回歸課本之新教材的查缺補(bǔ)漏-13基因工程(PCR技術(shù))(解析版)

回歸課本之新教材的查缺補(bǔ)漏-13基因工程（PCR技術(shù)）1、反應(yīng)過(guò)程：PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。2、實(shí)驗(yàn)操作（1）PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、兩種RNA引物、水。（2）實(shí)驗(yàn)操作步驟：①按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液；②將PCR反應(yīng)體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5mL）中；③將微量離心管放到PCR儀中；④設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)；⑤DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。1．關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列相關(guān)敘述正確的是（

）A．PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，但在使用時(shí)需根據(jù)擴(kuò)增的DNA片段以及引物的情況人工設(shè)定合適的溫度B．PCR反應(yīng)體系中的10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液中含有Mg2?、4種脫氧核糖核苷酸等成分C．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水和移液器等在使用前都必須進(jìn)行高壓滅菌處理D．電泳時(shí)，電泳緩沖液不能沒(méi)過(guò)凝膠導(dǎo)致凝膠加樣孔中的電泳樣液流出2．下圖為利用逆轉(zhuǎn)錄方法和PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段的過(guò)程示意圖。據(jù)圖分析，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（

）A．③過(guò)程使用90～95℃的高溫處理是為了讓目的基因充分變性B．⑤過(guò)程使用70～75℃的溫度處理既可以防止DNA變性，還能促進(jìn)子鏈的延伸C．④過(guò)程兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合D．若RNA單鏈中A與U之和占該鏈堿基含量的40%，則其逆轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈DNA中，A與U之和也占該DNA堿基含量的40%1.引物存在的必要性DNA聚合酶只能催化脫氧核糖核苷酸加至已有核酸鏈的游離3'-羥基上，而不能使脫氧核糖核苷酸自身發(fā)生聚合，即它需要引物鏈的存在。引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基互補(bǔ)配對(duì)。細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制以RNA作引物，從新合成的岡崎片段上發(fā)現(xiàn)含有一短暫存在的小的RNA片段附著在5'端這一事實(shí)，可說(shuō)明DNA復(fù)制時(shí)需要RNA引物，這些引物長(zhǎng)5~10bp，現(xiàn)已知RNA引物的合成是由一種特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的。PCR反應(yīng)以DNA作引物。2、引物的作用DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從3'端延伸DNA鏈。當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3'端開(kāi)始延伸DNA鏈。不同的引物可結(jié)合不同的目的基因并進(jìn)行擴(kuò)增。3、設(shè)計(jì)引物的原則引物是根據(jù)目的基因特有的一段已知的核苷酸序列設(shè)計(jì)合成的，能與目的基因的模板鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)特異性地結(jié)合。設(shè)計(jì)引物的主要原則：①引物長(zhǎng)度應(yīng)大于16個(gè)核苷酸，可防止隨機(jī)結(jié)合；②引物與靶序列間的Tm不應(yīng)過(guò)低；③引物不應(yīng)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即不能有4bp以上的回文序列；④2個(gè)引物間不應(yīng)有4bp以上的互補(bǔ)序列或同源序列，在3'端不應(yīng)有任何互補(bǔ)的堿基；⑤引物中堿基的分布盡可能均勻，G+C含量接近50%。4、引物的處理由于引物延伸從3'端開(kāi)始，3'端不能進(jìn)行任何修飾，引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此，可給予修飾而不影響擴(kuò)增特異性。引物5'端修飾包括加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、熒光等。為了使經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的基因能與運(yùn)載體正常結(jié)合，需要在2種引物的5'端添加不同的限制酶的識(shí)別序列。在2種引物的5'端上添加不同的限制酶識(shí)別序列，是為了保證目的基因定向插入運(yùn)載體并可避免目的基因自身環(huán)化。5、引物的特點(diǎn)①引物能與DNA模板通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合;②2種引物之間不能互補(bǔ)配對(duì);③某一引物不能自身折疊出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì);④需要在2種引物的5'端添加不同的限制酶的識(shí)別序列;⑤引物不能太短。3．PCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在基因工程中常用它特異性地快速擴(kuò)增目的基因。下列有關(guān)PCR的敘述錯(cuò)誤的是（

）A．以DNA半保留復(fù)制為原理，反應(yīng)需要在緩沖液中進(jìn)行B．耐高溫的DNA聚合酶只能從引物的5'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸C．反應(yīng)過(guò)程中的每一輪循環(huán)依次包括變性、復(fù)性、延伸三步D．常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物4．新冠病毒包膜表面的S蛋白能識(shí)別人體細(xì)胞膜表面的ACE2受體并導(dǎo)致病毒入侵人體細(xì)胞。制備重組亞單位新冠疫苗的線路是：提取新冠病毒RNA→通過(guò)RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)擴(kuò)增篩選RBD蛋白（S蛋白中真正與ACE2結(jié)合的關(guān)鍵部分）基因（圖1）→構(gòu)建基因表達(dá)載體（圖2）→導(dǎo)入CHO細(xì)胞并培養(yǎng)→提取并純化RBD蛋白→制成疫苗。圖3為利用電泳技術(shù)對(duì)PCR的產(chǎn)物進(jìn)行純度鑒定，1號(hào)泳道為標(biāo)準(zhǔn)（Marker），2號(hào)泳道為陽(yáng)性對(duì)照組，3號(hào)泳道為實(shí)驗(yàn)組。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（

）A．利用RT-PCR技術(shù)獲取RBD蛋白基因時(shí)，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶B．利用PCR擴(kuò)增含有限制酶切點(diǎn)的RBD蛋白基因時(shí)，應(yīng)選擇的引物為引物4、引物5C．2號(hào)泳道是以（提純的）RBD蛋白基因片段為材料所做的陽(yáng)性對(duì)照組D．為提高目的基因和運(yùn)載體的正確連接效率，應(yīng)選擇限制酶EcoRI切割PCR的原理是DNA分子的半保留復(fù)制，所以要根據(jù)DNA分子的2條模板鏈設(shè)計(jì)2種引物。PCR循環(huán)時(shí)需要的引物數(shù)量的計(jì)算有2種方法。方法1∶第n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA數(shù)為2"，根據(jù)DNA分子的半保留復(fù)制可知，需要的引物數(shù)為2n個(gè)，從第1次循環(huán)開(kāi)始，需要引物的個(gè)數(shù)依次為2個(gè)、22個(gè)、23個(gè)……2n個(gè)，故PCR過(guò)程經(jīng)過(guò)n次循環(huán)，需要的引物總個(gè)數(shù)是2+21+22+……+2n=2n+1-2。方法2∶PCR經(jīng)過(guò)n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA數(shù)為2"，一共有2"'條鏈，其中有2條鏈?zhǔn)荄NA母鏈，不含引物，其他的每1條鏈均含1個(gè)引物，并且2種引物的數(shù)量相等，故PCR過(guò)程經(jīng)過(guò)n次循環(huán)，需要的引物總個(gè)數(shù)是2n+1-2，需要某一種引物的總個(gè)數(shù)是（2n+1-2）×1/2=2n-1。2n個(gè)DNA中，一個(gè)DNA由1條母鏈和第1種引物延伸的子鏈組成，另一個(gè)DNA由另一條母鏈和第2種引物延伸的子鏈組成，其他的DNA均由2種引物延伸的2條子鏈組成。5．新冠疫情的快速控制，離不開(kāi)我國(guó)政府的科學(xué)決策和對(duì)新冠病毒（一種RNA病毒）的快速檢測(cè)能力。熒光定量PCR可定量檢測(cè)樣本中DNA含量，其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí)，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針并生成熒光分子，即DNA每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成（如圖），熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)隨時(shí)接收熒光信號(hào)變化。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)稱為循環(huán)閾值（Ct值）。下列說(shuō)法正確的是（

）A．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物種類(lèi)與PCR所用引物種類(lèi)相同B．一個(gè)初始DNA分子經(jīng)過(guò)4次循環(huán)后，得到6個(gè)等長(zhǎng)的DNA分子C．Ct值越大，被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，對(duì)被檢測(cè)者的危害性越大D．最終監(jiān)測(cè)的熒光強(qiáng)度與起始時(shí)反應(yīng)管內(nèi)樣本DNA的含量呈正相關(guān)6．PCR引物的3'端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵，5'端無(wú)嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列，dNTP（四種脫氧核苷酸）是DNA合成的原料。下列相關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是（

）A．圖示環(huán)節(jié)所需的溫度比上一個(gè)環(huán)節(jié)的低B．dNTP作為擴(kuò)增的原料會(huì)依次連接到3'端C．Taq酶催化相鄰的dNTP間形成磷酸二酯鍵D．經(jīng)過(guò)1個(gè)循環(huán)后，獲得的子代DNA的雙鏈中脫氧核苷酸數(shù)量相同PCR的每次循環(huán)可分為3步：1、變性（90~95℃）變性的溫度與目的基因中G+C含量有關(guān)；變性時(shí)間的長(zhǎng)短與目的基因的長(zhǎng)短有關(guān)，目的基因越長(zhǎng)，變性的時(shí)間就越長(zhǎng)。2、復(fù)性（55~60℃）復(fù)性是讓2種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與2條單鏈DNA結(jié)合，復(fù)性的溫度與引物中G+C含量有關(guān)，G-C堿基對(duì)間有3個(gè)氫鍵，A-T堿基對(duì)間只有2個(gè)氫鍵，引物中G+C含量較高，復(fù)性時(shí)溫度就較高;復(fù)性時(shí)間的長(zhǎng)短與引物的長(zhǎng)短有關(guān)，引物越長(zhǎng)，復(fù)性的時(shí)間就越長(zhǎng)。3、延伸（70~75℃）延伸的溫度不能太高，以防止新合成的子鏈DNA與母鏈DNA解聚為單鏈，延伸的溫度也不能太低，是為了保證Taq酶的活性;延伸所需要的時(shí)間長(zhǎng)短與目的基因的長(zhǎng)短有關(guān)，目的基因越長(zhǎng)，延伸所需要的時(shí)間就越長(zhǎng)。7．熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中DNA含量，其原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí)，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)TaqDNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成（如圖）。Ct值（循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。下列說(shuō)法不正確的是（

）A．檢測(cè)新冠病毒時(shí)，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶將新冠病毒RNA轉(zhuǎn)化為cDNAB．PCR每個(gè)循環(huán)包括變性、復(fù)性（引物和模板結(jié)合）、延伸3個(gè)階段C．Ct值越大表示被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險(xiǎn)性更高D．若樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，檢測(cè)結(jié)果可能為陰性8．下列有關(guān)PCR的敘述，錯(cuò)誤的是（）A．PCR的原理是DNA復(fù)制，解旋和復(fù)制是同時(shí)進(jìn)行的B．PCR的過(guò)程主要包括變性→延伸→復(fù)性，溫度逐漸降低C．PCR技術(shù)擴(kuò)增時(shí)，一個(gè)DNA分子經(jīng)過(guò)n輪復(fù)制共需引物2n-1對(duì)D．每一循環(huán)都消耗引物和原料，需要在操作中及時(shí)補(bǔ)充1．重疊延伸PCRSOEPCR技術(shù)是1989年由Horton等創(chuàng)建的，它依據(jù)目的基因的核苷酸序列，將目的基因分為多條引物，設(shè)計(jì)多對(duì)具有互補(bǔ)末端的引物,先分段對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物混合，通過(guò)重疊鏈的相互搭橋、互為模板而延伸，最終將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)（圖1）。重疊PCR技術(shù)彌補(bǔ)了一般PCR技術(shù)對(duì)短于100bp和長(zhǎng)度為幾十bp片段DNA重組的困難，并可不依賴于內(nèi)切酶的消化方式，簡(jiǎn)潔快速地獲得PCR產(chǎn)物，有效避免加入的非目的基因序列的連接對(duì)目的基因的影響，從而在體外獲得高質(zhì)量的目的基因序列，而且目的產(chǎn)物特異性高，不需要構(gòu)建DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。但由于該技術(shù)所使用的引物序列較長(zhǎng)（“引發(fā)”部分和“重疊”部分，各約25~30bp），故該技術(shù)的退火溫度較難把握，對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功率造成很大影響。該技術(shù)在大片段基因的人工合成（如圖2-a）、基因定點(diǎn)突變（如圖2-b）等方面有廣泛應(yīng)用。大片段基因的人工合成是根據(jù)目的基因的序列,設(shè)計(jì)n條單鏈寡核苷酸片段為引物（如圖2-a中P1~P15），相鄰近的每2條引物之間均有15~25bp的序列反向互補(bǔ)。原理是先取中間4條單鏈的寡核苷酸引物P6、P7、P8和P9進(jìn)行第1輪的PCR反應(yīng)，得到目的片段后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收。下面每輪循環(huán)都以上輪的PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，依次在兩側(cè)引入2條寡核苷酸引物，互為動(dòng)態(tài)模板，最終實(shí)現(xiàn)目的基因的合成?；蚨c(diǎn)突變是根據(jù)的基因的序列,設(shè)計(jì)4條單鏈寡核苷酸片段為引物（如圖2-b中的引物A~D），其中2條引物（B、C）堿基序列反向互補(bǔ)，且此2條引物的中間為突變堿基。原理是取引物A、B進(jìn)行PCR1反應(yīng)，以及引物C、D進(jìn)行PCR2反應(yīng)，得到的2種目的片段分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收。將回收的片段混合，片段互為模板和引物進(jìn)行PCR3反應(yīng)，最后以PCR3產(chǎn)物為模板，加入引物A、D完成PCR4反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)基因特定位置堿基的增添、缺失、替換。2．等位基因特異PCRAS-PCR又稱作ARMS（amplificationrefractorymutationsystem），是由Newton等1989年研發(fā)的一種PCR技術(shù),該技術(shù)的原理是:根據(jù)單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotidepolymorphism，SNP）位點(diǎn)設(shè)計(jì)3′末端與SNP位點(diǎn)堿基互補(bǔ)或錯(cuò)配的特異PCR引物,通過(guò)凝膠電泳等方法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的有或無(wú),從而檢測(cè)基因型中SNP（如圖3）。根據(jù)等位基因WT和MT之間存在的1個(gè)核苷酸T-G的突變，設(shè)計(jì)引物1、2、3。其中引物1為公共引物，引物2與MT配對(duì)，與WT不配對(duì)，故引物1、2僅在MT中有擴(kuò)增產(chǎn)物；同理，引物1、3僅在WT中有擴(kuò)增產(chǎn)物。由于生物中SNP數(shù)量多、分布廣、穩(wěn)定性強(qiáng)，故該技術(shù)是一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、可靠的檢測(cè)基因型SNP的技術(shù)，也是有效開(kāi)發(fā)SNP分子標(biāo)記的方法。但該技術(shù)的反應(yīng)體系有很高的靈敏性，對(duì)鎂離子、Taq酶、dNTP的濃度要求比較嚴(yán)格，實(shí)際操作還需要多次預(yù)實(shí)驗(yàn)予以確定。圖3.等位基因特異PCR原理3．熱不對(duì)稱性PCRTAIL-PCR技術(shù)是一種用來(lái)分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的PCR技術(shù)，該技術(shù)由Liu和Whitter于1995年首先研究并報(bào)道，其原理是：利用一系列序列特異性的嵌套引物與一個(gè)短的簡(jiǎn)并引物指導(dǎo)擴(kuò)增已知序列的側(cè)翼序列的反應(yīng)，由于兩類(lèi)引物的退火溫度不同，可通過(guò)控制反應(yīng)過(guò)程中的退火溫度而有效地控制特異性和非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。操作時(shí)，根據(jù)目標(biāo)序列旁邊的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物（specialprimer，SP1、SP2、SP3），用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物（arbitrarydegenerate，AD）組合，以基因組DNA作為模板，根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過(guò)分級(jí)反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增特異片段。第1輪PCR反應(yīng)包括5次高嚴(yán)謹(jǐn)性反應(yīng)、一次低嚴(yán)謹(jǐn)性反應(yīng)、10次較低嚴(yán)謹(jǐn)性反應(yīng)和12次熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)。首先，5次高嚴(yán)謹(jǐn)性的反應(yīng)使長(zhǎng)的高退火溫度的特異引物SP1與已知的序列結(jié)合并延伸。此過(guò)程中目標(biāo)序列呈直線式上升，由AD引物結(jié)合產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物的濃度較低，之后進(jìn)行1次低退火溫度反應(yīng)，使簡(jiǎn)并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上，接下來(lái)10次較低嚴(yán)謹(jǐn)性的反應(yīng)使２種引物均能與模板互補(bǔ)配對(duì)，從而使原來(lái)由高嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)所產(chǎn)生的單鏈靶DNA復(fù)制成雙鏈DNA，為下一輪線性擴(kuò)增模板做準(zhǔn)備，最后進(jìn)行12次熱不對(duì)稱的TAIL循環(huán)，使目的片段擴(kuò)增量大大超過(guò)非目標(biāo)片段。經(jīng)過(guò)上述過(guò)程，得到濃度不同的３類(lèi)產(chǎn)物：產(chǎn)物Ⅰ是在特異引物和任意引物之間擴(kuò)增的，即目標(biāo)產(chǎn)物（大量）；產(chǎn)物Ⅱ是單獨(dú)由特異引物擴(kuò)增的（大量）；產(chǎn)物Ⅲ是單獨(dú)由任意引物引發(fā)的產(chǎn)物（少量）。接下來(lái)進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，使產(chǎn)物Ⅰ的分子數(shù)逐漸升至最高，產(chǎn)物Ⅱ、產(chǎn)物Ⅲ基本不變。用稀釋后的第2輪PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第3輪PCR，最終獲得目標(biāo)產(chǎn)物為主的PCR產(chǎn)物（圖4）。對(duì)此PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，即實(shí)現(xiàn)從已知序列中分離到其鄰近的未知側(cè)翼序列這一目的。以基因組DNA作為模板，利用依照目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)的3個(gè)較高退火溫度的引物SP，和1個(gè)AD引物組合，通過(guò)特殊的熱循環(huán)程序（低嚴(yán)謹(jǐn)PCR、高嚴(yán)謹(jǐn)PCR交替進(jìn)行），使得特異性PCR產(chǎn)物得以有效擴(kuò)增，從而獲得已知序列的側(cè)翼序列（圖4）。TAIL-PCR方法直接通過(guò)3輪PCR反應(yīng)得到目的片段，能彌補(bǔ)常規(guī)PCR不能對(duì)已知DNA序列側(cè)翼的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增的不足，從而快速分離到目標(biāo)序列。但該方法對(duì)反應(yīng)條件要求精準(zhǔn)，其中任一輪出現(xiàn)失誤，都將直接影響下一循環(huán)，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；另外，由于引物組合較多，且AD引物存在有限的結(jié)合位點(diǎn)，即使使用不同的簡(jiǎn)并引物也有可能導(dǎo)致擴(kuò)增不出產(chǎn)物。目前，TAIL-PCR在對(duì)基因側(cè)翼序列的克隆中發(fā)揮了重要作用，在圖位克隆、遺傳圖譜繪制、基因測(cè)序等方面也被廣泛應(yīng)用。圖4.典型TALL-PCR流程4．熒光定量PCRFQ-PCR于1992由Higuchi提出設(shè)想，1995年由美國(guó)PE（PerkinElmer）公司研發(fā)，是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)的積累，對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程進(jìn)行檢測(cè)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的PCR技術(shù)。例如Taq‐Man探針工作原理是探針保持完整狀態(tài)時(shí)，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，不會(huì)檢測(cè)到熒光。在PCR延伸過(guò)程中，探針被5′-3′核酸外切酶特異性地切割并釋放5′端的熒光基團(tuán)，發(fā)出熒光信號(hào)，熒光量與產(chǎn)物中雙鏈的量呈正相關(guān)（圖5、圖6）。熒光定量PCR具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量精準(zhǔn)、操作簡(jiǎn)便和自動(dòng)化程度高等一系列優(yōu)點(diǎn)，在基礎(chǔ)生物學(xué)研究、食品檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。但該技術(shù)在操作的規(guī)范性（如檢測(cè)樣品的數(shù)量是否滿足生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)使用、實(shí)驗(yàn)室采用的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)結(jié)果呈現(xiàn)的影響度等）、實(shí)驗(yàn)耗材的費(fèi)用（熒光探針費(fèi)用昂貴，且損耗快）等方面仍存在不足。圖5.熒光定量PCR原理5．鍋柄式PCR鍋柄式PCR是一種環(huán)狀PCR技術(shù)，該技術(shù)于1997年由Felix和Jones報(bào)道，采用已知的5′端序列和未知的3′端伴侶基因序列以形似一個(gè)鍋和一個(gè)柄的模板擴(kuò)增基因DNA，從而擴(kuò)增2.0~9.0kb的大片段未知序列（如圖7）。PanhandlePCR是高度特異性擴(kuò)增與已知位點(diǎn)相鄰大于3.0kb的人類(lèi)基因組DNA的最佳技術(shù)。其已廣泛運(yùn)用于啟動(dòng)子、基因調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域定位、轉(zhuǎn)座子整合位點(diǎn)測(cè)定等領(lǐng)域。圖7.鍋柄式PCR原理除上述5種常用新型PCR技術(shù)外，目前還有低變性溫度PCR、AnglerPCR、脈沖PCR等多種PCR技術(shù)，他們都各有優(yōu)勢(shì)、各有側(cè)重，在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。隨著制造業(yè)的發(fā)展及其他技術(shù)的配合，定會(huì)有更多升級(jí)版、改進(jìn)版的PCR技術(shù)問(wèn)世，為基因結(jié)構(gòu)和功能的研究提供更好的技術(shù)支持。9．利用重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變可以實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素酶基因進(jìn)行合理性改造，其過(guò)程如下圖所示。下列分析不正確的是（）A．PCR1過(guò)程中的產(chǎn)物AB是依賴引物a和引物b擴(kuò)增的結(jié)果B．引物c和引物b上均含有與模板鏈不能互補(bǔ)的堿基C．①過(guò)程需要先加熱至90℃以上后再冷卻至50℃左右D．②過(guò)程需要利用引物a和引物d獲得突變產(chǎn)物AD10．實(shí)時(shí)熒光定量PCR可用于對(duì)樣品中特定DNA序列進(jìn)行定量分析。將熒光標(biāo)記的Taqman探針與待測(cè)樣本DNA混合，當(dāng)探針完整時(shí)，不產(chǎn)生熒光。在PCR過(guò)程中，與目的基因結(jié)合的探針被TaqDNA聚合酶水解，R與Q分離后，在特定光的激發(fā)下R發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度增加，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，可得Ct值(達(dá)到熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù))。下列相關(guān)敘述正確的是（

）A．熒光基因R連接在探針的3’端B．該反應(yīng)體系中并未加入ATP，所以新鏈的合成不需要消耗能量C．TaqDNA聚合酶在該反應(yīng)中的作用是合成磷酸二酯鍵D．Ct值越小，說(shuō)明樣品中特定DNA序列的含量越多11．重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，獲得想要的目的基因。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因的特定位點(diǎn)引入特定突變，以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變，原理見(jiàn)圖。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（

）A．過(guò)程②需要含Mg2+的緩沖液、DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶等B．若引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次DNA分子的復(fù)制后，一共會(huì)產(chǎn)生2種DNA分子C．經(jīng)過(guò)過(guò)程④獲得的雜交DNA有2種，其中只有一種可以經(jīng)過(guò)過(guò)程⑤獲得目的基因D．過(guò)程⑤使用耐高溫的DNA聚合酶延伸，不需要引物12．利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類(lèi)似(如圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段,它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯(cuò)誤的是（

）A．延伸的溫度必須大于復(fù)性溫度,而小于變性溫度B．設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間堿基互補(bǔ)配對(duì)而造成引物自連C．復(fù)性溫度過(guò)高可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物D．第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為15/1613．隨著全球轉(zhuǎn)基因作物大規(guī)模種植和全球一體化下頻繁的貿(mào)易流通，轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的任務(wù)將越來(lái)越重。為了還給消費(fèi)者知情權(quán)和選擇權(quán)，多個(gè)國(guó)家和地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行標(biāo)識(shí)管理制度，這些法規(guī)實(shí)施的前提就是要建立穩(wěn)定、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)。PCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)被多國(guó)檢測(cè)工作者使用，該技術(shù)通常包括核酸提取、核酸擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)3個(gè)步驟。某研究小組設(shè)計(jì)并完成了“轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆定性PCR檢測(cè)”實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并回答相關(guān)問(wèn)題（草甘膦為常用除草劑；轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的外源基因構(gòu)建圖如圖1所示）：圖1抗草甘膦外源基因結(jié)構(gòu)圖（CaMV35S為外源啟動(dòng)子、NOS為外源終止子）(1)提取DNA：取待測(cè)大豆組織裂解破碎，進(jìn)行DNA提取和純化，得到待測(cè)大豆基因組DNA。該過(guò)程的常用的試劑有EDTA、SDS、NaCl、酒精等。在研磨液中加入NaCl的目的是________________，提取到的DNA可以用______________試劑鑒定。(2)DNA擴(kuò)增：①在確定擴(kuò)增對(duì)象后，從___________________中獲得待擴(kuò)增基因序列，以此為依據(jù)可設(shè)計(jì)引物。該小組擬定的引物設(shè)計(jì)如表所示，其引物設(shè)計(jì)有一個(gè)是不科學(xué)的，請(qǐng)指出并說(shuō)明原因____________?；蛞镄蛄挟a(chǎn)物片段大小基因來(lái)源LectinF－5'GCCCTCTACTCCACCCCCATCC－3'R－5'GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG－3'118內(nèi)源基因CaMV35SF－5'GGGATT－3'R－5'AATCCC－3'195外源基因NOSF－5'GAATCCTGTTGCCGGTCTTG－3'R－5'TTATCCTAGTTTGCGCGCTA－3'180外源基因CP4－EPSPSF－5'CTTCTGTGCTGTAGCCACTGATGC－3R－5'CCACTATCCTTCGCAAGACCCTTC－3320外源基因注：內(nèi)源基因指大豆基因組內(nèi)基因，外源基因指大豆基因組外基因。②PCR擴(kuò)增：在4個(gè)反應(yīng)體系中分別加入________________（模板）、相應(yīng)引物、________________酶、________________等，并將PCR儀的溫度設(shè)定為：變性94℃30s、復(fù)性58℃30s、延伸72℃40s，循環(huán)30次?！把由臁钡臏囟仍O(shè)定為72℃，是因?yàn)樵摐囟认耞_______________。在設(shè)定的PCR體系下可以特異性擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段，主要是因?yàn)開(kāi)_________________________________具有特異性。(3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：可采用________________的方法檢測(cè)。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2、3所示。據(jù)圖2初步判斷，該大豆為_(kāi)_______________（填“轉(zhuǎn)基因”或“非轉(zhuǎn)基因”）大豆。據(jù)圖2、圖3分析，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果是________________（填“可信的”或“不可信的”）。注:M:標(biāo)準(zhǔn)參照物，1：陽(yáng)性對(duì)照（基因標(biāo)準(zhǔn)品），2：陰性對(duì)照（普通大豆），3：核酸提取空白對(duì)照，4：待鑒定樣本14．新型冠狀病毒的結(jié)構(gòu)如圖甲所示。病毒外有包膜，這層包膜主要來(lái)源于宿主細(xì)胞膜，包膜還含有病毒自身的糖蛋白，其中糖蛋白S可與人體細(xì)胞表面的ACE2蛋白結(jié)合，從而使病毒識(shí)別并侵入宿主細(xì)胞。新型冠狀病毒是一種單股正鏈RNA病毒，以ss（+）RNA表示。圖乙表示新冠病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖過(guò)程，回答下列問(wèn)題。(1)新冠病毒的糖蛋白S可與人體細(xì)胞表面的ACE2蛋白結(jié)合體現(xiàn)了膜的_____________功能，研究表明吸煙更容易感染新冠病毒，可能的原因是_____________。(2)推測(cè)新冠病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在_____________（細(xì)胞器）的作用下脫去包膜，暴露出遺傳物質(zhì)。據(jù)圖分析新冠病毒增殖的過(guò)程中遺傳信息的傳遞方向是_____________（用文字和箭頭表示）。(3)新冠病毒核酸檢測(cè)可采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，1~2h內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果。圖丙表示該技術(shù)的基本流程，其原理是PCR擴(kuò)增過(guò)程（一種體外大量擴(kuò)增DNA的技術(shù)）中加入與特定模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，再通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)物的熒光信號(hào)即可確定是否為陽(yáng)性。①圖中酶A為_(kāi)____________，酶B能水解雜化雙鏈中的_____________（填“DNA”或“RNA”），酶C的作用類(lèi)似于DNA聚合酶，推測(cè)其起作用時(shí)______________（填“需要”或“不需要”）模板。②PCR擴(kuò)增過(guò)程的原理是_____________。15．在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）中，除了作為復(fù)制對(duì)象的長(zhǎng)鏈DNA之外，反應(yīng)溶液中還添加有作為引物的短鏈DNA、dNTP（脫氧三磷酸核苷酸，N表示任意某一種堿基）和酶。實(shí)驗(yàn)時(shí)需要使反應(yīng)溶液的溫度周期性地發(fā)生變化以完成“變性—復(fù)性—延伸”的循環(huán)。DNA復(fù)性溫度與互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵數(shù)呈正相關(guān)。(1)PCR反應(yīng)溶液中添加的酶為_(kāi)_____，作用是______。(2)實(shí)驗(yàn)1：在圖1的引物1到引物4中，只使用1種作為引物，復(fù)性的溫度設(shè)定為T(mén)℃，PCR后只合成出了與模板DNA2相同的單鏈。該實(shí)驗(yàn)使用的引物是______。實(shí)驗(yàn)2：將引物變更為圖1中的引物3和引物4，其他條件與實(shí)驗(yàn)1相同的情況下進(jìn)行PCR雙鏈DNA完全沒(méi)有被復(fù)制，請(qǐng)?jiān)诖痤}卡中，將引物3和引物4與模板鏈結(jié)合的關(guān)系繪制出來(lái)。______(3)實(shí)驗(yàn)3：對(duì)圖2中的雙鏈DNA，使用引物5和引物6，將復(fù)性的溫度設(shè)定為T(mén)℃，進(jìn)行了PCR。結(jié)果是雙鏈DNA完全得不到復(fù)制。而當(dāng)設(shè)定溫度改變后，雙鏈DNA得到了復(fù)制。溫度改變的大致思路是______。(4)實(shí)驗(yàn)4：PCR技術(shù)與電泳鑒定結(jié)合進(jìn)行DNA測(cè)序。以待測(cè)序的DNA鏈作為模板鏈，使用3′TATA……ATGCGCA-5′末端結(jié)合了高靈敏度檢測(cè)化合物X的DNA單鏈序列作為引物，在第1次實(shí)驗(yàn)中，用dNTP進(jìn)行反應(yīng)。第2次實(shí)驗(yàn)，在第1次實(shí)驗(yàn)使用上述dNTP的基礎(chǔ)上，將反應(yīng)混合物分為四個(gè)試管，分別加入四種雙脫氧三磷酸核苷酸即ddNTP，即核苷酸在2、3號(hào)都脫氧（ddATP、ddCTP、ddTTP、ddGTP，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4），每個(gè)試管只加一種。第1次與第2次實(shí)驗(yàn)四支試管，在經(jīng)過(guò)相同的溫度變化循環(huán)后，對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行了適當(dāng)?shù)奶幚恚谷康腄NA以單鏈DNA的形式存在。使用能區(qū)分開(kāi)一個(gè)堿基長(zhǎng)度差異的凝膠電泳法對(duì)含有化合物X的單鏈DNA進(jìn)行分析，獲得了如圖5所示的結(jié)果。①ddNTP一旦參與聚合反應(yīng)，則DNA單鏈延伸即終止，原因是______。②請(qǐng)根據(jù)下圖寫(xiě)出模板鏈堿基序列：______16．鹽芥是十字花科鹽芥屬植物，因生長(zhǎng)于農(nóng)田區(qū)的鹽漬化土壤而得名。為研究鹽芥iTS基因在植物逆境脅迫應(yīng)答中的重要作用，科研人員做了一系列研究。(1)取待測(cè)鹽芥組織裂解破碎，進(jìn)行DNA提取和純化，得到待測(cè)鹽芥基因組DNA。該過(guò)程常用的試劑有EDTA、SDS、NaCl、酒精等。在研磨液中加入NaCl的目的是_____________；純化DNA時(shí)可使用酒精，是因?yàn)開(kāi)____________________________。(2)為了特異性擴(kuò)增iTS基因序列，需根據(jù)_____________設(shè)計(jì)特異性引物。在反應(yīng)體系中加入相應(yīng)物質(zhì)和原料后，將PCR儀的溫度設(shè)定為：變性94℃（30s）、復(fù)性58℃（30s）、延伸72℃（40s）?！把由臁钡臏囟仍O(shè)定為72℃，是因?yàn)樵摐囟认耞____________。若iTS基因的數(shù)量為a個(gè)，上游引物數(shù)∶下游引物數(shù)=1∶50，該體系擴(kuò)增進(jìn)行5輪循環(huán)后，上游引物剛好耗盡，則上游引物的數(shù)量等于_____________條。(3)用限制酶M切割某DNA分子，過(guò)程如圖1所示，其中虛線部分為鹽芥iTS基因。圖1中的DNA分子上限制酶M的切割位點(diǎn)有_____________個(gè)，它能夠特異性識(shí)別的序列是_____________，下圖2中能與iTS基因進(jìn)行重組的Ti質(zhì)粒是_____________。（所示堿基序列為不同載體中方框內(nèi)的序列）(4)將獲得的重組質(zhì)粒通過(guò)____________法導(dǎo)入大豆愈傷組織中，最終獲得轉(zhuǎn)基因大豆植株，iTS基因能否在大豆植株體內(nèi)維持和表達(dá)其遺傳特性的關(guān)鍵是____________。(5)為驗(yàn)證iTS基因能提高大豆的耐鹽性，研究人員進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下表所示。大豆類(lèi)型處理方式葉片中葉綠素含量根部細(xì)胞滲透壓野生型大豆0.15mol/L的NaCl溶液處理低低轉(zhuǎn)iTS基因大豆高高綜合上述研究，iTS基因能提高植物耐鹽性的機(jī)理是_______________________________。參考答案：1．A【分析】RCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。原理：DNA復(fù)制?！驹斀狻緼、PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，但在使用時(shí)需根據(jù)擴(kuò)增的DNA片段以及引物的情況人工設(shè)定合適的溫度，用于完成DNA的擴(kuò)增，A正確；B、10倍緩沖液中不包含dNTP，B錯(cuò)誤；C、為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前都必須進(jìn)行高壓滅菌處理，移液器不需要高壓蒸汽滅菌，C錯(cuò)誤；D、電泳時(shí)，電泳緩沖液以沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜，D錯(cuò)誤。故選A。2．D【分析】PCR技術(shù)：（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。（2）原理：DNA復(fù)制。（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一對(duì)引物。（4）條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）過(guò)程：①高溫變性：DNA解旋過(guò)程；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開(kāi)不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開(kāi)?！驹斀狻緼、③過(guò)程為變性，變性過(guò)程使用90～95℃的高溫處理是為了讓目的基因的雙鏈解開(kāi)，充分變性，A正確；B、⑤過(guò)程為延伸，延伸過(guò)程使用70～75℃的溫度處理既可以防止DNA變性，還能促進(jìn)子鏈的延伸，B正確；C、④過(guò)程為復(fù)性，復(fù)性過(guò)程使用55℃的溫度處理，使兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，C正確；D、RNA中含有U，DNA中不含有U，含有T，D錯(cuò)誤。故選D。3．B【分析】PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制?！驹斀狻緼、PCR是體外進(jìn)行DNA復(fù)制，以半保留復(fù)制為原理，為了維持反應(yīng)的穩(wěn)定，反應(yīng)需要在緩沖液中進(jìn)行，A正確；B、耐高溫的DNA聚合酶只能從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸，B錯(cuò)誤；C、反應(yīng)過(guò)程中的每一輪循環(huán)依次包括變性（高溫解旋）、復(fù)性（引物結(jié)合）、延伸（子鏈延伸）三步，C正確；D、常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物，按相對(duì)分子質(zhì)量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，D正確。故選B。4．D【分析】PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，利用的原理是DNA復(fù)制，需要條件有模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶），過(guò)程包括：①高溫變性：DNA解旋過(guò)程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開(kāi)不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開(kāi)）；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈?！驹斀狻緼、RT-PCR技術(shù)是將RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)，利用RT酶PCR技術(shù)，獲取S蛋白基因時(shí)，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶，A正確；B、引物與模板鏈的3'端堿基互補(bǔ)配對(duì)，故引物1、引物2、引物7和引物8不合適，擴(kuò)增得到的RBD蛋白基因也應(yīng)該含有限制酶的酶切位點(diǎn)，故引物3和引物6不合適，故選引物4和引物5，B正確；C、PCR的產(chǎn)物可通過(guò)電泳鑒定，設(shè)置如下：1號(hào)泳道為標(biāo)準(zhǔn)（Marker），2號(hào)泳道是以RBD蛋白基因片段為材料做的陽(yáng)性對(duì)照組，3號(hào)泳道為實(shí)驗(yàn)組，C正確；D、質(zhì)粒上沒(méi)有SmaⅠ酶切位點(diǎn)，且若使用EcoRⅠ酶切，易造成目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化，故應(yīng)該選擇BamHⅠ和HindⅢ，D錯(cuò)誤。故選D。5．D【分析】PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中某種DNA含量的原理是在PCR體系中每加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處，會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步?！驹斀狻緼、細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，引物是通過(guò)RNA聚合酶合成的RNA鏈，而PCR反應(yīng)中所需的引物是人工合成的DNA或RNA鏈，A錯(cuò)誤；B、一個(gè)初始DNA分子經(jīng)過(guò)4次循環(huán)后，得到8個(gè)等長(zhǎng)的DNA分子，B錯(cuò)誤；C、Ct值越小，說(shuō)明所需循環(huán)的次數(shù)越少，可以理解為樣本中的病毒含量相對(duì)較高，越容易被檢測(cè)到，而Ct值越高，說(shuō)明所需循環(huán)的次數(shù)越多，檢測(cè)到時(shí)需要更多的時(shí)間與循環(huán)，提示樣本中病毒的含量相對(duì)較少，即新冠病毒含量越少，Ct值越高，新冠病毒含量越多，Ct值越低，C錯(cuò)誤；D、題干中提出“加入一個(gè)與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針”，并且“每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成”，因此反應(yīng)最終的熒光強(qiáng)度與起始狀態(tài)模板DNA含量呈正相關(guān)，D正確。故選D。6．D【分析】1.PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在體外復(fù)制特定的DNA的核酸合成技術(shù)。2.原理：DNA復(fù)制。3.條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Tag酶）?！驹斀狻緼、圖示環(huán)節(jié)為引物與模板堿基互補(bǔ)配對(duì)，表示的是復(fù)性環(huán)節(jié)，復(fù)性的上一環(huán)節(jié)為變性，復(fù)性的溫度比變性的溫度低，A正確；B、在PCR擴(kuò)增中，脫氧核苷酸只能連接在3'端，所以dNTP作為擴(kuò)增的原料會(huì)依次連接到3'端，B正確；C、Tag酶催化形成磷酸二酯鍵，磷酸二酯鍵是相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸之間形成的，C正確；D、由于兩個(gè)引物均不在該片段的端點(diǎn)，因此一個(gè)循環(huán)后，得到的兩個(gè)DNA片段中脫氧核苷酸的數(shù)量不一定相同，D錯(cuò)誤。故選D。7．C【分析】PCR技術(shù)的條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作過(guò)程：①高溫變性：DNA解旋過(guò)程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開(kāi)不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開(kāi)）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈?！驹斀狻緼、新冠病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，因此，檢測(cè)新冠病毒時(shí)，需加入逆轉(zhuǎn)錄酶將新冠病毒RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，A正確；B、PCR技術(shù)中每個(gè)循環(huán)均包括變性、復(fù)性（引物和模板結(jié)合）、延伸3個(gè)階段，一個(gè)循環(huán)后DNA數(shù)量增加一倍，B正確；C、Ct值越大表示被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越少，患者危險(xiǎn)性更低，C錯(cuò)誤；D、若樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，則逆轉(zhuǎn)錄無(wú)法得到相應(yīng)DNA，檢測(cè)結(jié)果可能為陰性，D正確。故選C。8．ABD【分析】PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)，該技術(shù)的原理是DNA復(fù)制，實(shí)現(xiàn)的前提條件是要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對(duì)引物，其他的條件有模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。PCR過(guò)程：①高溫變性：DNA解旋過(guò)程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開(kāi)不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開(kāi)）；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈?！驹斀狻緼、由分析可知，PCR的原理是DNA復(fù)制，該過(guò)程中解旋和復(fù)制不是同時(shí)進(jìn)行的，A錯(cuò)誤；B、PCR的過(guò)程主要包括高溫變性→低溫復(fù)性→中溫延伸，可見(jiàn)該過(guò)程中不是溫度逐漸降低，B錯(cuò)誤；C、PCR技術(shù)擴(kuò)增時(shí)，一個(gè)DNA分子經(jīng)過(guò)n輪復(fù)制產(chǎn)生的子代DNA數(shù)目為2n個(gè)，其中的單鏈數(shù)目為2（n+1）個(gè)，每個(gè)子鏈的延伸都需要引物，即除了兩條最初的模板鏈中沒(méi)有引物，因此該過(guò)程中共需引物2n-1對(duì)，C正確；D、PCR過(guò)程中的引物和原料是一次性添加的，不需要補(bǔ)充，D錯(cuò)誤。故選ABD。9．D【分析】多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段：PCR原理：在解旋酶作用下，打開(kāi)DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4中游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開(kāi)始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端向3'端延伸的。實(shí)際上就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程?！驹斀狻緼、PCR技術(shù)中DNA單鏈延伸的方向是沿著引物的5'端向3'端延伸的，據(jù)此可分析，PCR1過(guò)程中的產(chǎn)物AB是依賴引物a和引物b擴(kuò)增的結(jié)果，A正確；B、根據(jù)突變位點(diǎn)的產(chǎn)生可推知，引物c和引物b上均含有與模板鏈不能互補(bǔ)的堿基，B正確；C、①過(guò)程是雙螺旋解開(kāi)的過(guò)程，即氫鍵斷裂可通過(guò)先加熱至90～95℃完成，而后再冷卻至55～60℃使氫鍵形成，為子鏈的延伸做準(zhǔn)備，C正確；D、②過(guò)程為子鏈延伸的過(guò)程，該過(guò)程需要利用AB上鏈和CD下鏈之間的互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)子鏈的延伸過(guò)程，D錯(cuò)誤。故選D。10．D【分析】實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，TaqDNA聚合酶有兩個(gè)作用，一是形成子鏈的磷酸二酯鍵，二是水解探針，破壞磷酸二酯鍵；破壞探針導(dǎo)致熒光出現(xiàn)，Ct值越大，即是熒光強(qiáng)度越大，說(shuō)明樣品中特定DNA序列的含量越多?！驹斀狻緼、因?yàn)橐锏淖饔檬鞘笵NA聚合酶能夠從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸，從圖中引物1的方向可以分析出，R端是5'端，A錯(cuò)誤；B、該反應(yīng)體系中并未加入ATP，但新鏈的合成需要消耗能量，解旋的能量來(lái)自于高溫，聚合的能量來(lái)自于原料，B錯(cuò)誤；C、在該反應(yīng)中TaqDNA聚合酶有兩個(gè)作用，一是形成子鏈的磷酸二酯鍵，二是水解探針，破壞磷酸二酯鍵，C錯(cuò)誤；D、Ct值越小，達(dá)到熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)越少，說(shuō)明樣品中特定DNA序列的含量越多，D正確。故選D。11．B【分析】PCR原理：在高溫作用下，打開(kāi)DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開(kāi)始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端向3'端延伸的。實(shí)際上就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程。DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈。【詳解】A、過(guò)程②為PCR反應(yīng)，需要在一定的添加Mg2+的緩沖液中才能進(jìn)行，需提供模板DNA、分別與兩條模板鏈結(jié)合的引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶等，A正確；B、兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中各自形成兩種DNA分子，但由于引物1和引物4形成兩個(gè)與原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA屬于同一種DNA，故總共形成3種DNA分子，B錯(cuò)誤；C、過(guò)程④獲得的雜交DNA有2種，一種3′端為單鏈，一種5′端為單鏈，5′端為單鏈的雜交DNA為所需DNA，C正確；D、過(guò)程⑤是延伸過(guò)程，該過(guò)程使用耐高溫的DNA聚合酶進(jìn)行催化，不需要引物，D正確。故選B。12．D【分析】用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物（兩種）。引物與模板鏈結(jié)合后，耐高溫的DNA聚合酶使子鏈從引物的3'端延伸?！驹斀狻緼、變性是使DNA雙鏈解旋，需要較高溫度；復(fù)性目的是使兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條DNA單鏈結(jié)合，需要溫度較低，延伸的溫度必須大于復(fù)性溫度，而小于變性溫度，A正確；B、設(shè)計(jì)引物時(shí)，需要避免引物之間形成堿基互補(bǔ)配對(duì)而造成引物自連，B正確；C、復(fù)性的目的是使兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條DNA單鏈結(jié)合，因此復(fù)性溫度過(guò)高可能引起兩種引物不能與兩條DNA單鏈結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，C正確；D、DNA復(fù)制為半保留復(fù)制，第四輪循環(huán)即DNA復(fù)制4次，共形成24＝16個(gè)DNA分子，其中含有最初模板鏈的2個(gè)DNA分子含有引物A或引物B，其余14個(gè)DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率為14/16＝7/8，D錯(cuò)誤。故選D。13．(1)溶解DNA二苯胺(2)序列數(shù)據(jù)庫(kù)CaMV35S的引物設(shè)計(jì)不科學(xué)，原因是引物太短、特異性弱，并且兩個(gè)引物之間會(huì)互補(bǔ)結(jié)合待測(cè)大豆基因組DNATaq（熱穩(wěn)定DNA聚合）4種脫氧核苷酸Taq酶活性較高引物與模板DNA的結(jié)合(3)瓊脂糖凝膠電泳（或電泳）非轉(zhuǎn)基因不可信的【分析】1、DNA粗提取和鑒定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精。（2）DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色。2、PCR技術(shù)：概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。原理：DNA復(fù)制。前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對(duì)引物。條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。過(guò)程：高溫變性：DNA解旋過(guò)程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開(kāi)不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開(kāi)）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；中溫延伸：合成子鏈?！驹斀狻浚?）DNA不溶于水，不溶于酒精，但在2mol/LNaCl溶液中溶解度較高，故在研磨液中加入NaCl的目的是溶解DNA。提取到的DNA可以用二苯胺試劑鑒定。（2）①可從序列數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取常見(jiàn)基因的信息，故在確定擴(kuò)增對(duì)象后，從序列數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得待擴(kuò)增基因序列，以此為依據(jù)可設(shè)計(jì)引物。CaMV35S的引物設(shè)計(jì)不科學(xué)，原因是引物太短，有可能在模板上存在許多能結(jié)合的部位，特異性弱；并且兩個(gè)引物之間不能有大量互補(bǔ)序列，否則復(fù)性時(shí)兩種引物會(huì)結(jié)合，降低引物與模板結(jié)合的概率。②要測(cè)定某大豆基因組中是否有特定的基因，模板要選待測(cè)大豆基因組DNA。延伸是在Taq酶的作用下，以4種脫氧核苷酸為原料延伸子鏈，“延伸”的溫度設(shè)定為72℃，是因?yàn)樵摐囟认耇aq酶活性較高。在設(shè)定的PCR體系下可以特異性擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段，主要是因?yàn)榧尤肓伺c特定部位結(jié)合的引物，引物可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)特異性結(jié)合到模板DNA的相應(yīng)位置。（3）擴(kuò)增產(chǎn)物DNA可采用瓊脂糖凝膠電泳的方法鑒定。據(jù)圖2初步判斷，圖中沒(méi)有180的片段，因此該大豆并未擴(kuò)增出NOS終止子，表明其基因組中沒(méi)有NOS終止子，故為非轉(zhuǎn)基因大豆。據(jù)圖3分析，lectin是內(nèi)源基因，每個(gè)大豆都應(yīng)該有的基因，但是不僅待測(cè)樣本沒(méi)擴(kuò)增出來(lái)，第2組普通大豆也沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)，表明實(shí)驗(yàn)的某環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題。比如：提取DNA的環(huán)節(jié)并未提取到DNA，PCR環(huán)節(jié)并沒(méi)有發(fā)揮擴(kuò)增的作用等，故由于圖3分析出的這些問(wèn)題，圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不可信了。14．(1)信息傳遞吸煙者肺部細(xì)胞ACE2基因的表達(dá)顯著增加,其肺部細(xì)胞膜表面ACE2比不吸煙者肺部細(xì)胞膜表面ACE2多(2)溶酶體(3)逆轉(zhuǎn)錄酶RNA需要DNA雙鏈復(fù)制【分析】新型冠狀病毒（COVID-19）是一種單股正鏈RNA病毒，病毒外有包膜，這層包膜主要來(lái)源于宿主細(xì)胞膜，包膜還含有病毒自身的糖蛋白，其中糖蛋白S可與人體細(xì)胞表面的ACE2蛋白結(jié)合，從而使病毒識(shí)別并侵入宿主細(xì)胞?！驹斀狻浚?）新冠病毒的糖蛋白S可與人體細(xì)胞表面的ACE2蛋白結(jié)合體現(xiàn)了膜的信息傳遞功能；吸煙更容易感染新冠病毒,可能的原因是吸煙者肺部細(xì)胞ACF2基因的表達(dá)顯著增加,其肺部細(xì)胞膜表面ACE2比不吸煙者肺部細(xì)胞膜表面ACE2多。（2）溶酶體有多種水解酶，可將新冠病毒的包膜脫去；新冠病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，據(jù)圖分析新冠病毒增殖的過(guò)程中遺傳信息的傳遞方向包括RNA的復(fù)制和翻譯過(guò)程，故可表示如下：。（3）圖丙中①過(guò)程是利用RNA逆轉(zhuǎn)錄得到DNA，因此需要逆轉(zhuǎn)錄酶催化；酶B能水解雜化雙鏈中的RNA，酶C的作用類(lèi)似于DNA聚合酶，起作用時(shí)需要以雜化雙鏈中的DNA為模板合成互補(bǔ)子鏈；PCR是體外擴(kuò)增DNA的過(guò)程，擴(kuò)增過(guò)程的原理是DNA雙鏈復(fù)制。15．(1)耐高溫的DNA聚合酶（或Taq酶）將游離的脫氧核苷酸鏈接到引物的3′端(2)引物-2(3)適當(dāng)降