乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理乳酸脫氫酶（LDH）是一種氧化還原酶（EC7），廣泛存在于各種生物體中。它催化丙酮酸和乳酸相互轉(zhuǎn)化，同時(shí)伴隨著NADH和NAD+的相互轉(zhuǎn)化。在缺氧條件下，它將糖酵解的最終產(chǎn)物丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。LDH定量是有臨床意義的，因?yàn)槟承㎜DH同工酶的血清水平反映了特定組織中的病理?xiàng)l件。當(dāng)疾病、傷害或有毒物質(zhì)損害組織時(shí)，細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放到血液中。由于乳酸脫氫酶是一種相當(dāng)穩(wěn)定的酶，因此它已被廣泛用于評(píng)估組織和細(xì)胞的損傷和毒性。CheKine?乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）提供了一種簡(jiǎn)單、簡(jiǎn)便的微量法，用于測(cè)定動(dòng)植物組織、細(xì)胞、細(xì)菌、血清（漿）和其他生物液中的乳酸脫氫酶。在此微量法中，LDH將NAD還原為NADH，NADH與WST-8相互作用產(chǎn)生顏色，從而進(jìn)行比色測(cè)定(λmax=450nm）。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)（能測(cè)450nm處的吸光度）·恒溫箱、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備注意：各組分（小管試劑）開蓋前，請(qǐng)先低速離心。1×AssayBuffer:使用前，AssayBuffer(5×)用去離子水稀釋5倍，濃度為1×AssayBuffer，平衡到室溫；4℃保存。Lactate:即用型；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，冰上避光放置；分裝避光保存于-20℃。NAD:即用型；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，冰上避光放置；分裝避光保存于-20℃。WST-8:即用型；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，冰上避光放置；分裝避光保存于-20℃。Enhancer:即用型；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，冰上避光放置；分裝避光保存于-20℃。WorkingReagent：每孔準(zhǔn)備55μL工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用：吸取31μL1×AssayBuffer，8μLNAD,5μLWST-8,1μLEnhancer和10μLLactate混合均勻。LactateDehydrogenaseStandard(20U/mL)：把20μLLactateDehydrogenaseStandard(1KU/mL)用980μL1×AssayBuffer稀釋至20U/mL，混合均勻；冰上避光放置；不稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品分裝保存于-20℃。標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：按下表所示，用1×AssayBuffer將20U/mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為20、16、12、8、4、2、1U/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。序號(hào)20U/mLStandard體積（μL）1×AssayBuffer體積（μL）標(biāo)準(zhǔn)品濃度（U/mL）Std.1200020Std.21604016Std.31208012Std.4801208Std.5401604Std.6201802Std.7101901注意：每次實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)使用新配制的標(biāo)準(zhǔn)品；配制好的標(biāo)準(zhǔn)品需要在4h之內(nèi)使用。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。動(dòng)植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mL預(yù)冷的1×AssayBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心15min，取上清液，置冰上待測(cè)。細(xì)胞（菌）：收集500萬(wàn)細(xì)胞（菌）到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞（菌），離心后棄上清，加入1mL1×AssayBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（菌）5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），然后10,000g，4℃離心15min，取上清液，置冰上待測(cè)。血清、血漿等液體樣本：直接測(cè)定。注意：如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到450nm，可見分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：試劑空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測(cè)定孔（μL）樣本0050Standards0500去離子水5000WorkingReagent505050混勻后，37℃避光孵育30min，測(cè)定450nm處吸光度，空白孔記為A空，標(biāo)準(zhǔn)孔記為A標(biāo)，測(cè)定孔記為A測(cè)。計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)-A空，ΔA標(biāo)=A標(biāo)-A空。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA測(cè)小于0.001可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA測(cè)大于2.0，樣本可用1×AssayBuffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為y軸，ΔA標(biāo)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。LDH含量的計(jì)算將樣本的ΔA測(cè)代入方程得到y(tǒng)值（U/mL）。按樣本鮮重計(jì)算LDH含量(U/g鮮重)=y×V樣÷(W×V樣÷V樣總)×n=y÷W×n按蛋白濃度計(jì)算LDH含量(U/mg蛋白)=y×V樣÷(V樣×Cpr)×n=y÷Cpr×n按樣本體積計(jì)算LDH含量(U/mL)=y×V樣÷V樣×n=y×n按細(xì)胞（菌）數(shù)量計(jì)算LDH含量(U/104cells)=y×V樣÷(500×V樣÷V樣總)×n=y÷500×nV樣：加入樣本體積，0.05mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入1×AssayBuffer體積，1mL；n：樣本稀釋倍數(shù)；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；500：細(xì)胞（菌）總數(shù)，500萬(wàn)。結(jié)果展示典型標(biāo)準(zhǔn)曲線[LDH[LDH](U/mL)ΔAFigure1.LDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1100CheKineTM乳酸