào)控，使之向指定的方向發(fā)展。一內(nèi)源性調(diào)控1細(xì)胞內(nèi)蛋白對(duì)ES細(xì)胞分裂的調(diào)控ES細(xì)胞分裂可能產(chǎn)生新的干細(xì)胞或分化的功能細(xì)胞。這種分化的不對(duì)稱性是由于細(xì)胞本身成分的不均等分配和周圍環(huán)境的作用造成的。細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是細(xì)胞骨架成分，對(duì)細(xì)胞的發(fā)育非常重要。2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控脊椎動(dòng)物中轉(zhuǎn)錄因子對(duì)干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)非常重要。胚胎干細(xì)胞的發(fā)生中，轉(zhuǎn)錄因子OCT4是必需的。OCT4缺失突變的胚胎只能發(fā)育到囊胚期，其內(nèi)部細(xì)胞不能發(fā)育成內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)。白血病抑制因子（LIF）對(duì)培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞的自我更新有促進(jìn)作用，而對(duì)人的成體干細(xì)胞無(wú)作用，說(shuō)明不同屬間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是不完全一致的。16二、外源性調(diào)控1分泌因子間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌許多因子，維持干細(xì)胞的增殖、分化和存活。有兩類因子在不同組織甚至不同種屬中都發(fā)揮重要作用，即TGFβ家族和Wnt信號(hào)通路，如TGF家族中至少有兩個(gè)成員能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴干細(xì)胞的分化。Wnt的作用機(jī)制是通過(guò)阻止β-Catenin分解從而激活Tcf/Lef介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)干細(xì)胞的分化。2膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間的相互作用有些信號(hào)是通過(guò)細(xì)胞－細(xì)胞的直接接觸起作用的。β-Catenin就是一種介導(dǎo)細(xì)胞黏附連接的結(jié)構(gòu)成分。穿膜蛋白Notch及其配體Delta或Jagged也對(duì)干細(xì)胞分化有重要影響。3整合素與細(xì)胞外基質(zhì)整合素家族是介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附的最主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細(xì)胞的非分化增殖提供了適當(dāng)?shù)奈h(huán)境。如β1整合素喪失功能時(shí)，上皮干細(xì)胞逃脫了微環(huán)境的制約，分化成角質(zhì)細(xì)胞。17ES細(xì)胞的鑒定1形態(tài)學(xué)檢測(cè)體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)為圓形或扁圓形，均呈單層或多層密集堆積而形成島狀、巢狀群體生長(zhǎng)狀態(tài)。2堿性磷酸酶（AKP）活性的檢測(cè)堿性磷酸酶在早期胚胎的干細(xì)胞中含量較高，而在已分化的細(xì)胞中活性明顯降低。ES細(xì)胞表面可以檢測(cè)到特異性表面抗原（SSEA-1）,SSEA-1常作為ES細(xì)胞鑒定的一個(gè)標(biāo)志。體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)將ES細(xì)胞懸液化注射給同種動(dòng)物皮下，制作切片染色可觀察到畸胎瘤的形成。185體外分化實(shí)驗(yàn)

將ES細(xì)胞懸液培養(yǎng)形成囊狀簡(jiǎn)單胚體或類胚體這類細(xì)胞多為自發(fā)分化，隨培養(yǎng)條件和細(xì)胞密度而有所不同。6核型分析主要是檢測(cè)已建立的ES細(xì)胞是否具有二倍體正常的核型，可用核型分析加以檢驗(yàn)。7OCT活性檢測(cè)

OCT基因是小鼠胚胎發(fā)育早期生殖細(xì)胞譜系以及體外培養(yǎng)的多能干細(xì)胞特異性表達(dá)的一種發(fā)育全能性的標(biāo)志基因。用OCT抗血清和間接免疫熒光法可檢測(cè)ES和EG細(xì)胞中OCT基因的表達(dá)產(chǎn)物。19胚胎干細(xì)胞的獲得胚胎干細(xì)胞的來(lái)源為早期胚胎內(nèi)生細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞。哺乳動(dòng)物早期胚胎的發(fā)育屬于調(diào)整型，每個(gè)胚胎細(xì)胞都具有全能性。由胚胎細(xì)胞建立ES細(xì)胞系的原理就是將囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或桑椹胚在體外培養(yǎng)，并設(shè)法阻止其分化。1從早期胚胎的獲得2從原始生殖細(xì)胞中獲取2021胚胎干細(xì)胞的建系過(guò)程1ES細(xì)胞的分離獲得2ES細(xì)胞的分化抑制培養(yǎng)

抑制細(xì)胞分化的手段采用飼養(yǎng)層抑制物使用條件培養(yǎng)基3ES細(xì)胞系的建立及保存22胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)1飼養(yǎng)層培養(yǎng)法2無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)法23胚胎干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化1體外ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的優(yōu)點(diǎn)2ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基本原理3ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的方法24干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程2526胚胎干細(xì)胞生物學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域是運(yùn)用組織工程和基因工程技術(shù)，體外對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，可識(shí)別靶基因，發(fā)現(xiàn)新基因，并可進(jìn)一步改造基因，然后用于體內(nèi)組織缺陷性疾病的細(xì)胞替代治療和基因治療，為臨床應(yīng)用開(kāi)拓新途徑。這部分研究稱為干細(xì)胞工程。胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用前景27

1

動(dòng)物克隆及人類治療性克隆

ES細(xì)胞具有無(wú)限傳代增殖，且不改變其基因型和表現(xiàn)型的特點(diǎn)，以其作為核供體進(jìn)行核移植后在短期內(nèi)可獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個(gè)體。282在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用

利用ES細(xì)胞作為載體，體外定向改造ES細(xì)胞，使得基因的整合數(shù)目、位點(diǎn)、表達(dá)程度和插入基因的穩(wěn)定性及篩選工作等都在細(xì)胞水平上進(jìn)行。這就容易獲得穩(wěn)定、滿意的轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞系。293制備嵌合體動(dòng)物

利用ES細(xì)胞可以獲得具有來(lái)自兩個(gè)或多個(gè)合子體細(xì)胞的個(gè)體，即嵌合體（chimera），又叫鑲嵌體（mosaic）。嵌合體分種內(nèi)和種間嵌合體兩種。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將不同來(lái)源的重要基因轉(zhuǎn)移、組合到嵌合體中，亦即將理想性狀結(jié)合進(jìn)嵌合體，使嵌合體具有多種生物學(xué)功能，甚至產(chǎn)生新的生物學(xué)功能。304、成年個(gè)體的干細(xì)胞研究成體干細(xì)胞研究是干細(xì)胞研究中最激動(dòng)人心的部分。它可以有效地防止組織排斥，可以避免倫理學(xué)、法律系方面的爭(zhēng)論。1.成體干細(xì)胞是否具有胚胎干細(xì)胞那樣的分化潛力？

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了成體干細(xì)胞具有很強(qiáng)的分化能力。如：Recentexperimentsinmicesuggestthatwhenneuralstemcellswereplacedintothebonemarrow,theyappearedtoproduceavarietyofbloodcelltypes.Studieswithratshaveindicatedthatstemcellsfoundinthebonemarrowwereabletoproducelivercells.下邊的幾個(gè)最新的研究成果進(jìn)一步說(shuō)明包括人在內(nèi)的高等生物的成體干細(xì)胞依然有明確的分化能力。31從成年小白鼠未發(fā)育的腦干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧∪饧?xì)胞

AngeloVescovi和GiulioCossu,在theInstituteforStemCellResearchinMilan2000920

他們也用成年人志愿者的神經(jīng)干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了同樣的工作32WithASongInTheirHeads--Birthofnewbraincellsinducedinbirds

33

影響成體干細(xì)胞應(yīng)用的某些因素：

A.當(dāng)前并沒(méi)有在所有人體組織中發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞；

B.成體干細(xì)胞含量極少，很難分離與純化；

C.對(duì)某些病人來(lái)說(shuō)，可能：疾病的進(jìn)程等不到足量干細(xì)胞的培養(yǎng)；病人自身基因組有遺傳缺陷；34ES細(xì)胞研究面臨的難題1、體外培養(yǎng)ES細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是既能快速無(wú)限增殖，又呈未分化狀態(tài)。2、ES細(xì)胞高度未分化，具有形成畸胎瘤的可能性。如何誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化成單一類型的分化細(xì)胞，是至今仍未解決的問(wèn)題。3、ES細(xì)胞真正用于器官克隆與移植仍需要技術(shù)上的突破，因?yàn)槠鞴俚男纬墒且粋€(gè)非常復(fù)雜的三維過(guò)程，很多器官是兩個(gè)不同胚層的組織相互作用而形成的。4、最大的障礙來(lái)自倫理學(xué)，特別是ES細(xì)胞應(yīng)用受到倫理、宗教、法律以及社會(huì)因素的強(qiáng)烈反對(duì)，有些國(guó)家甚至明令禁止進(jìn)行人類ES細(xì)胞研究。35造血干細(xì)胞（hematopoieticstemcell，HSC）主要存在于紅骨髓內(nèi)，是從胚胎卵黃囊上的血島細(xì)胞增殖、分化并遷移而來(lái)。二.造血干細(xì)胞3637造

血

干

細(xì)

胞

的

發(fā)

育38生物學(xué)特性：a.高度的自我復(fù)制能力

HSC的自我復(fù)制能力維持至正常機(jī)體的生命終結(jié)，自我復(fù)制率在正常情況下為50%，即分裂后的子代細(xì)胞只有半數(shù)保持干細(xì)胞的特征，另一半離開(kāi)干細(xì)胞池進(jìn)入增值分化池。如果兩者失去平衡，則會(huì)導(dǎo)致病理性造血。b.多向分化能力

HSC具有多項(xiàng)分化的潛能，能分化成各種血細(xì)胞。c.不均一性

HSC不是單一的細(xì)胞群體，而是由不同發(fā)育階段的干細(xì)胞組成。目前，通過(guò)各種技術(shù)純化的HSC在功能、生物物理特征和表面標(biāo)志上并不完全一致，人們發(fā)現(xiàn)這些方法檢測(cè)出的造血干細(xì)胞往往不是處于同一發(fā)育階段。39HSC的研究不僅推動(dòng)造血理論研究的深入，而且促進(jìn)了血液病學(xué)的發(fā)展。研究證明，相當(dāng)部分的再生障礙性貧血患者HSC的含量低于正常水平，提示HSC數(shù)量減少和質(zhì)量異常是再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制中的重要因素。目前，HSC的移植已成為治療血液病的重要手段。根據(jù)HSC的來(lái)源不同，HSC的移植可分為骨髓移植、外周干細(xì)胞移植、胚胎干細(xì)胞移植和臍HSC移植。由于骨髓中含有豐富的HSC，因此骨髓移植是臨床上最常用的HSC移植方法，用于治療一些一般治療難以奏效、且預(yù)后不良的疾病，如再生障礙性貧血、地中海貧血、白血病和急性放射病等。40近十年的研究表明，在成年哺乳動(dòng)物的腦組織內(nèi)不僅存在神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcell），而且還證實(shí)這些神經(jīng)干細(xì)胞在細(xì)胞因子、激素或環(huán)境因素的調(diào)控下能在體外分裂，并可進(jìn)一步分化成神經(jīng)元或/和膠質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)成年腦組織或脊髓中的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞受損后，這些干細(xì)胞能夠替代，并產(chǎn)生相應(yīng)的功能。神經(jīng)干細(xì)胞也正是因?yàn)樗纳飳W(xué)研究前景和臨床應(yīng)用的巨大潛力，而成為當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱門課題。三.神經(jīng)干細(xì)胞4142神經(jīng)干細(xì)胞通常