乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量檢測試劑盒實驗解決方案

乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量檢測試劑盒實驗解決方案原理乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶A匯聚成一條共同的代謝通路--三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于ATP合成。此外，乙酰輔酶A是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。CheKine?乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量檢測試劑盒（微量法）提供了一種簡單、靈敏、快速的乙酰輔酶A檢測方法，適合多種類型的樣本，如動/植物組織、細胞等樣本。其檢測原理是蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應，乙酰輔酶A含量和NADH的生成速率成正比，NADH在340nm處有特征吸收峰，通過檢測340nm吸光值的計算既可得到乙酰輔酶A含量。自備耗材·酶標儀或紫外分光光度計（能測340nm處的吸光度）·制冰機，低溫離心機·水浴鍋·96孔UV板或微量石英比色皿·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：ExtractionBuffer有刺激性氣味，建議在通風櫥進行實驗。WorkingReagentⅠ：臨用前配制，對于48T，加入175μLReagentⅣ充分溶解備用；對于96T，加入350μLReagentⅣ充分溶解備用，未用完的試劑-20℃避光分裝保存2周。WorkingReagentⅡ：臨用前配制，對于48T，加入175μLReagentⅣ充分混勻備用；對于96T，加入350μLReagentⅣ充分溶解備用，未用完的試劑4℃避光分裝保存2周。WorkingReagentⅢ：臨用前配制，對于48T，加入15.75mLReagentⅣ充分溶解備用；對于96T，加入31.5mLReagentⅣ充分溶解備用，未用完的試劑-20℃避光分裝保存2周。工作液：臨用前配制，將WorkingReagentI、WorkingReagentⅡ和WorkingReagentⅢ按照1:1:90的比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。Standard(NADH)：臨用前配制，對于48T，加入0.5mL去離子水充分溶解備用；對于96T，加入1mL去離子水充分溶解備用，得8,000nmol/mL標準品，未用完的試劑-20℃避光分裝保存2周。標準曲線設置：按照如下表格，用去離子水將8,000nmol/mL標準品稀釋為3,200、1,600、800、400、200、100、50、0nmol/mL的標準溶液。序號標準液體積去離子水體積（μL）濃度（nmol/mL）Std.1100μL8,000nmol/mL1503,200Std.2100μLofStd.1(3,200nmol/mL)1001,600Std.3100μLofStd.2(1,600nmol/mL)100800Std.4100μLofStd.3(800nmol/mL)100400Std.5100μLofStd.4(400nmol/mL)100200Std.6100μLofStd.5(200nmol/mL)100100Std.7100μLofStd.6(100nmol/mL)10050Std.802000注意：每次實驗都要做一次標準品檢測，制作標曲；稀釋后的標準品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時內(nèi)使用。Std.8即空白孔。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。細胞樣本：收集細胞樣本到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬細胞加入1mLExtractionBuffer，超聲破碎細胞（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復30次），13,000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。組織樣本：稱取0.1g組織，加入1mLExtractionBuffer，進行冰浴勻漿，13,000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3002的蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bradford法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟酶標儀或紫外分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，紫外分光光度計用去離子水調(diào)零。工作液于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育10min。操作表：在96孔UV板或微量石英比色皿中，按照下表進行實驗試劑測定孔（μL）標準孔（μL）樣本250不同濃度的Std.025工作液230230混勻，測定孔立即讀取340nm處20秒的吸光值A1和1分20秒時的吸光值A2，計算ΔA測定=A2-A1，標準孔讀取340nm處1分20秒時的吸光值A標準，ΔA標準=A標準-A空白。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果吸光度大于1.5，可以減少樣本量，如果吸光度太低，可以減少ExtractionBuffer體積。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎剑ㄍ茖н^程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。以ΔA標準為x軸，標準品濃度為y軸，制作標準曲線，得到方程，將ΔA測定帶入方程，得到y(tǒng)值。1.按樣本蛋白濃度計算：乙酰輔酶A含量(nmol/mgprot)=(y×V樣)÷(V樣×Cpr)=y÷Cpr2.按樣本鮮重計算：乙酰輔酶A含量(nmol/g鮮重)=(y×V樣)÷(W×V樣÷V提取)=y÷W3.按細胞密度計算：乙酰輔酶A含量(nmol/104cells)=(y×V樣)÷(500×V樣÷V提取)=y÷500V樣：加入樣本體積，0.025mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；500：細胞總數(shù)，500萬。結(jié)果展示參考標曲如下：Figure1.NADH的標準曲線相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1023CheKine?檸檬酸合酶（CS）活性檢測試劑盒（微量法）KTB1270CheKine?丙酮酸脫氫酶（PDH