微生物脂肪酶的純化方法概述

PAGE18PAGE2微生物脂肪酶的純化方法概述摘要：脂肪酶是一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品、精細(xì)化工、醫(yī)藥和能源等領(lǐng)域。脂肪酶最主要的來源是通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)。本文綜述了脂肪酶性質(zhì)及應(yīng)用，微生物脂肪酶的常規(guī)純化方法和新型純化方法，并展望了脂肪酶分離純化的研究方向及前景。關(guān)鍵詞：微生物脂肪酶；純化；常規(guī)分離純化技術(shù)；新型分離純化技術(shù)1.脂肪酶概述脂肪酶是一類特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性長鏈脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。同時還催化其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、氨解、酯化、轉(zhuǎn)酯化以及酯類逆向合成反應(yīng)。1.1脂肪酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)在現(xiàn)代生物工程技術(shù)的參與下，人們對脂肪酶的結(jié)構(gòu)研究也不斷深入。研究表明，脂肪酶是一種“絲氨水解酶”。其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特異性氨基酸)相同或相似的一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列，在此基礎(chǔ)上，His、Ser與另一種氨基酸殘基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起構(gòu)成脂肪酶催化活性中心的三元組；從結(jié)構(gòu)功能的角度，脂肪酶中的絲氨酸-OH基既具有底物結(jié)合作用，又具有催化作用。與大多數(shù)酶一樣，脂肪酶的本質(zhì)仍然是蛋白質(zhì)，其氨基酸組成數(shù)目從270-641kd不等，分子量處于25一100kd之間，等電點(diǎn)(Pl)在4-5之間不等。脂肪酶的催化性質(zhì)主要表現(xiàn)在催化甘油三酯的水解、催化酯交換和催化拆分手性化合物三個方面。在催化油脂水解的反應(yīng)中，脂肪酶表現(xiàn)出一定的脂肪酸特異性，其主要催化帶12個碳原子以上的長鏈脂肪酸的甘油三酷，該反應(yīng)可逆。此外，來源不同的脂肪酶在催化油脂水解時還具有明顯的輕基位置特異性。1.2產(chǎn)脂肪酶微生物微生物脂肪酶的發(fā)現(xiàn)是在20世紀(jì)初，而國內(nèi)直到60年代才開始了這方面的研究與開發(fā)，其中具有代表性的報道是，1967年中科院微生物所篩選得到解脂假絲酵母菌株，并于1969年制成酶制劑供應(yīng)市場。與動植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶具有許多優(yōu)點(diǎn):(一)微生物脂肪酶種類多、來源廣、生長周期短；(二)具有比動植物脂肪酶更廣的pH和作用溫度適應(yīng)范圍以及更廣的底物適應(yīng)類型；(三)微生物脂肪酶便于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，同時容易制取高純度制劑。目前，工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假絲酵母、青霉、毛霉、須霉以及假單胞菌等。1.3產(chǎn)脂肪酶微生物的育種在生產(chǎn)實(shí)踐中，提高微生物產(chǎn)脂肪酶能力的方法可采用傳統(tǒng)誘導(dǎo)和現(xiàn)代基因工程兩種方法進(jìn)行微生物育種，從根本上改變微生物的產(chǎn)酶特性，從而獲得穩(wěn)定高產(chǎn)的工程生產(chǎn)菌株。(1)傳統(tǒng)誘變法雖然現(xiàn)代基因工程技術(shù)在微生物育種中已經(jīng)有了相當(dāng)?shù)陌l(fā)展，但由于傳統(tǒng)誘變技術(shù)具有操作簡單快速、成本低和結(jié)果穩(wěn)定有效等優(yōu)點(diǎn)，目前仍然廣泛用于微生物菌種的選育。(2)基因工程法傳統(tǒng)誘變法雖然是一種操作簡單、技術(shù)成熟的好方法，但比起現(xiàn)代基因工程法，在微生物的育種中存在一定的局限，難以獲得突破性進(jìn)展。隨著生物科技的不斷進(jìn)步，基因工程法用于產(chǎn)脂肪酶微生物的育種技術(shù)正逐漸成熟并己經(jīng)用于研究和生產(chǎn)實(shí)踐。目前，基因工程在產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌育種中的應(yīng)用主要是通過克隆相應(yīng)的脂肪酶基因，然后在異源宿主菌中實(shí)現(xiàn)大量表達(dá)。常用的異源宿主主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和曲霉表達(dá)系統(tǒng)三種。其中曲霉表達(dá)系統(tǒng)由于其強(qiáng)大的分泌能力和成熟的發(fā)酵技術(shù)而得到生產(chǎn)者的青睞，并成功地用于生產(chǎn)實(shí)踐。1987年諾維信公司將克隆的柔毛腐質(zhì)霉脂肪酶基因在曲霉菌中大量表達(dá)，其產(chǎn)量提高了1000倍，該公司銷售的Noxozym435.LipozymeRMIM.LipozymeTLIM脂肪酶制劑均是以遺傳改良A.oryzae作為異源表達(dá)宿主菌發(fā)酵生產(chǎn)的。1.4脂肪酶的應(yīng)用作為工業(yè)生產(chǎn)和生活中的常用酶，脂肪酶被廣泛用于食品的增香、脫脂以及防腐等具體工藝。在消除殘余脂肪等具體的皮革工業(yè)生產(chǎn)中，脂肪酶也起著重要的作用?；谔厥獾拇呋再|(zhì)，在醫(yī)藥、造紙工業(yè)中，脂肪酶常有效用于疾病的治療、診斷和新藥品的制備以及‘洽脂’1999)的去除和脫墨等具體實(shí)踐；同時，脂肪酶還用于加酶洗滌劑的制備和部分化妝品的生產(chǎn)。此外，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，脂肪酶在環(huán)保事業(yè)以及生物能源的開發(fā)等有關(guān)行業(yè)中的應(yīng)用也越來越廣泛。1.5微生物脂肪酶純化研究脂肪酶的分離和純化是研究其酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)，是整個脂肪酶研究中很重要的一個環(huán)節(jié)。Rolf等認(rèn)為在脂肪酶的分離純化中，主要存在以下幾個問題：(1)微生物發(fā)酵合成的是包括脂肪酶在內(nèi)的酶的混合物，從而給下游的酶分離純化造成壓力，而且脂肪酶還有可能被蛋白酶分解；(2)脂肪酶不僅對油－水界面，而且對極性較水低的界面都有較高的親和力，這些界面可以不可逆地吸附脂肪酶，使得脂肪酶很容易失活。除了以上兩個因素外，分離純化時間長，回收率低，成本過高也是一個值得關(guān)注的問題。脂肪酶分離純化的過程一般包括預(yù)純化過程和層析分離兩個過程。預(yù)純化過程包括細(xì)胞破碎(胞內(nèi)脂肪酶)、離心或過濾去除菌絲體、超濾濃縮酶液、硫酸銨鹽析或有機(jī)溶劑萃取等步驟。預(yù)純化過程之后，一般再用層析方法進(jìn)一步分離以獲得高純度的脂肪酶。層析方法包括離子交換層析(QSepharose)、凝膠過濾層析(SephacrylS-200SF)、親和層析等方法。一般用酶活回收率、比活力和純化倍數(shù)等指標(biāo)來衡量脂肪酶分離純化的程度。2微生物脂肪酶的純化方法2.1常規(guī)分離純化技術(shù)2.1.1預(yù)分離對于微生物胞外酶，發(fā)酵液經(jīng)離心或過濾除掉細(xì)胞，上清液用超濾、硫酸銨沉淀或有機(jī)溶劑抽提等方法濃縮；胞內(nèi)酶則需進(jìn)行細(xì)胞破碎再分離，大多數(shù)采用硫酸銨沉淀的濃縮方法，也有采用乙醇、丙酮或酸(通常是鹽酸)沉淀的方法。沉淀用于純化早期粗分離，為了獲得更高的純度，還要用凝膠過濾或親和層析等方法進(jìn)行細(xì)分離。硫酸銨濃度會影響純化酶的活力。與層析相比，沉淀工序受非蛋白質(zhì)物質(zhì)干擾的程度較小，而且能夠分離得到大量蛋白質(zhì)。不能忽視發(fā)酵條件的重要性，因?yàn)榘l(fā)酵條件與蛋白質(zhì)純化有關(guān)。培養(yǎng)介質(zhì)的性質(zhì)和抗泡沫劑可影響酶的抽提，而收獲細(xì)胞的時間常決定細(xì)胞壁強(qiáng)度和蛋白水解酶的含量。2.1.2層析酶的常規(guī)分離純化方法有凝膠過濾、離子交換層析、疏水層析和親和層析等，它們的技術(shù)特點(diǎn)及用途比較見表1。單一的層析方法難以達(dá)到理想的分離效果，因此蛋白質(zhì)分離純化中常采用幾種層析聯(lián)合的方法。表1酶的常規(guī)層析純化技術(shù)分離原理分離方法特點(diǎn)用途分子大小電荷凝膠過濾離子交換分辨率適中，分級分離時流速較慢，脫鹽時流速快，容量受樣品體積限制分辨率高，視支持物不同流速可很快；容量很大，不受樣品體積限制適用于純化的后期階段，脫鹽可用于任何階段，特別是步驟銜接時的緩沖液更換最適用于大體積樣品且蛋白純度較低的樣品早期純化，可分批操作疏水極性疏水層析分辨率較高，流速快；容量很大，不受樣品體積限制適用于純化的任何階段，特別適用于離子強(qiáng)度較高的樣品，如沉淀、離子交換后的樣品生物親和性親和層析分辨率較高，流速快；容量視配體可大可小，不受樣品體積限制適用于純化的任何階段，特別是樣品濃度小，雜質(zhì)含量多時，可以減少純化步驟等電點(diǎn)聚焦層析分辨率較高，流速快；容量大，不受樣品體積限制最適用于純化的最后階段純化方法的選擇很大程度上取決于它在整個純化方案中的特殊次序位置。為了獲得最大純化倍數(shù)和回收率，工藝次序及層析分離次序的選擇至關(guān)重要。工藝次序的選擇策略包括:應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元組成一套工藝；應(yīng)將含量多的雜質(zhì)先分離去除；盡早采用高效的層析分離手段；將最昂貴、最費(fèi)時的分離單元放在最后階段。通常先運(yùn)用非特異、低分辨的操作單元，如沉淀、超濾和吸附等，這一階段的主要目的是盡快縮小樣品體積，提高目的蛋白濃度，去除最主要的雜質(zhì)(包括非蛋白質(zhì)類雜質(zhì))，隨后是高分辨的操作單元，如具有高選擇性的離子交換層析和親和層析，而將凝膠過濾層析這類分離規(guī)模小、分離速率慢的操作單元放在最后，這樣可提高分離效益。層析分離次序的選擇同樣重要，一個優(yōu)化的層析次序組合不僅能夠獲得高的純化倍數(shù)和純化方法的選擇很大程度上取決于它在整個純化方案中的特殊次序位置。為了獲得最大純化倍數(shù)和回收率，工藝次序及層析分離次序的選擇至關(guān)重要。工藝次序的選擇策略包括：應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元組成一套工藝；應(yīng)將含量多的雜質(zhì)先分離去除；盡早采用高效的層析分離手段；將最昂貴、最費(fèi)時的分離單元放在最后階段。通常先運(yùn)用非特異、低分辨的操作單元，如沉淀、超濾和吸附等，這一階段的主要目的是盡快縮小樣品體積，提高目的蛋白濃度，去除最主要的雜質(zhì)(包括非蛋白質(zhì)類雜質(zhì))，隨后是高分辨的操作單元，如具有高選擇性的離子交換層析和親和層析，而將凝膠過濾層析這類分離規(guī)模小、分離速率慢的操作單元放在最后，這樣可提高分離效益。層析分離次序的選擇同樣重要，一個優(yōu)化的層析次序組合不僅能夠獲得高的純化倍數(shù)和回收率，而且使分離純化順暢，改變很少的條件即可進(jìn)行各步驟間的銜接。離子交換、疏水層析和親和層析通常可起到蛋白質(zhì)的濃縮效應(yīng)，而凝膠過濾色譜常常使樣品稀釋。在離子交換色譜之后進(jìn)行疏水層析，不必經(jīng)過緩沖液的更換，因?yàn)槎鄶?shù)蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度下與疏水介質(zhì)結(jié)合能力較強(qiáng)，凝膠過濾層析最后進(jìn)行又可以直接過渡到適當(dāng)?shù)木彌_體系中以利產(chǎn)品成型保存。但在包涵體重組蛋白的純化中，凝膠過濾層析可作為首選步驟。如原核基因工程重組細(xì)胞因子的相對分子質(zhì)量大多為15000～20000，而包涵體蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量通常大于30000，因此選用凝膠過濾層析可很容易獲得高純度產(chǎn)品。2.2新穎的分離純化技術(shù)得到回收率30%、總純化倍數(shù)320的蛋白質(zhì)通常需要4～5個純化步驟，常規(guī)的純化方法耗時，得率低。因此，開發(fā)出一些新的分離純化技術(shù)，如膜處理技術(shù)、免疫純化技術(shù)、活性環(huán)氧連接臂作為配體的疏水層析、聚乙二醇-瓊脂糖凝膠和聚乙烯醇作為固相的柱層析、雙水相體系及界面親和層析技術(shù)等。2.2.1膜處理技術(shù)錯流膜過濾中微生物發(fā)酵液以橫過膜表面的方式流動，液流可清掃膜表面的溶質(zhì)層，使溶質(zhì)無法在膜表面處積聚，從而截留微生物細(xì)胞和濃縮含酶發(fā)酵液，在下游處理技術(shù)中常有應(yīng)用。Sztajer等用毛細(xì)管超濾膜純化Pseudomonasfluorescens脂肪酶。他們比較了2種毛細(xì)管超濾膜:內(nèi)徑111mm截斷相對分子質(zhì)量為10000聚丙烯腈(PAN)和聚砜(PS)。通過2種膜的脂肪酶濾液都得到濃縮，尤其是親水的PAN膜，濃縮15倍；PS濃縮3倍。對PS而言，僅觀察到濃縮效果，適合濃縮酶；而PAN除了濃縮，還除去雜蛋白而應(yīng)用于初分離。PAN膜吸附了15%總蛋白和30%總活力，而PS膜吸附30%總蛋白和40%總活力，2種膜損失15%～30%總蛋白和30%～40%總活力。2.2.2免疫純化技術(shù)免疫純化技術(shù)是一種高效選擇性的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。通過一步純化，純化倍數(shù)可達(dá)1000～10000。高特異性的抗體能夠高效區(qū)分相似的抗原，解決常規(guī)方法分離的困難。免疫純化技術(shù)大部分是應(yīng)用單克隆抗體和多克隆抗體，選擇性依賴于單克隆抗體對目標(biāo)蛋白的特異性程度及對雜蛋白的影響。Bandmann等在所有突變體的N末端引入IgG結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建融合蛋白，利用IgG與靶位點(diǎn)特異性結(jié)合的免疫方法純化了Escherichiacoli表達(dá)的脂肪酶突變體角質(zhì)酶。磁性微粒(MMS)是用高分子材料和金屬離子為原料聚合而成的一種以金屬離子為核心、外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒。在液相中，受外加磁場的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分離，無需進(jìn)行離心沉淀。由特異性抗體包埋制備的免疫M(jìn)MS，能與待分離樣品中的抗原結(jié)合形成免疫M(jìn)MS-靶向分子復(fù)合體，通過外加磁場的作用即可與其他成分分離開來。再以適當(dāng)方式使復(fù)合體解離，在磁場吸引下除去游離的免疫M(jìn)MS，即可獲得純化的靶向分子。免疫純化技術(shù)是昂貴的純化技術(shù)，然而，單克隆抗體技術(shù)的推廣和成本的下降加快了免疫純化技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用。2.2.3Queiroz等研究了活化環(huán)氧間隔臂作為配體的Chromobacteriumviscosum脂肪酶疏水層析。研究表明，脂肪酶的吸附量隨流動相鹽離子強(qiáng)度的增強(qiáng)而提高。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的硫酸銨洗脫液可以使所有脂肪酶吸附在柱內(nèi)，經(jīng)0.01mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，蛋白質(zhì)回收率79%，脂肪酶活性回收率89%。Queiroz等報道聚乙二醇-瓊脂糖疏水層析純Chromobacteriumviscosum脂肪酶。研究表明，脂肪酶的吸附量受鹽、離子強(qiáng)度、pH的影響，不受聚乙二醇分子質(zhì)量的影響。pH為7、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的磷酸鉀鹽緩沖液可以使大部分脂肪酶吸附于柱內(nèi)，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液具有洗脫回收75%的蛋白和79%的酶活力。Diogo等用聚丙烯-乙二醇瓊脂糖凝膠純Chromobacteriumviscosum脂肪酶，研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酶的吸附量受流動相中鹽濃度的影響，隨流動相中離子強(qiáng)度的增強(qiáng)而增強(qiáng)。流動相pH的改變對脂肪酶吸附量無太大影響，向磷酸鹽緩沖液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的硫酸銨可使柱內(nèi)脂肪酶解吸附。2.2.4以聚乙烯醇作為固定相的柱層析Battinelli等用十二碳酸酯化的聚乙烯醇交聯(lián)的疏水層析純化Candidarugosa商品粗酶制劑，通過逐步增加HEPES-EDTA洗脫緩沖液(pH為7.6)中二甲胺內(nèi)鹽(CHAPS)的濃度來洗脫柱內(nèi)吸附的蛋白質(zhì)。2.2.5雙水相體系萃取當(dāng)兩種水溶性聚合物或者是聚合物與鹽混合時，由于聚合物水溶液的疏水性差，易發(fā)生相分離而形成雙水相。常用的雙水相體系有聚乙二醇(PEG)-葡聚糖(Dex)、PEG-磷酸鉀、PEG-硫酸鎂體系。雙水相體系萃取法是近年發(fā)展起來的具有工業(yè)開發(fā)潛力的分離技術(shù)之一，于1978年由Kula等提出，主要用于酶和蛋白質(zhì)的萃取。PEG和葡聚糖這類無毒聚合物可作為蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定劑，且形成的兩相均含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%以上的水，為蛋白質(zhì)的溶解和抽提提供了適宜的環(huán)境，即使在常溫下操作，蛋白質(zhì)和酶活力也不易損失。所需設(shè)備簡單，僅需一個可使粗提液與兩相系統(tǒng)充分混合及放置的儲罐和一個離心力不高的普通離心機(jī)或使兩相迅速分離的分離器。開始此法僅用于粗提取液的處理，現(xiàn)已用于后處理工藝的精制，即經(jīng)幾次連續(xù)的雙水相抽提，使產(chǎn)品達(dá)到相當(dāng)高的純度；不僅可用于澄清發(fā)酵液的酶分離，而且特別適用于直接從含有固體細(xì)胞的原始發(fā)酵液和帶有細(xì)胞碎片的細(xì)胞勻漿液中提取純化目的酶。此法不要求特殊處理就可與后續(xù)提純步驟相銜接，可使提純工藝更為有效、連續(xù)與經(jīng)濟(jì)。目前已使用雙水相體系萃取法較大規(guī)模地從微生物碎片中分離純化了甲酸脫氫酶等一系列酶，處理量已達(dá)50kg濕細(xì)胞、150g酶蛋白，收率在90%以上，純化倍數(shù)可達(dá)1～8。將生物特異性配基引入到聚合物上，將雙水相體系萃取發(fā)展成雙水相親和萃取，使某種蛋白質(zhì)或酶在某一特定相中的分配更具選擇性。如將Cibacron固定到PEG上形成Cibacron-PEG聚合物，只用兩步抽提就可將酵母磷酸果糖激酶提純58倍。最近又開發(fā)一種由多價兩性丙烯酸共聚物和聚丙烯醇構(gòu)成的雙水相體系，此體系的特點(diǎn)是：價格便宜、無毒、低濃度即可形成兩相，而且結(jié)合等電點(diǎn)沉淀法，可迅速有效地分離純化。2.2.6界面親和層析技術(shù)脂肪酶疏水腔有“開”和“關(guān)”2種構(gòu)象，Bastida等報道在極低離子強(qiáng)度下，商業(yè)皺褶假絲酵母脂肪酶制劑(CRL)以一種完全不同于常規(guī)疏水吸附的方式被疏水載體吸附。此時，其活性中心周圍的疏水腔處于“開”構(gòu)象，具親水-疏水界面特性，CRL據(jù)此被固定在疏水載體上。由于活性中心周圍疏水腔構(gòu)象上的輕微差異是引起立體選擇性差異的主要原因，而該固定化方法又是靠疏水腔與疏水載體表面的親和作用，因此疏水腔構(gòu)象上有輕微差異的同工酶其吸附行為可能不同。據(jù)此設(shè)計出界面親和層析技術(shù)，依據(jù)疏水腔開放程度差異將具有不同立體選擇性的同工酶分離。通過分析同工酶在組成構(gòu)象上的差異，提出了一種通過簡易的選擇吸附步驟同時達(dá)到同工酶分離和固定化目的的新方法。2.2.7反微團(tuán)萃取反微團(tuán)萃取是近年涌現(xiàn)出來的另一種新穎萃取方法。反微團(tuán)又稱反膠束，是指當(dāng)有機(jī)溶劑中加入的表面活性劑濃度超過其臨界值時，表面活性劑便會在有機(jī)溶劑中形成極性頭聚集朝內(nèi)組成的內(nèi)表面，非極性尾伸向外圍有機(jī)溶劑，大小為毫米級的穩(wěn)定聚合體反微團(tuán)。該反微團(tuán)的內(nèi)腔含有水分，在適宜的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)與反微團(tuán)極性頭呈相反的電荷，這種靜電引力使蛋白質(zhì)從水相遷移入有機(jī)溶劑的反微團(tuán)內(nèi)，從而具有溶解諸如蛋白質(zhì)、核酸等極性物質(zhì)的能力，實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑萃取。目前用于反微團(tuán)萃取的主要是陰離子表面活性劑丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉和陽離子表面活性劑氯化三辛基甲基銨，反微團(tuán)萃取常用的有機(jī)溶劑是異辛烷。為了進(jìn)一步提高反微團(tuán)萃取分離的選擇性，可在反微團(tuán)表面活性劑的烷基連接對待分離蛋白質(zhì)具有生物專一性的配基，實(shí)現(xiàn)反微團(tuán)親和萃取分離。2.2.8超臨界流體萃取超臨界流體萃取不用一般的羥基類溶劑，而是在超臨界狀態(tài)下的液態(tài)氣體，如超臨界液態(tài)CO2、甲烷、乙烷、乙烯等。尤以超臨界液態(tài)CO2最受人矚目，因?yàn)槠錈o毒、不燃、無腐蝕、低黏度、價廉且滲入物質(zhì)的能力極強(qiáng)，擴(kuò)散系數(shù)大，可獲得高的傳遞速率，容易從產(chǎn)品中分離。尤其是溶質(zhì)在液體中的溶解度隨溫度和壓力的變化很大，在超臨界液體萃取時，可方便地通過改變溫度和壓力的方法來進(jìn)行萃取或回收劑。2.2.9高效液相層析和高效液相親和層析技術(shù)所有普通的層析技術(shù)都可以高效液相層析(HPLC)的形式加以利用。由于HPLC的柱體積可以加大，可以在同一柱上反復(fù)負(fù)載樣品，所以HPLC技術(shù)在大規(guī)模純化中的應(yīng)用潛力巨大。目前已經(jīng)開發(fā)出以克量級純化蛋白質(zhì)的HPLC技術(shù)，用三咳染料親和純化乳酸脫氫酶。每次層析可處理118g蛋白質(zhì)，得到97mg純酶，收率46%，耗時1h。高效液相親和層析(HPLAC)技術(shù)是將親和層析的高分辨力和HPLC的快速結(jié)合起來的新型分離純化技術(shù)，用于HPLAC的新載體和新配體(特別是單克隆抗體)制備技術(shù)的開發(fā)及推廣，加上自動化操作的設(shè)計，使HPLAC能夠大規(guī)模應(yīng)用于分離工程。最近開發(fā)出亞微米無孔硅膠纖維，在此纖維上涂一層連有NAD配體的葡聚糖，用100gNAD-無孔硅膠纖維的短柱在30min內(nèi)可從部分純化的抽提液中吸附115g乳酸脫氫酶，洗脫后得到純度大于99%的酶產(chǎn)品，且柱可再生使用。用HPLAC大規(guī)模純化酶已處于商業(yè)化突破的邊緣，特別是在用傳統(tǒng)層析技術(shù)不能得到滿意結(jié)果時，更顯出它的優(yōu)越性。2.2.10大規(guī)模電泳技術(shù)2.2.10.1自由流動區(qū)帶電泳自由流動電泳是制備規(guī)模的連續(xù)分離生物分子和顆粒的技術(shù)。在自由流動區(qū)帶電泳(FFZE)技術(shù)中，具有一定pH和電導(dǎo)的電解質(zhì)連續(xù)導(dǎo)入電泳池頂部的層流中，樣品流也連續(xù)注射入電解質(zhì)流中。與電解質(zhì)流垂直的電場按電泳遷移率的差別分離樣品。此法已用于從Candidaboidinii抽提液中分離甲酸脫氫酶、甲醛脫氫酶和甲醇氧化酶，可使蛋白質(zhì)、細(xì)胞顆粒及碎片同時得到分離。如何讓這類裝置適于工業(yè)規(guī)模操作正在研究之中。自由流動區(qū)帶電泳的分辨率不如等電聚焦技術(shù)高，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的等電點(diǎn)接近時，往往僅得到重疊峰。2.2.10.2膜固定pH梯度等電聚焦法用普通凝膠電泳分離純化蛋白質(zhì)，負(fù)載量和回收率較低，而且產(chǎn)品易受未聚合的毒性單體污染。用膜固定pH梯度等電聚焦法制備蛋白質(zhì)，則可克服上述缺點(diǎn)。因?yàn)檫@種電泳法是讓樣品在pH固定的2個凝膠面之間循環(huán)，只有雜質(zhì)可以通過凝膠，目的蛋白質(zhì)由于處于等電點(diǎn)而不進(jìn)入凝膠中，因此，處理樣品的速度快，純度和回收率高。2.2.10.3逆流色譜及置換色譜技術(shù)逆流色譜技術(shù)是一種不采用任何固態(tài)支撐體(如柱填料、吸附劑、親和劑等)的新型液-液分配分離技術(shù)，它完全排除了支撐體對樣品的不可逆吸附、污染、變性、失活等影響。其分離管柱是很長的聚四氟乙烯螺旋形管柱，在使用時，根據(jù)待分離物質(zhì)的理化特征選擇配制一種雙水相溶劑體系，用該體系中的上層或下層作為色譜過程的固定相，首先將此相裝滿管柱，管柱旋轉(zhuǎn)運(yùn)動形成的離心力場支撐柱內(nèi)的液態(tài)固定相；用溶劑體系中的另一層作為流動相，攜帶待分離混合物樣品由泵的壓力推入管柱，樣品隨著流動相快速地穿過兩相對流的整個管柱空間，按其在兩相間分配系數(shù)的差異而將樣品中的各個組分分離。置換色譜作為一種非線性色譜技術(shù)，是指樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力極強(qiáng)的置換劑通入色譜柱，來替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。樣品在置換劑的推動下沿色譜柱前進(jìn)，使樣品中各組分按作用力強(qiáng)弱次序形成一系列前后相鄰的譜帶，并在置換劑的推動下流出色譜柱。3.展望一般工業(yè)級酶對蛋白質(zhì)純度要求不高，純度過高會增加純化成本和降低回收率，但醫(yī)學(xué)用酶純度要求較高，一些理論研究用酶甚至要求純度達(dá)到結(jié)晶級別。在純化酶或蛋白質(zhì)過程中所選用的策略應(yīng)考慮純化量和應(yīng)用純度要求、酶蛋白來源、純化設(shè)備可靠性、重復(fù)性以及經(jīng)濟(jì)性等。酶的分離純化過程是一個相當(dāng)復(fù)雜的生物過程，酶的純化過程中，應(yīng)注意以下幾個方面。①酶活力和純度。酶生物學(xué)活性要求有其特殊的三級空間結(jié)構(gòu)，在酶的提純過程中，首要任務(wù)是要保證酶的空間結(jié)構(gòu)不被破壞，否則，所有的工作都沒有了實(shí)際意義，這就要求我們在酶的提取過程中盡量采取溫和而有效的提取方法，盡量保證酶的“天然結(jié)構(gòu)”，從而保證酶保持其原有活力，脂肪酶的純化過程也是如此。此外，還需保證純化后的酶要有一定的純度，通常以比活力來衡量酶的純度。②保證一定的回收率，酶的純化步驟越多，其回收率就越低，因此，理想的情況就是采取一步純化法，但許多脂肪酶的純化方