蛋白質(zhì)折疊解讀

蛋白質(zhì)折疊

Proteinfolding

21世紀(jì)的生物學(xué)的重要課題蛋白質(zhì)合成的基本步驟蛋白質(zhì)折疊前后蛋白質(zhì)折疊定義蛋白質(zhì)折疊:從一條結(jié)構(gòu)松散的多肽鏈折疊成具有天然空間結(jié)構(gòu)（三級(jí)和四級(jí)）的蛋白質(zhì)分子的過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)折疊（proteinfolding）。狹義是蛋白質(zhì)特定三維空間結(jié)構(gòu)形成的規(guī)律、穩(wěn)定性和與其生物活性的關(guān)系。蛋白質(zhì)折疊是物理過(guò)程。多肽折疊成特定功能的三維結(jié)構(gòu)，“分子伴侶”的發(fā)現(xiàn)和鑒定改變了蛋白質(zhì)折疊研究的經(jīng)典概念研究蛋白質(zhì)折疊的意義蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的闡明將揭示生命體內(nèi)的第二套遺傳密碼，這是它的理論意義。蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)折疊研究的潛在應(yīng)用前景

折疊機(jī)制的闡明對(duì)包涵體的復(fù)性會(huì)有重要幫助。按照自己意愿設(shè)計(jì)我們需要的、具有特定功能的蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)折疊研究的潛在應(yīng)用前景深入了解蛋白質(zhì)折疊與錯(cuò)誤折疊的關(guān)系對(duì)于某些疾病的致病機(jī)制的闡明以及治療方法的尋找將大有幫助?；蚪M序列的發(fā)展使我們得到了大量的蛋白質(zhì)序列，結(jié)構(gòu)信息的獲得對(duì)于揭示它們的生物學(xué)功能是十分重要的。

一、研究蛋白質(zhì)折疊的三個(gè)階段（一）蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)假說(shuō)1961年Anfinsen發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶可變性后重折疊，同時(shí)保持酶活性，從而表明蛋白折疊所有要求的信息在其一級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)。1961年Anfinsen

發(fā)現(xiàn)：在折疊時(shí)，在環(huán)境條件（溫度，溶劑和組成等）一定，天然結(jié)構(gòu)是一個(gè)獨(dú)特的、穩(wěn)定的和動(dòng)力學(xué)自由能最低的。Anfinsen原理：Anfinsen'sdogma，自組裝（self-assembly）學(xué)說(shuō)，“自組裝熱力學(xué)假說(shuō)”，是分子生物學(xué)的一個(gè)假設(shè):順序決定構(gòu)象。Anfinsen因此而獲得1972年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。蛋白質(zhì)折疊的發(fā)現(xiàn)天然蛋白質(zhì)多肽鏈可以在體外復(fù)性；天然蛋白質(zhì)在生物學(xué)環(huán)境中處在熱力學(xué)最穩(wěn)態(tài)；多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學(xué)意義上穩(wěn)定的天然構(gòu)象所必需的全部信息。蛋白質(zhì)折疊的自組裝熱力學(xué)假說(shuō)Anfinsen'sdogma

按照自組裝學(xué)說(shuō),一級(jí)結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)的密碼叫作“第二遺傳密碼”。每個(gè)蛋白多肽翻譯從基因序列開(kāi)始生成線(xiàn)性的氨基酸鏈，這種多肽沒(méi)有三維結(jié)構(gòu)。然而鏈中氨基酸具有總的化學(xué)特征：疏水的，親水性，或帶電，可被認(rèn)為蛋白質(zhì)折疊機(jī)制每一步折疊都是正確的，充分的，必要的。實(shí)際上折疊過(guò)程是一個(gè)正確和錯(cuò)誤途徑相互競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程。邊合成邊折疊同時(shí)進(jìn)行的協(xié)調(diào)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。Anfinsen'sdogma

按照自組裝學(xué)說(shuō),一級(jí)結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)的密碼叫作“第二遺傳密碼”。每個(gè)蛋白多肽翻譯從基因序列開(kāi)始生成線(xiàn)性的氨基酸鏈，這種多肽沒(méi)有三維結(jié)構(gòu)。然而鏈中氨基酸具有總的化學(xué)特征：疏水的，親水性，或帶電，可被認(rèn)為蛋白質(zhì)折疊機(jī)制每一步折疊都是正確的，充分的，必要的。實(shí)際上折疊過(guò)程是一個(gè)正確和錯(cuò)誤途徑相互競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程。邊合成邊折疊同時(shí)進(jìn)行的協(xié)調(diào)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。（二）蛋白質(zhì)折疊的問(wèn)題——

蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)悖論蛋白質(zhì)折疊：熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問(wèn)題在生理?xiàng)l件下多肽鏈折疊是熱力學(xué)上有利的過(guò)程多肽鏈折疊是一個(gè)動(dòng)力學(xué)的問(wèn)題一個(gè)在熱力學(xué)上可以成立的反應(yīng)由于動(dòng)力學(xué)能障在實(shí)際上未必可以完成。蛋白質(zhì)在體外折疊和在細(xì)胞內(nèi)折疊的問(wèn)題理論研究和實(shí)驗(yàn)研究的問(wèn)題蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)學(xué)說(shuō)認(rèn)為在蛋白折疊途徑中存在著某個(gè)或某些能級(jí)勢(shì)壘，阻礙蛋白質(zhì)形成最穩(wěn)定的空間構(gòu)象，從而使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)處在某種亞穩(wěn)態(tài)。（三）蛋白質(zhì)折疊的能級(jí)形貌理論為了解決了熱力學(xué)假說(shuō)和動(dòng)力學(xué)悖論之間的矛盾，人們又提出了能級(jí)形貌（energylandscape）理論。該理論認(rèn)為，蛋白質(zhì)分子是一組具有不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)的分子群，在折疊過(guò)程中各個(gè)分子沿著各自途徑進(jìn)行折疊，不存在單一的、特異的折疊途徑。在折疊初期，分子結(jié)構(gòu)松散，自由能大，可選擇的構(gòu)象熵（conformationalentropy）也大。蛋白質(zhì)多肽鏈（隨機(jī)結(jié)構(gòu)）通過(guò)構(gòu)象塌陷或表面張力或疏水作用形成緊湊結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)在拓?fù)鋵W(xué)上同蛋白質(zhì)活性結(jié)構(gòu)顯示類(lèi)似性，表現(xiàn)出結(jié)果的局部趨穩(wěn)性。隨著折疊的進(jìn)行，這些結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)局部的重構(gòu)造，折疊中間體數(shù)目不斷減少，形成的折疊中間體的構(gòu)象越來(lái)越穩(wěn)定，即自由能越來(lái)越小，構(gòu)象熵越來(lái)越小，最終形成熱力學(xué)最穩(wěn)定的、自由能最小的、唯一的天然構(gòu)象，這一系列逐步收斂的變化呈漏斗狀。

能級(jí)形貌（energylandscape）理論蛋白質(zhì)折疊的原理Anfinsen學(xué)說(shuō)：自組裝（self-assembly）Ellis1987年提出了蛋白質(zhì)“輔助性組裝學(xué)說(shuō)”。體內(nèi)蛋白質(zhì)折疊往往需要其他輔助因子參與，并伴有ATP的水解。因此，蛋白質(zhì)折疊是一個(gè)熱力學(xué)過(guò)程，也受動(dòng)力學(xué)控制。有的學(xué)者基于有些相似氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有不同的折疊結(jié)構(gòu)，而一些不同氨基酸序列的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上卻相似的現(xiàn)象，提出了mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可能作為一種遺傳密碼從而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的假說(shuō)。目前為止，對(duì)蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍是不完整的，甚至有些方面還存在著錯(cuò)誤的觀點(diǎn)。蛋白質(zhì)折疊與生物信息流在生物體內(nèi)，生物信息流動(dòng)可分為兩個(gè)部分：第一部分是存儲(chǔ)于DNA序列中的遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯傳入蛋白質(zhì)的一級(jí)序列中，這是一維信息之間的傳遞，三聯(lián)子密碼介導(dǎo)了這一傳遞過(guò)程第二部分是肽鏈經(jīng)過(guò)疏水塌縮、空間盤(pán)曲、側(cè)鏈聚集等折疊過(guò)程形成蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，同時(shí)獲得生物活性，從而將生命信息表達(dá)出來(lái)蛋白質(zhì)折疊是一維信息向三維信息的轉(zhuǎn)化過(guò)程細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊

體內(nèi)折疊過(guò)程往往與翻譯共啟始，因此，N-末端蛋白開(kāi)始折疊，而C-末端部分仍在合成。

氨基酸序列與折疊密切相關(guān)

化學(xué)修飾往往與肽鏈的折疊密切相關(guān)

折疊是有序的、由疏水力推動(dòng)的協(xié)同過(guò)程。

最近的理論提出了蛋白質(zhì)折疊氫鍵的貢獻(xiàn)

伴侶分子在折疊中起著輔助性的作用

折疊在越膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中：解開(kāi)折疊后才能越膜。蛋白質(zhì)折疊的途徑蛋白質(zhì)折疊的途徑

獨(dú)立折疊

熱休克蛋白70輔助蛋白質(zhì)折疊HSP70和伴侶協(xié)助配合下折疊（四）蛋白質(zhì)折疊的理論模型框架模型（FrameworkModel）疏水塌縮模型（HydrophobicCollapseModel）擴(kuò)散-碰撞-粘合機(jī)制（Diffusion-Collision-AdhesionModel）成核-凝聚-生長(zhǎng)模型（Nuclear-Condensation-GrowthModel）拼版模型（Jig-SawPuzzleModel）框架模型（FrameworkModel）

假設(shè)蛋白質(zhì)局部構(gòu)象依賴(lài)于局部的氨基酸序列

在多折疊的起始階段,先迅速形成不穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元，稱(chēng)為“flickeringcluster”

隨后二級(jí)結(jié)構(gòu)靠近,形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)框架

最后二級(jí)結(jié)構(gòu)框架相互拼接，漸緊縮，形成三級(jí)結(jié)構(gòu)。

這個(gè)模型認(rèn)為即使是一個(gè)小分子的蛋白也可以一部分一部分的進(jìn)行折疊,其間形成的亞結(jié)構(gòu)域是折疊中間體的重要結(jié)構(gòu)。疏水塌縮模型

（HydrophobicCollapseModel）

在疏水塌縮模型中，疏水作用力被認(rèn)為是在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中起決定性作用的力的因素。在形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之前首先發(fā)生很快的非特異性的疏水塌縮。擴(kuò)散-碰撞-粘合機(jī)制

Diffusion-Collision-AdhesionModel）

蛋白質(zhì)的折疊起始于伸展肽鏈上的幾個(gè)位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)上生成不穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元或疏水簇，主要依靠局部序列（3-4個(gè)殘基）相互作用來(lái)維系。疏水簇以非特異性布朗運(yùn)動(dòng)方式擴(kuò)散、碰撞、相互黏附，導(dǎo)致大的結(jié)構(gòu)生成并增加穩(wěn)定性。進(jìn)一步碰撞形成具有疏水核心和二級(jí)結(jié)構(gòu)的類(lèi)熔球態(tài)中間體。球形中間體調(diào)整為致密的、無(wú)活性的類(lèi)似天然結(jié)構(gòu)的高度有序熔球態(tài)結(jié)構(gòu)。最后無(wú)活性高度有序熔球態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾谢盍Φ奶烊粦B(tài)。成核-凝聚-生長(zhǎng)模型

（Nuclear-Condensation-GrowthModel）肽鏈中的某一區(qū)域可以形成“折疊晶核”，以它們?yōu)楹诵?，整個(gè)肽鏈繼續(xù)折疊進(jìn)而獲得天然構(gòu)象。所謂“晶核”實(shí)際上是由一些特殊的氨基酸殘基形成的類(lèi)似于天然態(tài)相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這些殘基間不是以非特異的疏水作用維系的，而是由特異的相互作用使這些殘基形成了緊密堆積。晶核的形成是折疊起始階段限速步驟。拼版模型

（Jig-SawPuzzleModel）中心思想是多肽鏈可以沿多條不同的途徑進(jìn)行折疊,在沿每條途徑折疊的過(guò)程中都是天然結(jié)構(gòu)越來(lái)越多,最終形成天然構(gòu)象每條途徑的折疊速度都較快,與單一途徑折疊方式相比,多肽鏈速度較快,另一方面,外界生理生化環(huán)境的微小變化或突變等因素可能會(huì)給單一折疊途徑造成較大的影響這些變化可能給某條折疊途徑帶來(lái)影響,但不影響另外的折疊途徑,因而不會(huì)從總體上干擾多肽鏈的折疊二、決定蛋白質(zhì)折疊的外部條件和內(nèi)在因素（一）生物大分子的擁擠效應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的總濃度可達(dá)到200～300g／L，RNA的濃度可達(dá)到75～150g／L（二）溫度和pH的影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞的溫度大約在37℃附近，pH值一般在中性范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)復(fù)性如果在體外這樣的條件下進(jìn)行，通常會(huì)形成大量的聚集物，具有生物活性的蛋白質(zhì)的回收率也極低。為了得到高產(chǎn)率的復(fù)性，往往降低溫度到4℃，復(fù)性蛋白的濃度也很低，通常大約在1mg/ml。針對(duì)不同的蛋白，體外折疊所選用的pH值范圍也很不同。（三）金屬離子的配位效應(yīng)金屬離子通過(guò)與內(nèi)源配體（氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)）和外源配體（如水分子、卟啉環(huán)、有機(jī)小分子等）的配位，結(jié)合到蛋白質(zhì)分子中形成金屬活性部位，從而影響蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程以及蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)。（四）a-螺旋的形成（五）脯氨酸殘基酰胺鍵的順?lè)串悩?gòu)化作用三、參與蛋白質(zhì)折疊的特殊分子分子伴侶（chaperon）概念：伴隨蛋白質(zhì)構(gòu)象正確形成的一類(lèi)蛋白質(zhì)。類(lèi)別：分子伴侶蛋白折疊酶DNA分子伴侶功能：①結(jié)合疏水基團(tuán)②校正③指導(dǎo)二硫鍵正確配對(duì)等分子伴侶提出1987，Lasky首先將細(xì)胞核內(nèi)能與組蛋白結(jié)合并能介導(dǎo)核小體有序組裝的核質(zhì)素（nucleoplasmin）稱(chēng)為分子伴侶。1987

Ellis的定義，一類(lèi)在序列上沒(méi)有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)幫助其他多肽完成正確組裝，而在組裝完后與之分離1987年，Ikemura發(fā)現(xiàn)枯草桿菌素的折疊需要前肽（propeptide）的幫助。Shinde和Inouye將這類(lèi)前肽稱(chēng)為分子內(nèi)伴侶（intramolecularchaperones）。分子伴侶的特征分子伴侶對(duì)靶蛋白沒(méi)有高度專(zhuān)一性，同一分子伴侶可以促進(jìn)多種氨基酸序列完全不同的多肽鏈折疊成為空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)性質(zhì)和功能都不相關(guān)。催化效率很低。需要水解ATP，構(gòu)象改變，釋放底物，進(jìn)行再循環(huán)。它是阻止錯(cuò)誤折疊，而不是促進(jìn)正確折疊。多能性（脅迫保護(hù)，防止交聯(lián)聚沉，轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，組裝細(xì)胞骨架）進(jìn)化保守性

分子伴侶的作用機(jī)制分子伴侶的功能是識(shí)別新生肽段折疊過(guò)程中暫時(shí)暴露的錯(cuò)誤結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合生成復(fù)和物，從而防止這些表面間過(guò)早的相互作用，阻止不正確的非功能折疊途徑，抑制不可逆聚合物產(chǎn)生，促進(jìn)折疊向正確方向進(jìn)行。分子伴侶的作用機(jī)制實(shí)際上就是它如何與靶蛋白識(shí)別，結(jié)合，又解離的機(jī)制。。分子伴侶的作用過(guò)程分子伴侶作用的第一步是識(shí)別。一般的分子伴侶識(shí)別特異性不高，識(shí)別非天然構(gòu)象，而不是天然的構(gòu)象。有的分子伴侶-“私有分子伴侶”

具高度專(zhuān)一性。分子伴侶識(shí)別所謂熔球體結(jié)構(gòu)（moltenglobule），熔球體可能是有疏水表面。分子伴侶作用的第二步是與靶蛋白形成復(fù)合物。分子伴侶常以多聚體形式形成中心空洞的結(jié)構(gòu)，電子顯微鏡已觀察到由二圈圓面包圈形組成的十四體groel分子和一個(gè)一層圓面包圈的七體groes分子作用形成中空的非對(duì)稱(chēng)籠狀結(jié)構(gòu)（cage

model），推測(cè)靶蛋白可以在與周?chē)h(huán)境隔離的中間空腔內(nèi)不受干擾的進(jìn)一步折疊。熱休克蛋白熱休克蛋白HeatShockProteins(HSPs),是細(xì)胞在應(yīng)激原特別是高溫誘導(dǎo)下生成的一組蛋白質(zhì)。廣泛存在各生物中。許多熱休克蛋白具有分子伴侶活性。按照蛋白的大小共分為五類(lèi)，分別為HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子熱休克蛋白。HSP分子量都在80～110kD、68～74kD和18～30kD之間。不同分子量的HSP在細(xì)胞內(nèi)的分布也有所不同HSP一個(gè)重要特點(diǎn)是進(jìn)化的高度保守性熱休克蛋白促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的基本作用——結(jié)合保護(hù)待折疊多肽片段，再釋放該片段進(jìn)行折疊。形成HSP70和多肽片段依次結(jié)合、解離的循環(huán)。

HSP40結(jié)合待折疊多肽片段HSP70-ATP復(fù)合物

HSP40-HSP70-ADP-多肽復(fù)合物

ATP水解GrpEATPADP復(fù)合物解離，釋出多肽鏈片段進(jìn)行正確折疊

伴侶素GroEL/GroES系統(tǒng)促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊過(guò)程

伴侶素的主要作用——為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成天然空間構(gòu)象的微環(huán)境。幫助蛋白質(zhì)折疊的酶幫助蛋白質(zhì)折疊的酶目前只有兩個(gè)：蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein

disulfide

isomerasePDI);

肽基脯氨酸順?lè)串悩?gòu)酶(peptidylprolylcis-transisomerase，PPI)。折疊酶蛋白質(zhì)多膚鏈的折疊過(guò)程中，還需要酶的催化，稱(chēng)之為折疊酶。它們催化與蛋白質(zhì)折疊直接有關(guān)的、對(duì)形成功能構(gòu)象所必需的共價(jià)鍵變化，幫助蛋白質(zhì)正確折疊。折疊酶類(lèi)型(1)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶PDI(Proteindisulfideisomerase)(2)肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶PPI(Peptidylprolylcis/transisomerase)蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)

真核生物的PDI在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔活性很高，細(xì)菌中的類(lèi)似物是Dsb家族，位于細(xì)菌外周質(zhì)(periplasm)，在肽鏈中催化錯(cuò)配二硫鍵斷裂并形成正確二硫鍵連接，最終使蛋白質(zhì)形成熱力學(xué)最穩(wěn)定的天然構(gòu)象。通過(guò)催化巰基與二硫鍵的交換反應(yīng)，從而催化蛋白質(zhì)二硫鍵的形成、還原（斷裂）或重排（異構(gòu)化）。在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中，主要催化含有二硫鍵的膜蛋白或分泌蛋白的正確折疊。肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(PPI)

PPI廣泛分布于各種生物體及各種組織中，多數(shù)定位于胞漿，但也存在于大腸桿菌的外周質(zhì)、紅色面包霉的線(xiàn)粒體基質(zhì)、酵母、果蠅和哺乳動(dòng)物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶是蛋白質(zhì)三維構(gòu)象形成的限速酶，在細(xì)胞中通過(guò)非共價(jià)鍵方式，穩(wěn)定扭曲的酰胺過(guò)度態(tài)，而催化肽基脯氨酰順?lè)词降南嗷マD(zhuǎn)變。在肽鏈合成后需形成順式構(gòu)型時(shí)，可使多肽在各脯氨酸彎折處形成準(zhǔn)確折疊。PDI和PPI不僅可以起到折疊酶的催化作用，而且具有防止折疊中間體聚集的類(lèi)似分子伴侶的功能。王志珍等最早提出PDI是分子伴侶的假說(shuō)并驗(yàn)證了PDI的這一功能分子伴侶研究的應(yīng)用分子伴侶的研究成果必然會(huì)大大加深我們對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)。由于分子伴侶在生命活動(dòng)的各個(gè)層次都具有重要作用，它的突變和損傷也必定會(huì)引起疾病，因此可以期望運(yùn)用分子伴侶的知識(shí)來(lái)治療所謂的”分子伴侶病”。利用對(duì)分子伴侶的研究成果從根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率。分子內(nèi)分子伴侶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，許多有前導(dǎo)肽（Pro肽）的前體形式的蛋白質(zhì)，必須要有Pro肽的參與才能完成折疊過(guò)程，不能自發(fā)形成具有活性的酶，如枯草桿菌素（Subtilisin）、α-水解蛋白酶（α-lyricprotease，α-LP）、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、霍亂弧菌毒、羧肽酶Y等。顯然，Pro肽具備了分子伴侶的作用。為了與普遍意義上的分子伴侶相區(qū)別，Shinde和Inouye于1993年提出了分子內(nèi)分子伴侶（intramolecularchaperone，IMC）的概念。分子內(nèi)分子伴侶IMCIMC可以獨(dú)立于蛋白質(zhì)對(duì)其折疊反應(yīng)起作用，說(shuō)明Pro肽與蛋白質(zhì)之間可能存在特異性的相互作用，它們可以相互識(shí)別。因此，可以將Pro肽看作是一個(gè)折疊酶，它可以特異性地催化與其共價(jià)連接的蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程。在生物體內(nèi)，這種共價(jià)連接的IMC輔助的蛋白質(zhì)折疊模式，可以大大提高蛋白質(zhì)折疊的效率。因?yàn)橹苯訉⒋呋负偷孜镞B接在一起．可以將催化反應(yīng)變成一個(gè)分子內(nèi)反應(yīng)。分子內(nèi)分子伴侶IMC分類(lèi)I類(lèi)主要參與多肽鏈的延伸和正確折疊，如枯草桿菌素、α水解蛋白酶等，在前導(dǎo)肽中包含了蛋白正確折疊并獲得生物活性的信息，II類(lèi)的功能主要是參與蛋白在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位，并不直接參與蛋白質(zhì)的折疊，如生長(zhǎng)激素抑制素Ⅱ（sornatostatinⅡ）、綠過(guò)氧物酶（myeloperoxidase）等，在前導(dǎo)肽中包含了蛋白質(zhì)分選的信息，引導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確分泌。分子內(nèi)分子伴侶IMCIMC介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊主要有幾個(gè)特點(diǎn)：①I(mǎi)MC在體內(nèi)與多肽鏈以共價(jià)鍵結(jié)合，具有高度特異性；②IMC在結(jié)構(gòu)及編碼基因上與它作用的蛋白質(zhì)緊密相連；③IMC可與經(jīng)它作用后以折疊的蛋白質(zhì)（酶）相互作用，并是其競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑；④IMC釋放“底物”是ATP非依賴(lài)性的，但取決于折疊完成的“底物”或胞內(nèi)蛋白酶的酶解作用。分子伴侶概念的擴(kuò)充分子伴侶也不再局限于蛋白質(zhì)（包括酶）分子。生物膜上的磷脂酰乙醇胺是乳糖透性酶正確折疊所必需的，被稱(chēng)為“脂分子伴侶”，蛋白穩(wěn)定劑——甘油和其他多元醇，它不提供結(jié)構(gòu)信息，但是可以通過(guò)增加蛋白質(zhì)的水化作用而穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，從而提高折疊的效率，被稱(chēng)為“化學(xué)分子伴侶”。DNA

chaperones，DNA分子伴侶，是與DNA結(jié)合并幫助DNA折疊的蛋白質(zhì)。DNA分子伴侶中DNA分子包圍在蛋白質(zhì)分子的表面，既高度有序，又一定程度上的結(jié)構(gòu)改變。這種相互作用對(duì)DNA的轉(zhuǎn)錄，復(fù)制及重組十分重要。如在核小體中NA的包裝。DNA分子伴侶的作用就是幫助DNA進(jìn)行折疊和扭曲，從而把DNA穩(wěn)定在一個(gè)適合于和蛋白結(jié)構(gòu)的特定構(gòu)型中。這種結(jié)合是協(xié)同的，可逆的。分子伴侶與最終闡明中心法則--當(dāng)前主要問(wèn)題有密切關(guān)系。DNA分子伴侶RNA分子伴侶RNA結(jié)合幫助RNA折疊的稱(chēng)為“RNA分子伴侶”，很多蛋白如核糖核蛋白、核蛋白殼以及信賴(lài)RNA的ATP酶，都具有“RNA分子伴侶”的活性。四、膜蛋白的折疊問(wèn)題a-螺旋跨膜蛋白折疊的“二步模型（two-stagemodel）”。第一步是形成約25個(gè)氨基酸的疏水a(chǎn)-螺旋，插入膜中。第二步是在膜內(nèi)疏水條件下，內(nèi)部螺旋相互作用，引導(dǎo)蛋白質(zhì)趨向天然結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)折疊研究技術(shù)研究表明：每種蛋白質(zhì)都用自身偏好的方式進(jìn)行折疊。某些蛋白質(zhì)可在十億分之幾秒內(nèi)折疊起來(lái)，某些則要耗費(fèi)數(shù)毫秒才能卷縮成首選結(jié)構(gòu)。由于蛋白質(zhì)折疊如此之快，所以對(duì)其研究很困難。費(fèi)城賓夕法尼亞大學(xué)FengGai研究組創(chuàng)造出極簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)，可折疊成最普通的螺旋。對(duì)蛋白質(zhì)上氨基酸用C13標(biāo)記，將它們放入水浴并用激光照射整個(gè)系統(tǒng)。激光對(duì)蛋白質(zhì)加熱十億分之三秒，使其打開(kāi)折疊。然后在重新折疊時(shí)用紅外光譜觀察C13和其他原子間化學(xué)鍵的變化情況。記錄一段“延長(zhǎng)了的”信號(hào)，表明蛋白質(zhì)以不同的速度不同的途徑進(jìn)行折疊。Weizmann研究小組將蛋白“誘騙”到由脂質(zhì)構(gòu)成的小泡中，小泡約100納米寬，蛋白質(zhì)在小泡中可自由移動(dòng)，能夠被聚焦的激光束完全照射到（激光束約為300納米寬）。研究證明即使最終形狀一樣的蛋白質(zhì)也通過(guò)不同路線(xiàn)折疊。多種技術(shù)結(jié)合：光譜學(xué)，波譜學(xué)和x

射線(xiàn)分析?？焖俸舜殴舱窦夹g(shù)已經(jīng)能夠在秒到皮秒的時(shí)間域上觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)過(guò)程，其中包括主鏈和側(cè)鏈的運(yùn)動(dòng)，以及在各種不同的溫度和壓力下蛋白質(zhì)的折疊和去折疊過(guò)程?？焖俟庾V技術(shù)（熒光，遠(yuǎn)紫外和近紫外圓二色

目前唯一解出晶體結(jié)構(gòu)的分子伴侶是E.coli的papd幫助鞭毛蛋白折疊的分子伴侶。還有hsp70的n端結(jié)構(gòu)域，即atp結(jié)合域也以有晶體結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)折疊研究技術(shù)蛋白質(zhì)折疊?。╢olddisease)蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列沒(méi)有改變，即一級(jí)結(jié)構(gòu)正常，只是其二級(jí)結(jié)構(gòu)、乃至立體結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）異常也可導(dǎo)致疾病，這類(lèi)疾病稱(chēng)為“構(gòu)象病”，或稱(chēng)“折疊病”蛋白質(zhì)折疊病

兩項(xiàng)新的科學(xué)研究：美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院塞爾科（Dennis

J.

Selkoe）在《自然》雜志上報(bào)告他們提取了百萬(wàn)分之一正常時(shí)產(chǎn)生β淀粉樣蛋白和低聚體（二聚體、三聚體和四聚體），將之注入到實(shí)驗(yàn)室大鼠中，它嚴(yán)重地?fù)p害了大鼠產(chǎn)生記憶的能力。提出了阿茲海默病中有淀粉樣蛋白形成的假設(shè)。英國(guó)劍橋大學(xué)多森（Christopher

M.

Dobson）研究小組在同一期雜志上報(bào)告說(shuō)他們從細(xì)菌和牛體內(nèi)提取出兩種無(wú)害的蛋白質(zhì)，使它們結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生折疊錯(cuò)誤。結(jié)果變性后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊削弱了實(shí)驗(yàn)鼠的細(xì)胞功能。蛋白質(zhì)折疊病的歷史早在三百年前，人類(lèi)在綿羊和小山羊中首次發(fā)現(xiàn)了“羊搔癢癥”。該病廣泛傳播于歐洲和澳洲，潛伏期18到26個(gè)月，患病動(dòng)物興奮、搔癢、癱瘓直至死亡。后來(lái)又相繼發(fā)現(xiàn)了傳染性水貂腦軟化病、馬鹿和鹿的慢性消瘦病、貓的海綿狀腦病等。1996年春天英國(guó)蔓延的“瘋牛病”，它不僅引起英國(guó)一場(chǎng)空前的經(jīng)濟(jì)和政治動(dòng)蕩，也波及了整個(gè)歐洲，人類(lèi)朊病毒現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)以下四種，即庫(kù)魯病、克雅氏綜合癥（法國(guó)克羅伊茨菲爾德—雅各布氏癥）、格斯特曼綜合癥和致死性的家族失眠癥，蛋白質(zhì)折疊病1983年“植物和動(dòng)物亞病毒病源：類(lèi)病毒和朊病毒國(guó)際會(huì)議”正式把朊病毒歸入亞病毒領(lǐng)域。人:震顫?。↘URU?。⒖搜攀喜。–JD）、吉斯綜合癥（GSS）、致死性家族失眠癥（FFI）、老年性癡呆癥、囊性纖維病變、家族性高膽固醇癥、家族性淀粉樣蛋白癥、某些腫瘤、白內(nèi)障等動(dòng)物;羊瘙癢?。⊿crapie）、牛海綿腦病（BSE俗稱(chēng)瘋牛?。┖吐埂⒇?、水貂等的海綿腦病從本質(zhì)上講分子伴侶突變引起的疾病蛋白折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)異常引起的疾病從機(jī)制上講質(zhì)量控制系統(tǒng)——滯留（retaining）折疊異常質(zhì)量控制系統(tǒng)-滯留

許多編碼基因的細(xì)微突變?nèi)琰c(diǎn)突變或個(gè)別氨基酸的缺失，編碼蛋白還具有絕大部分生物活性，只是出現(xiàn)蛋白產(chǎn)物極細(xì)微的折疊異常，卻可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。部分原因是“質(zhì)控系統(tǒng)”在發(fā)揮作用：蛋白產(chǎn)物極細(xì)微的折疊異常，雖然對(duì)活性影響不大，卻可以被分子伴侶等識(shí)別而滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，不能實(shí)現(xiàn)正常的轉(zhuǎn)位、轉(zhuǎn)運(yùn)或分泌，從而不能到達(dá)生理位置執(zhí)行正常的功能，導(dǎo)致疾病發(fā)生。典型例子：α1

抗胰蛋白酶缺陷病α1抗胰蛋白酶發(fā)生突變時(shí)，僅有15%的蛋白質(zhì)分泌出來(lái)，其余全部滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中。這種滯留的原因部分是由ER的分子伴侶calnexin介導(dǎo)了折疊異常的突變蛋白的聚集。而異常產(chǎn)物的聚集大大妨礙了細(xì)胞的正常活動(dòng)，導(dǎo)致肝硬化（cirrhosis）或肺氣腫（emphysema）的發(fā)生。當(dāng)然，并不是所有的蛋白折疊異常都導(dǎo)致定位異常。有些蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類(lèi)疾病包括：人紋狀體脊髓變性?。–reutzfeldt-Jakobdisease,CJD）、老年癡呆癥（Alzheimer‘s）、亨停頓舞蹈病(Huntington’sdisease,HD)、瘋牛病等等。朊病毒朊病毒病的病原體究竟是什么？蓋杜賽克等曾將庫(kù)魯病死者腦組織制成無(wú)菌、無(wú)原蟲(chóng)的懸浮液，注入黑猩猩的顱腔，20個(gè)月時(shí)，黑猩猩發(fā)病，其癥狀與人相似，提示病原體不是細(xì)菌或原蟲(chóng)。20世紀(jì)60年代，英國(guó)放射生物學(xué)家阿普（T.Alper）將羊搔癢癥致病組織用會(huì)導(dǎo)致核酸失活的放射線(xiàn)輻射，發(fā)現(xiàn)處理過(guò)的致病組織仍有傳染性，提出羊搔癢癥的病因可能是不含核酸的蛋白質(zhì)，但這樣的觀點(diǎn)有悖于“核酸為中心”的觀念，因而當(dāng)時(shí)未得到人們的重視。朊病毒定名直至1982年，美國(guó)神經(jīng)學(xué)與生物化學(xué)家魯辛納在致病因子的探尋方面作了8年研究之后，提出該致病因子確實(shí)不含核酸，而是蛋白質(zhì)。為了能把他與細(xì)菌、真菌、病毒及其他已知病原體相區(qū)別，他將這種蛋白質(zhì)致病因子定名為朊病毒（Prion），對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)單體稱(chēng)為朊病毒蛋白，相應(yīng)疾病稱(chēng)為朊病毒病。1997年美國(guó)生物學(xué)家斯垣利·普魯辛納（S.B.Prusiner）由于研究朊病毒獲諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。朊病毒與常規(guī)病毒朊病毒與常規(guī)病毒一樣:可濾過(guò)性傳染性致病性對(duì)宿主范圍的特異性但它比已知的最小的常規(guī)病毒還小得多（約30～50nm）。電鏡下觀察不到病毒粒子的結(jié)構(gòu)，且不呈現(xiàn)免疫效應(yīng)，不誘發(fā)干擾素產(chǎn)生，也不受干擾作用。朊病毒是蛋白質(zhì)，它對(duì)蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑如苯酚、尿素等的處理無(wú)耐受性，但卻有不同于一般蛋白質(zhì)的特征，即耐高溫性和抗蛋白酶性。朊病毒目前尚未有有效的治療方法，因此屬“不治之癥?！比藗冎荒懿扇∠鄳?yīng)措施預(yù)防，如消滅染病牲畜，對(duì)病人進(jìn)行適當(dāng)隔離；禁止食用可能傳染的食物，禁止使用可能污染的藥物；對(duì)神經(jīng)外科的操作器械進(jìn)行嚴(yán)格處理，對(duì)角膜及硬腦膜的移植應(yīng)排除供者患朊病者的可能；家族性疾病的未患病成員更應(yīng)注意預(yù)防朊病毒致病朊病毒蛋白既然是動(dòng)物細(xì)胞基因編碼的產(chǎn)物，為什么并不引起全部動(dòng)物致?。窟@是由于朊病毒蛋白分子本身不能致病，而必須發(fā)生空間結(jié)構(gòu)上的變化轉(zhuǎn)化為朊病毒才會(huì)損害神經(jīng)元。這一變化恰恰是朊病毒脅迫所致的。一個(gè)致病分子先與一個(gè)正常分子結(jié)合，在致病分子的作用下，正常分子轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏》肿?，然后這兩個(gè)致病分子分別與兩個(gè)正常分子結(jié)合，再使后者轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏》肿?。周而?fù)始，通過(guò)多米諾效應(yīng)倍增致病。由此可見(jiàn)，致病的基本條件有二，一是具有朊病毒，二是具有朊病毒蛋白。朊病毒一般性質(zhì)朊病毒是一種蛋白感染因子，Prusiner等人證明是細(xì)胞正常蛋白的錯(cuò)誤折疊成的朊病毒蛋白（PrionProtein,PrP）積累而引起的。朊病毒蛋白(PrP)分子量為27-30KD，是朊病毒的基本單位，PrP本身不具有侵染性，由3個(gè)PrP分子構(gòu)成的“朊病毒單位”具有高度侵染性。PrP還能聚合成桿狀顆粒，約由1000個(gè)PrP構(gòu)成,這種桿總是排列成叢。桿和叢都有傳染性。PrP包括兩種形式：細(xì)胞型（thenormalorcellularformofprionprotein,PrPc）和異常型（thepathogenicorscrapieformofprionprotein,PrPSc）。PrPc分子量33-35KD，含一對(duì)二硫鍵和2個(gè)N型復(fù)合寡糖鏈，都在PrP的C端。N端含22個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，C端含由23個(gè)氨基酸組成的糖基磷酸肌醇錨體結(jié)合位點(diǎn)（GPI）。PrPc是一種膜蛋白，已證明它是定位于細(xì)胞膜的穴樣內(nèi)陷類(lèi)結(jié)構(gòu)域（CLDS）。PrPSc與PrPc的不同生化特性PrPSc在非變性去污劑中是不溶的PrPSc相對(duì)的抗蛋白酶水解PrPc和PrPSc都依賴(lài)GPI附著在細(xì)胞膜表面經(jīng)磷酸肌醇脂酶C酶解后，PrPc從膜上釋放出來(lái),而PrPSc不釋放TritonX-100進(jìn)行相分配后，PrPc處于水相,而PrPSc處于TritonX-100相中特異的抗體只與PrPSc有血清反應(yīng)，而與PrPc

無(wú)反應(yīng)，兩者含有不同的構(gòu)象表位。糖基化比例和部位不同：PrPSc糖基化比例要低于PrPC。朊病毒是蛋白質(zhì)，它對(duì)蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑如苯酚、尿素等的處理無(wú)耐受性，但卻有不同于一般蛋白質(zhì)的特征，即耐高溫性和抗蛋白酶性。蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)生命的進(jìn)化使細(xì)胞獲得了一種“蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)”。"質(zhì)量控制體系"能夠像處理垃圾一樣，將錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)清除。細(xì)胞的“垃圾處理”系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)失常，可能接觸誤折疊蛋白聚集成的不溶解顆粒，早老性老年癡呆及多種大腦疾病的通常癥狀折疊發(fā)生錯(cuò)誤，這些疏水的殘基就會(huì)暴露在分子的表面，誤折疊的蛋白質(zhì)就會(huì)聚集起來(lái)形成不溶物。這些不溶物中最著名的是在Alzheimers

disease癥狀中出現(xiàn)的淀粉斑－amyloid-β（Aβ）。

庫(kù)魯病庫(kù)魯?。↘uru病）是20世紀(jì)上半世紀(jì)大西洋的巴布亞—新幾內(nèi)亞?wèn)|部福雷族高地居民中的一種局部流行病，其主要癥狀為震顫、共濟(jì)失調(diào)、腦退化癡呆，漸至完全喪失運(yùn)動(dòng)能力，3～6個(gè)月內(nèi)因衰竭而死亡?！癒uru”在該部落意為“恐懼”或“寒顫”，故稱(chēng)該病為庫(kù)魯病，患者總數(shù)約為3萬(wàn)，以女性和未成年兒童居多。美國(guó)醫(yī)學(xué)家蓋杜賽克曾在該地區(qū)進(jìn)行20年研究，探明該病的發(fā)生與當(dāng)?shù)厝耸秤萌巳獾募漓敕绞矫芮嘘P(guān)聯(lián)，并提出了預(yù)防措施。1968年停止該儀式后該病得到控制，從而拯救了一個(gè)部落的人群，蓋杜賽克為此獲得了1976年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?；蛲蛔?nèi)祟?lèi)格斯特曼綜合癥和致死性的家族性失眠癥已被確定是由于編碼該蛋白的基因發(fā)生了突變，因此具有遺傳性，這些突變致使所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易于轉(zhuǎn)變?yōu)殡貌《?。近年?lái)已鑒定到數(shù)十個(gè)傳播的家族?？搜攀暇C合癥中10－15％由基因突變所致，現(xiàn)已鑒定到百來(lái)個(gè)傳播的家族。庫(kù)魯病則被確定為傳染性的疾病。瘋牛病能否傳染給人？至今還沒(méi)有明確的答案。因?yàn)橐呀?jīng)證明，不同的動(dòng)物之間，朊病毒病的傳染是與朊病毒蛋白氨基酸差別程度有關(guān)的。前年瘋牛病的高發(fā)是與牛飼料添加劑中存在攜帶朊病毒的綿羊組織密切相關(guān)的。牛和羊的朊病毒蛋白有7個(gè)氨基酸的差別，而倉(cāng)鼠與小鼠有16個(gè)氨基酸的不同，致使小鼠難于被倉(cāng)鼠朊病毒感染。牛和人之間有30多個(gè)氨基酸的差別，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于倉(cāng)鼠與小鼠之間的差別，似乎瘋牛病不可能傳染給人。然而，英國(guó)已有兩位擁有“瘋牛病”牛的農(nóng)場(chǎng)主死于克雅氏綜合癥。英國(guó)4例新發(fā)現(xiàn)患者中，其中3位生活在10年前瘋牛病頻發(fā)區(qū)。因而不能排除瘋牛病傳播給人的可能性。朊病毒傳染途徑以前認(rèn)為朊病毒是引發(fā)瘋牛病的主要蛋白，后來(lái)在正常的的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了它，而近年研究又發(fā)現(xiàn)它與神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡有關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)在低等的生物，如酵母中也有存在類(lèi)似朊病毒行為的蛋白，這似乎表現(xiàn)朊病毒無(wú)處不在，包括極低等的生物中。ackson認(rèn)為人感染朊病毒病有三種可能途徑一是遺傳突變，使朊病毒蛋白失去細(xì)胞型而易于折疊成致病型；二是醫(yī)源性感染，如角膜轉(zhuǎn)移手術(shù)中的捐獻(xiàn)者為朊病毒的感染者三是飲食感染，如食用朊病毒病患者的腦組織。而Alter不認(rèn)為遺傳突變是感染朊病毒的病因，他提出自然得病學(xué)說(shuō)，認(rèn)為PrPSc可能是PrPC翻譯后轉(zhuǎn)變而成的。

感染朊病毒病有三種途徑一是遺傳突變，使朊病毒蛋白失去細(xì)胞型而易于折疊成致病型；二是醫(yī)源性感染，如角膜轉(zhuǎn)移手術(shù)中的捐獻(xiàn)者為朊病毒的感染者三是飲食感染，如食用朊病毒病患者的腦組織。而Alter不認(rèn)為遺傳突變是感染朊病毒的病因，他提出自然得病學(xué)說(shuō)，認(rèn)為PrPSc可能是PrPC翻譯后轉(zhuǎn)變而成的。朊病毒的機(jī)理大多學(xué)者認(rèn)為有一編碼朊病毒氨基酸序列的基因組，此DNA不存在于朊病毒中，而是正常哺乳動(dòng)物基因組的一部分。朊病毒的感染可活化或改變這一基因，使之轉(zhuǎn)譯出蛋白質(zhì)。有人認(rèn)為朊病毒中存在某種小的核酸片段，可能是基因活化的扳機(jī)。此片段插入到寄主細(xì)胞染色體的PrP基因前面，可作為基因表達(dá)的啟動(dòng)子或強(qiáng)化子。如果朊病毒本身只含有蛋白質(zhì)，PrP本身可能結(jié)合到DNA控制PrP基因轉(zhuǎn)錄的區(qū)域而起到同樣的作用。少數(shù)學(xué)者認(rèn)為朊病毒是通過(guò)與生物中心法則不同的信息流來(lái)增殖的。它可能先由PrP轉(zhuǎn)譯成RNA或DNA，然后再合成子代PrP。

77朊病毒蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)化