DB12-T1189-2023牛親子鑒定技術(shù)流程

ICS65.020.30

CCSB43

12

天津市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB12/T1189—2023

牛親子鑒定技術(shù)規(guī)程

Technicalspecificationforparentageidentificationincattle

2023-04-07發(fā)布2023-05-07實(shí)施

天津市市場(chǎng)監(jiān)督管理委員會(huì)??發(fā)布

DB12/T1189—2023

牛親子鑒定技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了牛親子鑒定的技術(shù)方法。

本文件適用于牛（Bostaurus）親子鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法

GB/T27642牛個(gè)體及親子鑒定微衛(wèi)星DNA法

NY/T1672綿羊多胎主效基因FecB分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

等位基因數(shù)allele，A

反映群體遺傳變異大小的一個(gè)指標(biāo)，其數(shù)值越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù)，表明等位基因在

群體中分布越均勻。

3.2

期望雜合度heterogosity，He

期望雜合度主要是根據(jù)種群內(nèi)當(dāng)前優(yōu)勢(shì)等位基因的分布頻率來推算的，稀有基因的貢獻(xiàn)極其微弱。

3.3

多態(tài)信息含量polymorphicinformationcontent，PIC

DNA的多態(tài)性指標(biāo)。

nn1n

222

PIC1Pi2PiPj

i1i1ji1

Pi和Pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。

3.4

排除概率PE

在親子鑒定中一個(gè)隨機(jī)的個(gè)體被排除為親生父親的概率，是評(píng)價(jià)微衛(wèi)星標(biāo)記在親子鑒定中實(shí)用價(jià)值

大小的一個(gè)指標(biāo)。

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(1)當(dāng)沒有另一親本信息時(shí)，排除子代與假設(shè)親本是親子關(guān)系的排除概率：

nnnn

22234

p14Pi2(Pi)4Pi3Pi

(2)累計(jì)排除概率：

CPE1(1P1)(1P2)(1Pk)

3.5

微衛(wèi)星DNAmicrosatellite

又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR），一類廣泛存在于真核生物基因組中的，核心

序列為2～6bp，重復(fù)次數(shù)通常為15～30次的DNA串聯(lián)重復(fù)序列。

3.6

多重聚合酶鏈反應(yīng)multiplexPCR

又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，在同一PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段

的PCR反應(yīng)。

4鑒定原理

利用常染色體微衛(wèi)星分型技術(shù)，選取不同染色體上的微衛(wèi)星位點(diǎn)，采用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星標(biāo)

記，檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，分型得出各位點(diǎn)等位基因的大小，通過軟件統(tǒng)計(jì)分析，確定或排除

親子關(guān)系。

5試劑配制

水為符合GB/T6682的一級(jí)水；高壓滅菌條件為1.034×105Pa壓力，蒸汽滅菌20min。試劑配制如

下：

——ACD抗凝劑：檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g，定容于100mL水中，高壓

滅菌；

——10%SDS（十二烷基硫酸鈉）：100gSDS溶于90mL水中，加熱至68℃助溶，用HCl調(diào)pH

至7.2，定容至1000mL，0.2μm的濾膜過濾，高壓滅菌；

——PBS（磷酸緩沖液）：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶于800mL蒸

餾水中，用HCl調(diào)pH至7.4，加水定容至1000mL，高壓滅菌，室溫保存；

——0.5mol/LNaCl（氯化鈉）：5.844gNaCl溶于雙蒸水中，加水定容至200mL，高壓滅菌；

——蛋白酶K（20mg/mL）：200mg蛋白酶K定溶于10mL水中，以1mL分裝，-20℃冷凍保存；

——氯仿：異戊醇（24：1）：異戊醇2mL加入到500mL的氯仿試劑瓶中，混勻；

——1mol/LTris-HCl（pH=8）：將121.1gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調(diào)pH至8.0，容

至1000mL，高壓滅菌；

——0.5mol/LEDTA（pH=8）：800mL水中加入186.1gEDTA-Na2·2H2O（二水合乙二胺四乙酸

二鈉），在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至8.0，然后容至1000mL，高壓滅

菌；

——TE緩沖液：取1mol/LTris-HCl（pH=8）10mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）2mL，加水定容

至1000mL，高壓滅菌，室溫保存；

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——血樣裂解液：1mol/LTris-HCl（pH=8）1mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）20mL，10%SDS5mL，

雙蒸水74mL；

——精子DNA抽提液：稱取二硫蘇糖醇0.06g與1mL0.5mol/LTris-HCl，0.5mol/LEDTA，

0.5mol/LNaCl，2mL10%SDS混合后，補(bǔ)水至10mL；

——50×TAE緩沖液：Tris-base242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）100mL，加

水定容至1000mL。使用時(shí)稀釋50倍或100倍即1×TAE；

——2%瓊脂糖：2g瓊脂糖充分溶解于50×TAE，定容至100mL；

——瓊脂糖電泳上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)；0.25%二甲苯菁FF；40%蔗糖水溶液；

——10×Buffer：0.05%色素溴酚藍(lán)；

——MgCl2（50mmol/L）：分子量為95.211，計(jì)算配制所需固體溶質(zhì)的質(zhì)量，用托盤天平稱取固

體MgCl2加入一級(jí)水溶解；

——dNTP（10mmol/L）：dNTP溶于pH為7.0的NaOH貯存液中，最初的貯存液可稀釋到10mol/L，

分裝后存放在-20℃冰箱中；

——TaqDNA聚合酶：TaqDNA聚合酶長(zhǎng)為832個(gè)氨基酸,分子量為94Kd。該酶可以廣泛用于PCR、

RT-PCR和加尾反應(yīng)等；

——GoldView：可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料；

——6×DNALoadingBuffer：0.05%色素溴酚藍(lán)；0.05%二甲苯菁FF；

——2000bpDNAMarker：2000DNAMarker是由2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp

以及100bp共6條線狀雙鏈DNA片段組成，保存于1×DNALoadingBuffer中，可直接用于

電泳分析；

——去離子甲酰胺：產(chǎn)品規(guī)格：100mL，分子式：CH3NO，分子量：45.04；

——四甲基羅丹明（TAMRA）：溶劑：DMSO，儲(chǔ)存條件20°C干燥避光保存有效期為12個(gè)月。

6儀器設(shè)備

6.1單道可調(diào)移液器

0.25～2.5μL、1～10μL、2～20μL。

6.2基因擴(kuò)增儀

溫度范圍0～99℃，樣品規(guī)格96×0.2mL，反應(yīng)體積10～100μL。

6.3離心機(jī)

最高轉(zhuǎn)速12000r/min，最大容量24×1.5mL。

6.4恒溫振蕩器

0～200r/min，0～60℃。

6.5電子天平

萬分之一精度。

6.6旋渦混合器

轉(zhuǎn)速2800r/min，工作臺(tái)直徑110mm。

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6.7手持式均質(zhì)器

轉(zhuǎn)速范圍5000～35000rpm，處理量0.05～100ml。

6.8紫外分光光度計(jì)

波長(zhǎng)范圍200～1000nm。

6.9凝膠成像分析系統(tǒng)

有膠像素1280×1024，檢測(cè)靈敏度DNA≥0.05ng。

6.10穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀

輸出電壓0～600V，輸出電流0～100mA。

6.11水平電泳槽

外形尺寸182mm×85mm×5mm，凝膠板面積60mm×60mm。

6.12高壓滅菌鍋

使用溫度范圍45～135℃，最高使用壓力0.255Mpa。

6.13自動(dòng)雙重純水蒸餾器

功率3000W，出水量2500mL/h。

6.14微波爐

容積20L。

6.15干燥箱

溫控范圍50～300℃，箱內(nèi)尺寸350mm×350mm×450mm。

6.16冰箱

4℃，-20℃。

7檢測(cè)方法

7.1樣本采集與保存

靜脈采集血樣3～5mL，復(fù)方枸櫞酸鈉注射液（ACD）抗凝，4℃可以保存3～5d，-20℃可以保存一

個(gè)月，-80℃可以保存一年。對(duì)公牛，亦可采集2～3劑細(xì)管精液，液氮保存。

7.2DNA提取

按GB/T27642規(guī)定的方法執(zhí)行。

7.3DNA濃度和純度檢測(cè)

按NY/T1672的規(guī)定執(zhí)行。

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7.4引物序列

引物序列參考聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和國(guó)際動(dòng)物遺傳學(xué)會(huì)（ISAG）的推薦引物。9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分

為4個(gè)擴(kuò)増組合，具體按照附錄A。

7.5PCR擴(kuò)増

7.5.1多重PCR擴(kuò)増?bào)w系

產(chǎn)物擴(kuò)增分4次PCR反應(yīng)完成。同一擴(kuò)増組合的引物加入同一PCR反應(yīng)管中，25μL反應(yīng)體系：

10×Buffer2.5μL、50mmol/LMgCl21.2μL、10mmol/LdNTP0.6μL、TaqDNA聚合酶2μL、10μmol/L

引物（擴(kuò)増組合）各1.0μL、待測(cè)個(gè)體模板DNA（或者陽性對(duì)照DNA）100ng、加一級(jí)水至反應(yīng)總體積為

25μL。PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照（一級(jí)水作為模板）。

7.5.2PCR擴(kuò)増條件

94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57～60.5℃退火30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。

7.6PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

7.6.1先用水清洗制膠板，再用1×TAE沖洗一次，水平放置。

7.6.2根據(jù)電泳膠板的規(guī)格和檢測(cè)樣品的數(shù)量，配制2%的瓊脂糖溶液，在微波爐中加熱融化至溶液澄

清透明，室溫下冷卻至60℃時(shí)，加入goldview并混勻，使goldview的終濃度為0.5μg/L。

7.6.3將混合液緩慢倒入制膠板中，排除氣泡，插入多齒梳子。待凝膠凝固后，拔出梳子，將凝膠轉(zhuǎn)

移至水平電泳槽中，往電泳槽中加入1×TAE緩沖液，使電泳緩沖液沒過膠面。

7.6.4將待檢PCR產(chǎn)物5μL和上樣緩沖液（6×DNALoadingBuffer）以5：1的比例混合均勻，加入

點(diǎn)樣孔；同時(shí)選擇點(diǎn)樣孔點(diǎn)上5μL2000bpDNAMarker作參照。恒壓100V，電泳30min。電泳結(jié)

束后于凝膠成像系統(tǒng)觀察，并分析記錄。

7.7微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

PCR產(chǎn)物、去離子甲酰胺和TAMRA內(nèi)標(biāo)按0.5μL：10μL：0.5μL比例混合，95℃變性15min，遺

傳分析儀測(cè)序，配套軟件分析微衛(wèi)星的基因型。FAM、HEX和TANRA分別表示藍(lán)色、綠色和黑色。

8結(jié)果判定

8.1多重PCR產(chǎn)物檢測(cè)

若多重PCR均出現(xiàn)清晰條帶，表明產(chǎn)物擴(kuò)增成功，可以進(jìn)行測(cè)序，見圖1。

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注：從左至右依次為參照、組合1、組合2、組合3及組合4（見附錄A）。

圖1多重PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖

8.2微衛(wèi)星標(biāo)記分型

利用遺傳分析儀對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行基因分型。檢測(cè)個(gè)體的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的基因分型結(jié)果，根據(jù)相

對(duì)熒光強(qiáng)度和片段大小，可獲得待測(cè)個(gè)體不同STR標(biāo)記的基因型。不同親緣關(guān)系的個(gè)體，其微衛(wèi)星標(biāo)記

的等位基因大小不同，表現(xiàn)出不同的基因型，陽性對(duì)照樣品9個(gè)STR標(biāo)記不同等位基因的大小按附錄B所

示。

8.3親子關(guān)系判定

根據(jù)待檢個(gè)體STR標(biāo)記的基因型，計(jì)算其等位基因數(shù)（A）、期望雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）

等指標(biāo)分析微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性，計(jì)算累積非父排除概率（CPE）分析標(biāo)記的親子鑒定效力（按照附錄C）。

根據(jù)孟德爾遺傳定律以及STR位點(diǎn)分型來判斷親子關(guān)系，如果兩者之間孟德爾錯(cuò)誤的位點(diǎn)數(shù)是0，則判斷

為親子關(guān)系。

9廢棄物處理

按照NY/T1672的規(guī)定執(zhí)行。

10交叉污染防止措施

按照SN/T1193的規(guī)定執(zhí)行。

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

微衛(wèi)星基因座及其引物序列

微衛(wèi)星基因座及其引物序列見表A.1。

表A.1微衛(wèi)星基因座及其引物序列

擴(kuò)增組合基因座引物序列（5'-3'）退火溫度（℃）片段范圍（bp）熒光標(biāo)記

TGLA53GCTTTCAGAAATAGTTTGCATTCA55150-189TANRA

ATCTTCACATGATATTACAGCAGA

1

INRA23GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC55190-220HEX

TAACTACAGGGTGTTAGATGAACTC

BM1824GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC53.8170-210HEX

CATTCTCCAACTGCTTCCTTG

2

TGLA122CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC53.8137-190TANRA

AATCACATGGCAAATAAGTACATAC

SPS115AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG63235-270HEX

AACGAGTGTCCTAGTTTGGATGTG

3

BM2113GCTGCCTTCTACCAAATACCC63118-143FAM

CTTCCTGAGAGAAGCAACACC

TGLA126CTAATTTAGAATGAGAGAGGCTTCT58112-130FAM

TGGTCCTCTATTCTCTGAATATTCC

ETH10GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA58205-225HEX

4

CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC

ETH225GATCACCTTGCCACTATTTCCT58133-165TANRA

ACATGACAGCCAGCTGCTACT

7

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

9個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳信息

9個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳信息見表B.1。

表B.19個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳信息

標(biāo)記名稱片段長(zhǎng)度范圍（bp）等位基因數(shù)期望雜合度（He）多態(tài)信息含量（PIC）

BM211315070.8420.759

SPS115250-30090.9250.853

TGLA53150-20050.8080.717

INRA23200-25040.6750.570

BM182420050.7750.682

TGLA122150-20060.8500.768

ETH225150-20060.8330.748

ETH10200-25030.5080.427

TGLA126