化學(xué)品 魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系急性毒性：RTgill-W1細(xì)胞系試驗(yàn) 征求意見(jiàn)稿

4GB/TXXXXX—XXXX化學(xué)品魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系急性毒性：RTgill-W1細(xì)胞系試驗(yàn)本文件描述了化學(xué)品魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系急性毒性：RTgill-W1細(xì)胞系試驗(yàn)方法，包括試驗(yàn)原理、受試物信息、參比物、試驗(yàn)準(zhǔn)備、試驗(yàn)程序、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果評(píng)價(jià)、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、結(jié)果報(bào)告。本文件適用于測(cè)試和評(píng)價(jià)化學(xué)品對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系的急性毒性。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T21852化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇―水）高效液相色譜法試驗(yàn)GB/T21853化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇―水）搖瓶法試驗(yàn)GB/T22052用液體蒸氣壓力計(jì)測(cè)定液體的蒸氣壓力溫度關(guān)系和初始分解溫度的方法GB/T22228工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-1Pa至105Pa范圍內(nèi)的測(cè)定靜態(tài)法GB/T22229工業(yè)用化學(xué)品固體及液體的蒸氣壓在10-3Pa至1Pa范圍內(nèi)的測(cè)定蒸氣壓平衡法GB/T42426化學(xué)品蒸氣壓試驗(yàn)OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.106吸附/解吸（批平衡法Adsorption-DesorptionUsingaBatchEquilibriumMethod）OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.112水中解離常數(shù)（DissociationConstantsinWater）OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.121高效液相色譜法（HPLC）估算土壤和污水污泥的吸附系數(shù)（Koc）[EstimationoftheAdsorptionCoefficient（Koc）onSoilandonSewageSludgeusingHighPerformanceLiquidChromatography（HPLC）]3術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)3.1術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1.1細(xì)胞活力評(píng)估Cellviabilityassessment量化分析處于健康狀態(tài)（即代謝活躍，細(xì)胞膜和細(xì)胞器完好）的細(xì)胞百分比。注：通過(guò)與陰性對(duì)照或溶劑對(duì)照比較來(lái)評(píng)估受試物對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的有3.1.2效應(yīng)濃度effectconcentration；ECx5GB/TXXXXX—XXXX在給定試驗(yàn)周期內(nèi)，與對(duì)照組相比，引起細(xì)胞活力x%變化的受試物的濃度。3.1.3L-15完全培養(yǎng)基L-15completeculturemediumLeibovitzL-15培養(yǎng)基中添加5%胎牛血清和可選抗生素，如0.5%慶大霉素。3.1.4L-15/ex一種無(wú)蛋白培養(yǎng)基，含有與LeibovitzL-15培養(yǎng)基相同的鹽、半乳糖和丙酮酸。3.1.5半數(shù)致死濃度medianlethalconcentration；LC50在給定試驗(yàn)周期內(nèi)，導(dǎo)致50%受試生物死亡的受試物濃度。3.1.6最低可觀察效應(yīng)濃度lowestobservedeffectconcentration；LOEC在給定試驗(yàn)周期內(nèi)，與對(duì)照組相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上對(duì)受試物產(chǎn)生顯著效應(yīng)（p＜0.05）的最低受試物濃度。3.1.7無(wú)可觀察效應(yīng)濃度noobservedeffectconcentration；NOEC在給定試驗(yàn)周期內(nèi)，與對(duì)照組相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上對(duì)受試物未產(chǎn)生顯著效應(yīng)（p≥0.05）的最高受試物濃度。3.1.8RTgill-W1虹鱒魚(yú)（Oncorhynchusmykiss）鰓的永久細(xì)胞系。3.2縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。3,4-DCA：3,4-二氯苯胺（3,4-Dichloroaniline）CFDA-AM：5-羧基熒光素二乙酸乙酰毒性甲酯（5-carboxyfluoresceindiacetateacetoxymethylester）DMSO：二甲基亞砜（DimethylSulfoxide）FBS：胎牛血清（Fetalbovineserum）PBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphatebufferedsaline）4試驗(yàn)原理6GB/TXXXXX—XXXX采用特別設(shè)計(jì)的無(wú)蛋白培養(yǎng)基（L-15/ex）在24孔板中培養(yǎng)融合單層的RTgill-W1細(xì)胞，在黑暗環(huán)境中暴露于受試物中24h。針對(duì)同一組細(xì)胞，采用一組熒光指示染料檢測(cè)三種細(xì)胞活力以表明細(xì)胞毒性，三種染料包括：基于刃天青的染料用于評(píng)估細(xì)胞代謝活性；CFDA-AM用于評(píng)估細(xì)胞膜的完整性；中性紅用于評(píng)估溶酶體膜的完整性。通過(guò)測(cè)定上述染料在培養(yǎng)基中的熒光來(lái)評(píng)估細(xì)胞活力。在暴露開(kāi)始（0h）和結(jié)束（24h）時(shí)對(duì)培養(yǎng)板孔中的暴露培養(yǎng)基進(jìn)行濃度分析，以確定受試物實(shí)測(cè)濃度的幾何平均值。結(jié)果以受試物濃度組相對(duì)未暴露的對(duì)照組中細(xì)胞活力的百分比來(lái)表示。由此得到的濃度-反應(yīng)曲線用于確定導(dǎo)致細(xì)胞活力損失50%的效應(yīng)濃度，即EC50值。也可獲得其他效應(yīng)參數(shù)，如由非線性回歸得到的無(wú)毒濃度，或由假設(shè)檢驗(yàn)（方差分析）得到的最低可觀察濃度（LOEC）或無(wú)可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)。5受試物信息受試物信息包括：a)結(jié)構(gòu)式；b)分子量；c)純度；d)在試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性；e)按照OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.112測(cè)定的水中解離常數(shù)（pKaf)按照OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則No.106或No.121測(cè)定的有機(jī)碳分配系數(shù)（Kocg)按照GB/T21852或GB/T21853方法測(cè)定的正辛醇/水分配系數(shù)（Pow）；h)按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229、GB/T42426方法測(cè)定的蒸氣壓，并計(jì)算亨利常數(shù)，預(yù)測(cè)受試物揮發(fā)可能造成的損失；i)分析方法及相關(guān)參數(shù)（如準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)限、定量限、特異性和線性范圍）。6參比物在開(kāi)展常規(guī)試驗(yàn)之前，應(yīng)以3，4-二氯苯胺（3，4-DCA）為參比物，至少獨(dú)立重復(fù)3次全濃度范圍的試驗(yàn)，以表明實(shí)驗(yàn)室具備相關(guān)技術(shù)能力并檢查RTgill-W1細(xì)胞系的敏感性。7試驗(yàn)準(zhǔn)備7.1儀器設(shè)備除常規(guī)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備外，還需要以下設(shè)備：a)生物安全柜；b)培養(yǎng)箱；c)顯微鏡；d)真空泵e)熒光分析儀；f)離心機(jī)；g)細(xì)胞計(jì)數(shù)器；h)細(xì)胞培養(yǎng)瓶；7GB/TXXXXX—XXXX7.2試劑用于細(xì)胞培養(yǎng)的L-15完全培養(yǎng)基和用于試驗(yàn)的L-15/ex培養(yǎng)基的配制方法見(jiàn)附錄A。7.3細(xì)胞系7.3.1細(xì)胞系的培養(yǎng)和傳代RTgill-W1細(xì)胞系可通過(guò)商售的渠道獲得。細(xì)胞系于19℃±1℃的條件下在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)，不需要提供額外的二氧化碳或蒸汽。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%~100%的融合度時(shí)，進(jìn)行傳代。通常以1:2的比例進(jìn)行傳代，每10d~12d進(jìn)行一次傳代。細(xì)胞在傳代150代后應(yīng)被棄用，解凍傳代數(shù)較低的新細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞系的培養(yǎng)、傳代和凍存方法參考附錄B。7.3.2試驗(yàn)細(xì)胞的準(zhǔn)備從培養(yǎng)瓶中收集約1000萬(wàn)個(gè)RTgill-W1細(xì)胞，除了無(wú)細(xì)胞對(duì)照以外，每孔接種1mL含有35萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的L-15完全培養(yǎng)基。在接種過(guò)程中，應(yīng)注意保持細(xì)胞懸液的均勻性，避免細(xì)胞沉降。鋪板24h后，通過(guò)顯微鏡觀察確認(rèn)細(xì)胞在每個(gè)孔內(nèi)形成融合的單層。如果在孵育24h后尚未融合，可以在化學(xué)暴露前繼續(xù)孵育24h~48h。8試驗(yàn)程序8.1試驗(yàn)條件試驗(yàn)條件如下。a)試驗(yàn)周期：24h。b)溫度：19℃±1℃。c)光照：試驗(yàn)應(yīng)在黑暗中進(jìn)行。8.2試驗(yàn)程序8.2.1試驗(yàn)濃度的選擇試驗(yàn)的主要步驟流程見(jiàn)圖1。最高試驗(yàn)濃度的細(xì)胞活力與陰性對(duì)照或溶劑對(duì)照相比宜為0%。最低試驗(yàn)濃度宜對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生影響，即與陰性對(duì)照或溶劑對(duì)照相比細(xì)胞活力為100%。在正式試驗(yàn)之前進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，從而選擇適當(dāng)?shù)臐舛确秶?。預(yù)試驗(yàn)與正式試驗(yàn)相似，但設(shè)置濃度從受試物的水溶解度開(kāi)始向下進(jìn)行10倍稀釋。除了參考水溶解度之外，還可根據(jù)公式(1)的定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）來(lái)預(yù)測(cè)EC50，以便在最低預(yù)期（基線）毒性濃度附近選擇測(cè)試范圍。logEC50(mmol/L)=-0.96(±0.09)logKow+1.57(±0.28)………（1）8GB/TXXXXX—XXXX圖1試驗(yàn)的主要步驟流程圖8.2.2細(xì)胞接種每測(cè)試一種受試物需要一塊24孔板，同時(shí)為每批試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照（3,4-DCA）額外準(zhǔn)備一塊單獨(dú)的測(cè)試板。從培養(yǎng)瓶中收集約1000萬(wàn)個(gè)RTgill-W1細(xì)胞，24孔板除無(wú)細(xì)胞對(duì)照外（見(jiàn)圖2），每孔接入1mL含有35萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的L-15完全培養(yǎng)基。在接種過(guò)程中，應(yīng)注意保持細(xì)胞懸液的均勻性，避免細(xì)胞9GB/TXXXXX—XXXX沉降。鋪板24h后，通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察，細(xì)胞應(yīng)在每個(gè)孔內(nèi)形成一個(gè)融合的單層（圖3）。如果在孵育24h后尚未達(dá)到融合，可以繼續(xù)孵育24h~48h。圖2細(xì)胞接種到24孔板的移液方案示意圖（每孔接種體積1mL）圖3RTgill-W1細(xì)胞的融合單層圖8.2.3試驗(yàn)溶液制備8.2.3.1陽(yáng)性對(duì)照和受試物貯備液的制備使用DMSO作為溶劑時(shí)，3，4-DCA貯備液的濃度應(yīng)為最終暴露濃度的200倍，使試驗(yàn)溶液中有機(jī)溶劑的濃度不高于0.05mL/L。3,4-DCA的最高暴露濃度為100mg/L，以2倍間隔系數(shù)設(shè)置6個(gè)濃度，使孔中的暴露濃度為100、50、25、12.5,6.25和3.13mg/L。因此，制備20g/L的DMSO貯備液，并以此為起點(diǎn)用DMSO連續(xù)稀釋獲得各濃度的貯備液。應(yīng)在試驗(yàn)當(dāng)天制備3,4-DCA的系列貯備液。按照與陽(yáng)性對(duì)照相同的程序準(zhǔn)備受試物的有機(jī)溶劑貯備液。設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)濃度，稀釋系數(shù)不應(yīng)超過(guò)2.5。對(duì)于難測(cè)試物質(zhì),可參考OECDNo.23采用合適的方法配制貯備液。為了降低試驗(yàn)操作造成的化學(xué)損GB/TXXXXX—XXXX失和生物污染的風(fēng)險(xiǎn)(如長(zhǎng)時(shí)間攪拌），可使用有機(jī)溶劑（如DMSO、甲醇或乙醇）配制貯備液。若不使用有機(jī)溶劑，受試物應(yīng)在無(wú)菌條件下直接溶解于L-15/ex中，獲得濃度合適的受試物貯備液。8.2.3.2陽(yáng)性對(duì)照和受試物試驗(yàn)溶液的制備在無(wú)菌條件下用L-15/ex稀釋貯備液制備試驗(yàn)溶液。在使用有機(jī)溶劑的情況下，將已經(jīng)梯度稀釋的貯備液以1：200進(jìn)行稀釋。在以L-15/ex為溶劑的情況下，用L-15/ex連續(xù)稀釋貯備液至設(shè)置濃度。試驗(yàn)溶液應(yīng)在細(xì)胞暴露前新鮮制備。8.2.4細(xì)胞暴露鋪板24h后，通過(guò)顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，細(xì)胞應(yīng)在每個(gè)孔內(nèi)形成融合的單層。移除L-15完全培養(yǎng)基，用1mLL-15/ex仔細(xì)清洗所有孔，注意不要干擾細(xì)胞層。移除L-15/ex，然后分別加入2.5mL暴露介質(zhì)（圖4A1孔加入濃度最高的試驗(yàn)溶液（C1A2和A3孔只加入L-15/ex；A4至D6孔在3個(gè)平行孔中加入各濃度試驗(yàn)溶液。加入暴露介質(zhì)后，立即從對(duì)照和各濃度的三個(gè)平行孔中轉(zhuǎn)移500μL暴露介質(zhì)到預(yù)先準(zhǔn)備的取樣瓶中。用粘合箔或其他蓋子覆蓋多孔板，關(guān)閉蓋子，于19℃±1℃的黑暗條件下孵育24h。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。（A）使用有機(jī)溶劑時(shí)的24孔板布局（B）不使用有機(jī)溶劑時(shí)的24孔板布局圖4細(xì)胞暴露時(shí)的24孔板布局圖8.2.5細(xì)胞活力測(cè)定暴露結(jié)束后，從每孔中取500μL的暴露介質(zhì)至各取樣瓶中進(jìn)行化學(xué)分析。移除剩余的暴露溶液，用1mLPBS仔細(xì)清洗每個(gè)孔，注意不要干擾細(xì)胞層。對(duì)細(xì)胞的損傷程度進(jìn)行觀察。圖5中展示了暴露于陽(yáng)性對(duì)照3,4-DCA中的細(xì)胞不同程度的損傷。移除PBS后，向每孔中加入400μL刃天青/CFDA-AM工作溶液。在19℃±1℃黑暗中孵育30min后，用熒光分析儀讀取刃天青染料的熒光(激發(fā)波長(zhǎng)：530nm，發(fā)射波長(zhǎng)：595nm)，其后測(cè)定CFDA-AM的熒光(激發(fā)波長(zhǎng)：493nm，發(fā)射波長(zhǎng)：541nm)作為原始熒光單位。移除刃天青/CFDAAM工作溶液，每孔添加400μL的中性紅工作溶液。在19℃±1℃的黑暗中孵育60min后，移除中性紅工作溶液，每孔用400μL固定液洗滌。移除固定液，每孔加入400μL提取液。平板在室溫下孵育10min，同時(shí)置于平板搖床上輕輕搖動(dòng)，然后用熒光分析儀測(cè)定中性紅的熒光(激發(fā)波長(zhǎng)：530nm，發(fā)射波長(zhǎng)：645nm)作為原始熒光單位。GB/TXXXXX—XXXXa)陰性對(duì)照（100%代謝活性）b)溶劑對(duì)照（100%代謝活性）c)100mg/L3,4-DCA（2%代謝活性)d)50mg/L3,4-DCA（12%代謝活性)e)25mg/L3,4-DCA（64%代謝活性）f)12.5mg/L3,4-DCA（81%代謝活性）g)6.25mg/L3,4-DCA（91%代謝活性h)3.13mg/L3,4-DCA（96%代謝活性）圖5RTgill-W1細(xì)胞在陽(yáng)性對(duì)照3,4-DCA中暴露24h后不同程度損傷的圖片GB/TXXXXX—XXXX8.2.6濃度分析在暴露期開(kāi)始（0h）和結(jié)束（24h）時(shí)對(duì)細(xì)胞暴露介質(zhì)進(jìn)行取樣，并對(duì)受試物濃度進(jìn)行定量分析，以確定暴露濃度的幾何平均值。在特殊情況下，如受試物不穩(wěn)定且濃度在4h或更短時(shí)間內(nèi)急劇下降時(shí)，暴露時(shí)間可減少至4h。此時(shí)，暴露介質(zhì)將在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(4h)取樣，隨后立即評(píng)估細(xì)胞活力。提前準(zhǔn)備所需數(shù)量的取樣瓶，可以根據(jù)分析方案預(yù)裝入溶劑。每個(gè)濃度的所有三個(gè)平行孔都應(yīng)取樣。兩個(gè)樣品用于濃度分析，第三個(gè)樣品作為備份，僅在意外情況下使用(如分析儀器故障或兩個(gè)重復(fù)之間存在較大差異)。也可對(duì)三個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行分析。9數(shù)據(jù)分析和結(jié)果評(píng)價(jià)9.1數(shù)據(jù)處理利用獲得的原始熒光單位計(jì)算毒性，統(tǒng)計(jì)與對(duì)照組相比細(xì)胞活力的百分比。如果將受試物溶解在有機(jī)溶劑中，則使用溶劑對(duì)照作為參照。如果受試物溶解在不含有有機(jī)溶劑的L-15/ex中，使用陰性對(duì)照作為參照。細(xì)胞活力的計(jì)算方法如下。a)測(cè)試板每孔的熒光單位減去相應(yīng)無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔的平均熒光單位。b)計(jì)算試驗(yàn)濃度的每個(gè)平行孔與各自相應(yīng)對(duì)照組的細(xì)胞活力百分比。將對(duì)照組熒光單位的平均值設(shè)為100%（表示100%的細(xì)胞存活），細(xì)胞活力計(jì)算如公式（2）所示。V=×100………（2）式中：V——細(xì)胞活力；fs——受試物孔的熒光單位；fc——相應(yīng)對(duì)照組熒光單位的平均值。c)計(jì)算各試驗(yàn)濃度下細(xì)胞活力的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并利用細(xì)胞活力進(jìn)行濃度-反應(yīng)曲線分析。9.2數(shù)據(jù)分析以受試物實(shí)測(cè)濃度的幾何平均值作為各濃度組中三個(gè)平行孔的共同暴露濃度。A1孔（無(wú)細(xì)胞）的濃度可作為非生物化學(xué)損失的參考。如果含有細(xì)胞的孔在暴露結(jié)束時(shí)無(wú)法檢測(cè)到受試物，可參考OECDNo.23以定量限的1/2進(jìn)行計(jì)算。以受試物實(shí)測(cè)濃度的幾何平均值作為x軸，細(xì)胞活力的百分比為y軸，繪制非線性回歸S型濃度-反應(yīng)曲線，設(shè)置最低(0.0)和最高(100.0)的約束條件。使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法基于濃度-反應(yīng)曲線計(jì)算EC50值，可通過(guò)濃度-響應(yīng)曲線確定NOEC和LOEC?？筛鶕?jù)細(xì)胞活力數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)魚(yú)類(lèi)急性毒性的LC50。首先應(yīng)報(bào)告試驗(yàn)中所有EC50值，以其中的最低值作為魚(yú)的96h-LC50值。10質(zhì)量保證與質(zhì)量控制在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)滿足以下條件，試驗(yàn)結(jié)果有效。a)排除自身熒光2個(gè)無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔(一個(gè)含有L-15/ex，另一個(gè)含有最高濃度受試物)的原始熒光數(shù)據(jù)的變化不應(yīng)超過(guò)20%。b)排除溶劑對(duì)照組中的污染GB/TXXXXX—XXXX如使用有機(jī)溶劑溶解受試物，溶劑對(duì)照的細(xì)胞活力降低不應(yīng)超過(guò)陰性對(duì)照的10%。c)陽(yáng)性對(duì)照的平均EC50（基于理論濃度），在以下EC50標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的2.5倍范圍內(nèi)：1)刃天青EC50：43.6mg/L±6.1mg/L(2.5倍SD范圍為：28.4mg/L~58.9mg/L)；2)CFDA-AMEC50：62.5mg/L±18.9mg/L(2.5倍范圍為：15.3mg/L~109.8mg/L)；3)中性紅EC50：58.6mg/L±18.6mg/L(2.5倍范圍為：12.1mg/L~105.0mg/L)。11結(jié)果報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容。a)受試物：——單組分物質(zhì)：物理性狀、水溶解度以及其他相關(guān)的物理化學(xué)性質(zhì)；化學(xué)標(biāo)識(shí)，如國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）名稱(chēng)或CAS名稱(chēng)，CAS號(hào)，簡(jiǎn)化分子線性輸入規(guī)范（SMILES）碼或國(guó)際化合物標(biāo)識(shí)（InChI）碼，結(jié)構(gòu)式，純度等信息，在適當(dāng)情況下提供雜質(zhì)的化學(xué)鑒別信——多組分物質(zhì)、不明復(fù)雜物質(zhì)（UVCB）和混合物：宜盡可能提供各組分的化學(xué)鑒別信息（同單組分物質(zhì)）、含量和相關(guān)的物理化學(xué)特性；——儲(chǔ)存條件和穩(wěn)定性。b)試驗(yàn)生物：細(xì)胞系的來(lái)源、傳代數(shù)和融合水平。c)陰性/溶劑對(duì)照：——化學(xué)標(biāo)識(shí)，如國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）名稱(chēng)或CAS名稱(chēng)，CAS號(hào)，簡(jiǎn)化分子線性輸入規(guī)范（SMILES）碼或國(guó)際化合物標(biāo)識(shí)（InChI）碼，結(jié)構(gòu)式，純度等信息；——供應(yīng)商、訂單號(hào)、批號(hào)；——現(xiàn)有范圍內(nèi)的儲(chǔ)存條件和穩(wěn)定性；——選擇有機(jī)溶劑的理由、暴露介質(zhì)中的最終溶劑濃度以及溶劑與陰性對(duì)照的百分比差。d)陽(yáng)性對(duì)照：——供應(yīng)商、訂單號(hào)、批號(hào)；——純度、雜質(zhì)的化學(xué)特性（如可行）；——每種細(xì)胞活力的EC50值。e)試驗(yàn)條件：——試驗(yàn)前接種細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法和為確保細(xì)胞數(shù)均勻分布所采取的措施；——使用的熒光分析儀(如型號(hào)），包括儀器設(shè)置；——貯備液和試驗(yàn)溶液的制備方法；——試驗(yàn)濃度、試驗(yàn)程序和暴露時(shí)間（如不同于推薦值）；——受試物濃度的分析方法及相關(guān)參數(shù)（如準(zhǔn)確度、線性范圍、檢測(cè)限和定量限）。f)試驗(yàn)結(jié)果：——暴露開(kāi)始和結(jié)束時(shí)受試物的實(shí)測(cè)濃度及其幾何平均值；——每個(gè)試驗(yàn)濃度的細(xì)胞活力的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差；——EC50的計(jì)算方法；——受試物和陽(yáng)性對(duì)照的EC50值及其95%置信區(qū)間；——細(xì)胞活力的濃度-反應(yīng)曲線圖；——試驗(yàn)過(guò)程中可能影響結(jié)果的事件；——應(yīng)報(bào)告對(duì)本文件的所有偏離及相關(guān)解釋。GB/TXXXXX—XXXX試驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的配制A.1細(xì)胞培養(yǎng)基的配制L-15完全培養(yǎng)基的配制方法見(jiàn)表A.1。表A.1L-15完全培養(yǎng)基的配制組分添加量LeibovitzL-15培養(yǎng)基FBS慶大霉素500mL25mL2.5mLL-15完全培養(yǎng)基可于4℃條件下最長(zhǎng)保存3個(gè)月。也可在不添加抗生素的情況下配制培養(yǎng)基。A.2試驗(yàn)培養(yǎng)基的配制L-15/ex貯備液和培養(yǎng)基的配制方法見(jiàn)表A.2和表A.3。表A.2L-15/ex貯備液的配制試劑添加量保存條件和時(shí)間鹽溶液A80gNaCl4.0gKCl0.98gMgSO40.94gMgCl2用去離子水定容至600mL高溫高壓滅菌室溫保存6個(gè)月鹽溶液B1.4gCaCl2用去離子水定容至100mL高溫高壓滅菌室溫保存6個(gè)月鹽溶液C1.9gNa2HPO40.6gKH2PO4用去離子水定容至300mL高溫高壓滅菌室溫保存6個(gè)月半乳糖溶液9.0g半乳糖用去離子水定容至100mL過(guò)濾滅菌（0.2μm）分裝為12mL-20℃保存6個(gè)月丙酮酸鈉溶液5.5g丙酮酸鈉用去離子水定容至100mL過(guò)濾滅菌（0.2μm）分裝為12mL-20℃保存6個(gè)月GB/TXXXXX—XXXX表A.3L-15/ex的配制組分添加量鹽溶液A鹽溶液B鹽溶液C半乳糖溶液丙酮酸鈉溶液60mL30mL用已滅菌的去離子水定溶至1000mL，在室溫下最長(zhǎng)保存3個(gè)月。A.3細(xì)胞活力測(cè)定試劑的配制將5mg的CFDA-AM溶于2.32mLDMSO中，得到4mmol/L的CFDA-AM貯備液。分裝為200μL后在-20℃下保存。測(cè)定細(xì)胞代謝活性和細(xì)胞膜完整性的刃天青/CFDA-AM工作液于試驗(yàn)當(dāng)天新鮮配制，配制方法見(jiàn)表A.4。表A.4刃天青/CFDA-AM工作液的配制組分添加量PBS刃天青CFDA-AM貯備液11.4mL600μL測(cè)定溶酶體膜完整性所使用的中性紅工作液、固定劑和提取液的配制方法見(jiàn)表A.5。表A.5中性紅工作液、固定劑和提取液的配制試劑組分保存條件和時(shí)間中性紅工作液11.82mLPBS180μL中性紅溶液新鮮制備固定劑5gCaCl26.75mL37%（w/v）甲醛用去離子水定容至1000mL室溫保存6個(gè)月提取液500mL無(wú)水乙醇用去離子水定容至1000mL室溫保存6個(gè)月GB/TXXXXX—XXXXRTgill-W1細(xì)胞的傳代和凍存B.1細(xì)胞的質(zhì)量保證措施記錄細(xì)胞的解凍、傳代、冷凍和支原體檢測(cè)。支原體檢測(cè)：永久性細(xì)胞系是支原體污染的常見(jiàn)目標(biāo)。支原體干擾細(xì)胞周期和細(xì)胞代謝，可能對(duì)細(xì)胞活性試驗(yàn)的敏感性產(chǎn)生影響。因此，須定期（每三個(gè)月一次）檢查支原體。如遇可疑病例（如顯微鏡下異常外觀或檢測(cè)系統(tǒng)敏感性改變立即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。若產(chǎn)生支原體污染，應(yīng)棄除受污染的細(xì)胞，重新解凍一批細(xì)胞。B.2RTgill-W1細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)RTgill-W1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，為單層培養(yǎng)。細(xì)胞系在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于19℃±1℃條件下繁殖，無(wú)需額外的CO2或蒸汽。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%~100%的融合度，即細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面被完全覆蓋時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞傳代。通常按1：2的比例進(jìn)行傳代（1個(gè)培養(yǎng)瓶傳代2個(gè)培養(yǎng)瓶這種條件下細(xì)胞可以每10-12天傳代一次。在達(dá)到150代后，棄除細(xì)胞，解凍傳代數(shù)較低的新細(xì)胞。細(xì)菌、真菌和酵母菌的污染會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁和細(xì)胞死亡/脫落。此時(shí)應(yīng)立即清除所有被污染的培養(yǎng)瓶和相關(guān)的培養(yǎng)基和溶液，并用消毒劑（如70%乙醇或異丙醇）徹底清潔實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所。B.3RTgill-W1的形態(tài)在低密度時(shí)，細(xì)胞呈不規(guī)則的細(xì)長(zhǎng)形狀，當(dāng)達(dá)到融合狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞呈多邊形形狀并緊密排列。細(xì)胞不同時(shí)期的形態(tài)見(jiàn)圖B.1。a）傳代后1天b）傳代后5天c）傳代后12天圖B.1RTgill-W1細(xì)胞不同時(shí)期的形態(tài)B.4細(xì)胞培養(yǎng)的試劑和培養(yǎng)基準(zhǔn)備傳代前解凍胰蛋白酶，將胰蛋白酶、乙二胺四乙酸和L-15完全培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中放置至少1h，使其溫度調(diào)節(jié)至19℃±1℃。L-15完全培養(yǎng)基的配制方法見(jiàn)附表A.2和附表A.3。細(xì)胞冷凍液的配制方法見(jiàn)表B.1。細(xì)胞冷凍液可于-4℃最長(zhǎng)保存3個(gè)月，新鮮配制時(shí)將其溫度調(diào)節(jié)至4℃后再使用。GB/TXXXXX—XXXX表B.1細(xì)胞冷凍液的配制組分添加量L-15完全培養(yǎng)基FBSDMSOB.5RTgill-W1的傳代傳代培養(yǎng)在室溫下進(jìn)行，因此應(yīng)該快速進(jìn)行相關(guān)操作，避免將細(xì)胞暴露在高溫下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間。傳代時(shí)室溫不高于25℃。細(xì)胞傳代的步驟如下：a)在顯微鏡下檢查細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，如達(dá)到融合狀態(tài)即可開(kāi)始傳代；b)吸出培養(yǎng)基；c)緩慢加入1mL乙二胺四乙酸，避免直接滴在細(xì)胞上；d)輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以浸潤(rùn)細(xì)胞；e)吸除乙二胺四乙酸上清液，重復(fù)步驟c、d、e；f)第二次吸除乙二胺四乙酸后，加入0.7mL胰蛋白酶，消化時(shí)間通常小于1min；g)輕輕拍打和晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶來(lái)促進(jìn)細(xì)胞脫離；h)加入5mLL-15完全培養(yǎng)基終止消化；i)分散細(xì)胞團(tuán)塊，輕輕吹打以促進(jìn)附著的細(xì)胞脫落；j)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，在18~