2024-2025學(xué)年高中生物專題五DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段學(xué)案新人教版選修1

PAGE10-課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段學(xué)習(xí)目標(biāo)課程標(biāo)準(zhǔn)1．簡述PCR的原理。(重點(diǎn)和難點(diǎn))2．嘗試PCR技術(shù)操作。(重點(diǎn))3．探討PCR的應(yīng)用。嘗試PCR(DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)的基本操作和應(yīng)用。自主學(xué)習(xí)·預(yù)習(xí)熱身一、PCR擴(kuò)增的原理及條件1．概念：PCR即__多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)__，是一種__體外__快速__擴(kuò)增DNA__的技術(shù)。它能以極少量的__DNA__為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬份的__DNA拷貝__。2．原理(1)DNA的熱變性：在__80～100_℃__的溫度范圍內(nèi)，DNA__雙螺旋__結(jié)構(gòu)解體，__雙鏈__分開，這個(gè)過程稱為__變性__。當(dāng)溫度緩慢__降低__后，兩條彼此__分別__的DNA鏈又會重新結(jié)合成__雙鏈__。(2)子鏈的合成：①須要__DNA聚合酶__；②合成方向總是從子鏈的__5′端到3′端__。3．條件(1)__DNA__模板。(2)分別與模板DNA相結(jié)合的兩種__引物__。(3)A、T、G、C四種__脫氧核苷酸__。(4)__耐熱的__DNA聚合酶。(5)須要穩(wěn)定的__緩沖液__和能嚴(yán)格限制__溫度__的溫控設(shè)備。二、PCR過程與結(jié)果1．PCR過程過程溫度主要改變變性__90__℃以上雙鏈DNA解聚為__單鏈__復(fù)性__50__℃左右__兩種引物__通過堿基互補(bǔ)配對分別與兩條__單鏈DNA__結(jié)合延長__72__℃左右溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、G、C)在__DNA聚合酶__的作用下，依據(jù)__堿基互補(bǔ)配對__原則合成新的DNA鏈2．PCR的結(jié)果DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于__兩個(gè)引物之間__的DNA序列，使這段固定長度的序列呈__指數(shù)__擴(kuò)增。三、PCR試驗(yàn)操作1．試驗(yàn)用具名稱作用PCR儀自動(dòng)調(diào)控__溫度__，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增微量離心管事實(shí)上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的__場所__微量移液器用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，每吸取一種試劑后，其上的槍頭都必需__更換__2．試驗(yàn)步驟：打算：依據(jù)PCR反應(yīng)須要的物質(zhì)和條件，將須要的試劑和儀器打算好移液：用__微量移液器__依據(jù)配方在微量離心管中依次加入各試劑混合：蓋嚴(yán)離心管用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合勻稱。離心：將離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在__離心管底部__反應(yīng)：將離心管放入__PCR儀__中進(jìn)行反應(yīng)3．DNA含量的測定：(1)測量原理：DNA在260nm的紫外線波段有一劇烈的汲取峰，峰值的大小與__DNA含量__有關(guān)。(2)計(jì)算方法：DNA含量(μg/mL)＝__50×(260_nm的讀數(shù))__×稀釋倍數(shù)。思索DNA分子能精確復(fù)制的緣由是什么？提示：DNA分子獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制供應(yīng)了精確的模板，通過堿基互補(bǔ)配對，保證了復(fù)制能夠精確地進(jìn)行。┃┃活學(xué)巧練__■推斷題1．DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，羥基末端稱為3′端，磷酸基團(tuán)的末端稱為5′端。(√)2．DNA聚合酶只能從引物的3′端延長DNA鏈，因此DNA合成的方向總是從子鏈的5′端向3′端延長。(√)3．PCR中的復(fù)性就是讓兩條彼此分別的DNA鏈重新結(jié)合成雙鏈。(×)分析：PCR中的復(fù)性是讓引物與DNA模板結(jié)合。4．PCR反應(yīng)中的緩沖液的作用就像生物體內(nèi)的DNA復(fù)制中內(nèi)環(huán)境的作用。(×)分析：內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)可以保證細(xì)胞的生命活動(dòng)正常進(jìn)行，但是生物體內(nèi)的DNA復(fù)制是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行的。5．PCR利用了DNA的熱變性原理，通過限制溫度來限制雙鏈的解聚與結(jié)合。(√)6．PCR過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制一樣，都是邊解旋邊復(fù)制的過程。(×)分析：PCR利用DNA熱變性原理，當(dāng)溫度上升到90℃新知解讀·互動(dòng)探究學(xué)問點(diǎn)PCR原理與反應(yīng)過程┃┃要點(diǎn)歸納__■1．DNA復(fù)制的條件(1)DNA復(fù)制的條件參加的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶打開DNA雙鏈DNA母鏈供應(yīng)DNA復(fù)制的模板DNA聚合酶催化合成DNA子鏈(形成磷酸二酯鍵)4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料引物使DNA聚合酶能夠從引物的3′端起先連接脫氧核苷酸ATP供應(yīng)能量學(xué)問貼士DNA復(fù)制須要引物的緣由：DNA聚合酶不能從頭起先合成DNA，而只能從引物的3′端延長DNA鏈。2．PCR技術(shù)PCR技術(shù)利用了DNA的熱變性原理：在80～100℃(2)PCR反應(yīng)的條件參加的組分在DNA復(fù)制中的作用目的DNA片段供應(yīng)DNA復(fù)制的模板耐熱的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈(形成磷酸二酯鍵)4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料引物使DNA聚合酶能夠從引物的3′端起先連接脫氧核苷酸穩(wěn)定的緩沖溶液供應(yīng)類似細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的液體環(huán)境PCR儀限制溫度學(xué)問貼士PCR須要相宜但不同于細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件，比如不須要添加解旋酶，不須要添加ATP，但須要添加耐熱的DNA聚合酶、引物以及能夠人為限制溫度和復(fù)制周期等。(3)PCR的反應(yīng)過程①變性當(dāng)溫度上升到90℃②復(fù)性溫度下降到50℃③延長溫度上升到72℃PCR一般要經(jīng)驗(yàn)三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延長三步。從其次輪循環(huán)起先，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參加反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延長而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延長，這樣DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。如下圖所示：┃┃典例評析__■典例1PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，下圖表示合成過程，請據(jù)圖分析回答：A過程能使DNA變性解旋，對該過程的原理敘述正確的是(C)A．該過程用到耐高溫的解旋酶破壞氫鍵B．該過程用到限制酶破壞磷酸二酯鍵C．該過程不須要解旋酶的作用D．該過程與人體細(xì)胞的過程完全相同[解析]該過程用高溫破壞氫鍵，A錯(cuò)誤；該過程不須要用限制酶破壞磷酸二酯鍵，B錯(cuò)誤；該過程不須要解旋酶處理，高溫可以破壞氫鍵，C正確；PCR是體外DNA復(fù)制，與細(xì)胞中的DNA復(fù)制不同，PCR利用熱變性破壞氫鍵，體內(nèi)DNA復(fù)制利用解旋酶破壞氫鍵，D錯(cuò)誤，故選C。┃┃變式訓(xùn)練__■1．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是體外酶促合成特異性DNA片段的一種方法，其簡要過程如圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)敘述不正確的是(C)A．PCR技術(shù)是在試驗(yàn)室中以少量DNA制備大量DNA的技術(shù)B．反應(yīng)中新合成的DNA可以作為下一輪反應(yīng)的模板C．每擴(kuò)增一次溫度發(fā)生90℃→75℃→D．應(yīng)用PCR技術(shù)與DNA分子雜交技術(shù)可以檢測基因突變[解析]PCR技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)，能以少量DNA為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出大量的DNA，A正確；PCR技術(shù)須要模板DNA，且反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板，B正確；每擴(kuò)增一次溫度發(fā)生95℃→55℃→學(xué)問點(diǎn)PCR擴(kuò)增的計(jì)算與DNA含量的測定┃┃要點(diǎn)歸納__■1．理論上DNA呈指數(shù)方式擴(kuò)增。若起先只有一個(gè)DNA供應(yīng)模板，則循環(huán)n次后有2n個(gè)；若起先有N0個(gè)DNA供應(yīng)模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為N0·2n個(gè)。2．DNA含量的測定：DNA在260nm的紫外線波段有一劇烈的汲取峰，峰值的大小與DNA含量有關(guān)?？梢岳肈NA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測定，詳細(xì)方法如下：eq\x(\a\al(①稀釋：取2μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸,餾水，將樣品進(jìn)行50倍稀釋,))↓eq\x(\a\al(②比照調(diào)零：以蒸餾水作為空白比照，在,波長260nm處，將紫外分,光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)整至零,))↓eq\x(\a\al(③測定：取DNA稀釋液100μL至比色杯,中，測定260nm處的光汲取值,))↓eq\x(\a\al(④計(jì)算：DNA含量μg/mL＝50×260nm,的讀數(shù)×稀釋倍數(shù),))學(xué)問貼士PCR擴(kuò)增過程中的易錯(cuò)點(diǎn)①PCR過程中無解旋酶，破壞氫鍵須要上升溫度才能打開氫鍵，但此時(shí)的溫度還不能破壞磷酸二酯鍵，因此，熱變性后是DNA單鏈，并未分解成單體。②復(fù)性時(shí)只是在引物和DNA單鏈之間形成氫鍵，兩條單鏈之間并未形成氫鍵，因此復(fù)性后，無雙鏈DNA分子形成。┃┃典例評析__■典例2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外快速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。請回答下列問題：(1)DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模ǔ_磷酸基團(tuán)__的末端稱為5′端，當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的__3′端__起先延長DNA鏈。(2)PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題，但又導(dǎo)致了DNA聚合酶失活的問題。到20世紀(jì)80年頭，科學(xué)家從一種Taq細(xì)菌中分別到__耐高溫的DNA聚合酶__，它的發(fā)覺和應(yīng)用解決了上述問題；要將Taq細(xì)菌從其他一般的微生物中分別出來，所用的培育基叫__選擇培育基__。(3)PCR的每次循環(huán)可以分為三步：__變性、復(fù)性和延長__。假設(shè)在PCR反應(yīng)中，只有一個(gè)DNA片段作為模板，請計(jì)算在5次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有__32__個(gè)這樣的DNA片段。(4)簡述PCR技術(shù)的主要應(yīng)用。__遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定__(要求3項(xiàng)以上)。[解析](1)DNA聚合酶作用時(shí)必須要有一個(gè)引物，它只能把新的核苷酸加到已經(jīng)存在的核酸的3′羥基上，與DNA母鏈結(jié)合的RNA引物就供應(yīng)這個(gè)羥基。(2)因PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題，所以用于催化DNA復(fù)制過程的DNA聚合酶要具有耐高溫的特性。用選擇培育基可將Taq細(xì)菌從其他一般的微生物中分別出來。(3)DNA復(fù)制的兩條鏈均作為模板，進(jìn)行半保留復(fù)制，所以復(fù)制5次后得到的子代DNA分子數(shù)為25＝32個(gè)。(4)PCR技術(shù)可以對DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，所以可用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等方面。┃┃變式訓(xùn)練__■2．下列有關(guān)PCR技術(shù)的敘述正確的是(D)A．每一次擴(kuò)增必需不斷添加DNA序列作為模板B．反應(yīng)須要的DNA連接酶必需不斷的加進(jìn)反應(yīng)當(dāng)中C．反應(yīng)須要的DNA聚合酶必需不斷的加進(jìn)反應(yīng)當(dāng)中D．作為引物的脫氧核苷酸序列必需不斷的加進(jìn)每一次的擴(kuò)增當(dāng)中[解析]作為模板的DNA序列只要添加一次，起模板作用，A錯(cuò)誤；PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程中不須要DNA連接酶，B錯(cuò)誤；反應(yīng)須要的DNA聚合酶可以反復(fù)運(yùn)用，不須要不斷的加進(jìn)到反應(yīng)當(dāng)中，C錯(cuò)誤；模板鏈只要加入一次，引物片段必需不斷加入，DNA聚合酶可以反復(fù)運(yùn)用，D正確。故選D。指引迷津·撥云見日1．不能正確區(qū)分細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與PCRPCR技術(shù)是一種體外快速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的過程相比，既有相同點(diǎn)又有不同點(diǎn)，通過列表比較的方法精確駕馭兩者的異同，是防止解此類問題出錯(cuò)的重要措施。細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與體外DNA擴(kuò)增(PCR)的比較如下表：項(xiàng)目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR不同點(diǎn)解旋在解旋酶作用下邊解旋邊復(fù)制95℃高溫解旋，雙鏈完全分開酶解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP—溫度在體內(nèi)溫柔條件下高溫循環(huán)次數(shù)受生物自身限制，發(fā)生在細(xì)胞分裂間期，只復(fù)制一次在PCR儀中，一般要經(jīng)驗(yàn)30多次循環(huán)相同點(diǎn)①需供應(yīng)DNA復(fù)制的模板；②4種脫氧核苷酸作原料；③子鏈延長的方向都是從5′端到3′端；④都須要酶的催化典例3PCR過程與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程相比，主要有兩點(diǎn)不同，它們是(C )①PCR過程須要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA②PCR過程不須要DNA聚合酶③PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的限制來實(shí)現(xiàn)的④PCR過程中，DNA不須要解旋，干脆以雙鏈DNA為模板進(jìn)行復(fù)制A．③④ B．①②C．①③ D．②④[解析]PCR過程與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程相比，主要有兩點(diǎn)不同：(1)PCR過程須要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA，長度通常為20～30個(gè)核苷酸。(2)PCR過程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的限制來實(shí)現(xiàn)的。2．PCR的常見問題PCR試驗(yàn)很簡單出現(xiàn)假陰性或假陽性的結(jié)果。常見的緣由及預(yù)防措施如下：(1)出現(xiàn)假陰性①主要緣由：TaqDNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理導(dǎo)致不能復(fù)制；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)的設(shè)計(jì)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠等等。②補(bǔ)救措施：在原來擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入TaqDNA聚合酶，并增加5～10次循環(huán)。③預(yù)防措施：選用活力高、質(zhì)量好的TaqDNA聚合酶。在提取DNA模板時(shí)，要特殊留意避開提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等，不允許有機(jī)試劑的污染。PCR擴(kuò)增的先決條件以及特異性的凹凸，很大程度上取決于引物與靶DNA的互補(bǔ)狀況，尤其要保證引物3′端與靶基因互補(bǔ)。(2)出現(xiàn)假陽性①主要緣由：PCR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成非目標(biāo)DNA片段的大量增加，因此，模板DNA的污染是PCR出現(xiàn)假陽性的主要緣由。此外，樣品中存在的靶基因的同源序列也可能造成假陽性結(jié)果。②預(yù)防措施：隔離操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序、運(yùn)用一次性槍頭等。典例4PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較強(qiáng)的擴(kuò)增能力和極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。防止污染的方法不包括(C)A．將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行B．吸樣槍吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，槍頭小套、小離心管應(yīng)一次性運(yùn)用，以免交叉污染C．全部的PCR試劑都應(yīng)用大瓶分裝，以削減重復(fù)加樣次數(shù)，避開污染D．PCR試劑、PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰箱[解析]PCR所運(yùn)用的緩沖液和酶等應(yīng)分裝成小份，C錯(cuò)誤。核心素養(yǎng)·技能培優(yōu)案例請回答PCR技術(shù)方面的有關(guān)問題。(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似(如右圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延長的基礎(chǔ)。①從理論上推想，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為__15/16__。②在第__三__輪循環(huán)產(chǎn)物中起先出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖所示)，請分別說明理由。①第1組：__引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對而失效__；②第2組：__引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對而失效__。(3)PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下圖所示表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)開_DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上__。[思維過程](1)思索PCR技術(shù)擴(kuò)增的特點(diǎn)并進(jìn)行計(jì)算(可以在草稿紙上畫復(fù)制簡圖)。(2)視察兩組引物的特點(diǎn)，找出設(shè)計(jì)不合理的方面。(3)思索DNA聚合酶的功能。[解析](1)①依據(jù)PCR過程特點(diǎn)繪制PCR過程示意圖所示，由圖可知，以原來的每條母鏈為模板合成的兩個(gè)新DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子鏈為模板合成新DNA分子時(shí)，兩種引物都含有，故第四輪循環(huán)共產(chǎn)生16個(gè)DNA分子，其中含有引物A的DNA分子是15個(gè)，占15/16。②由圖示知，第一、二輪循環(huán)合成的子鏈長度均不同，依據(jù)半保留復(fù)制特點(diǎn)，前兩輪循環(huán)產(chǎn)生的4個(gè)DNA分子的兩條鏈均不等長，第三輪循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子中存在兩條核苷酸鏈等長的DNA片段。(2)引物是單鏈DNA時(shí)才能與DNA結(jié)合，而單鏈DNA的堿基互補(bǔ)配對部分簡單形成雙鏈結(jié)構(gòu)而失去其功能。從圖示可以看出，第Ⅰ組引物Ⅰ和引物Ⅱ局部堿基能互補(bǔ)配對，易形成雙鏈結(jié)構(gòu)而失效。第2組引物相互間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，但引物Ⅰ，自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)