發(fā)酵工程課件設(shè)計(jì)1

發(fā)酵工程課程設(shè)計(jì)10生物技術(shù)第二組主講人:邢利明小組成員候云彩2李彬2張媛媛2殷雅楠2任二碩2邵沖2許乃安2邢利明2魏永杰2課題大腸桿菌的高密度發(fā)酵要求50L發(fā)酵罐大綱大腸桿菌介紹發(fā)酵介紹高密度發(fā)酵介紹實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及條件的確定發(fā)酵流程與控制發(fā)酵注意事項(xiàng)大腸桿菌介紹腸埃希氏菌(E.)通常稱為大腸桿菌，是在1885年發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌是細(xì)菌，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，只含有核糖體簡單的細(xì)胞器，沒有細(xì)胞核有擬核；細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)粒常用作基因工程中的運(yùn)載體大腸桿菌的代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型。大腸桿菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用：大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡單，培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛，最成功的表達(dá)體系，常做高效表達(dá)的首選體系在培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)無需添加生長因子，向培養(yǎng)基中加入伊紅美藍(lán)遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否存在在這里必須指出的是，處于生物安全考慮，生物工程用的菌株是在不斷篩選后被挑選出的菌株。這些菌株由于失去的細(xì)胞壁的重要組分，所以在自然條件下已無法生長。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。這樣，即便由于操作不慎導(dǎo)致活菌從實(shí)驗(yàn)室流出，也不易導(dǎo)致生化危機(jī)。發(fā)酵介紹有機(jī)物被生物體氧化降解成氧化產(chǎn)物并釋放能量的過程統(tǒng)稱為生物氧化.微生物生理學(xué)把生物氧化區(qū)分為呼吸和發(fā)酵，呼吸又可進(jìn)一步區(qū)分為有氧呼吸和無氧呼吸。因此，發(fā)酵是生物氧化的一種方式。工業(yè)生產(chǎn)上籠統(tǒng)地把一切依靠微生物的生命活動(dòng)而實(shí)現(xiàn)的工業(yè)生產(chǎn)均稱為“發(fā)酵”借用理工大學(xué)的發(fā)酵工程課件來對(duì)發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行直觀的認(rèn)識(shí)發(fā)酵罐發(fā)酵的特點(diǎn)發(fā)酵過程一般來說都是在常溫常壓下進(jìn)行的生物化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)安全，要求條件也比較簡單。發(fā)酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他農(nóng)副產(chǎn)品為主，只要加入少量的有機(jī)和無機(jī)氮源就可進(jìn)行反應(yīng)。發(fā)酵過程是通過生物體的自動(dòng)調(diào)節(jié)方式來完成的，反應(yīng)的專一性強(qiáng)，因而可以得到較為單—的代謝產(chǎn)物三種發(fā)酵操作方式介紹分批發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵分批補(bǔ)料發(fā)酵分批發(fā)酵分批發(fā)酵又稱為分批培養(yǎng)，是指在一個(gè)密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)，使微生物生長繁殖，在特定的條件下只完成一個(gè)生長周期的微生物培養(yǎng)方法。連續(xù)發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定的發(fā)酵過程。連續(xù)發(fā)酵可分為單罐連續(xù)發(fā)酵和多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵等方式。分批補(bǔ)料發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定的發(fā)酵過程。連續(xù)發(fā)酵可分為單罐連續(xù)發(fā)酵和多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵等方式。高密度發(fā)酵介紹高細(xì)胞密度發(fā)酵(，)是指在一定條件和培養(yǎng)體系下，獲得最多的細(xì)胞量，由此更多地或更高效地獲得目的產(chǎn)物。即利用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率(單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)。通常認(rèn)為菌體密度超過50g()即為高密度發(fā)酵。根據(jù)計(jì)算，理論上大腸桿菌發(fā)達(dá)到酵所能的最高菌體密度為400g()，考慮到實(shí)際情況中的種種條件限制，等認(rèn)為最高的菌體密度為200g()，此時(shí)發(fā)酵液的25%充滿了長3μm，寬1μm的大腸桿菌，發(fā)酵液粘度很高，幾乎喪失流動(dòng)性。影響大腸桿菌高密度發(fā)酵的因素培養(yǎng)基溶氧濃度溫度代謝副產(chǎn)物培養(yǎng)基高密度發(fā)酵對(duì)基質(zhì)中營養(yǎng)源的種類和含量比要求較高，如碳源和氮源的比例偏小，會(huì)導(dǎo)致菌體生長旺盛，造成菌體提前衰老自溶；比例偏大，則菌體繁殖數(shù)量少，細(xì)胞代謝不平衡，不利于產(chǎn)物積累。葡萄糖是高密度發(fā)酵中常用的碳源，但濃度過高，會(huì)產(chǎn)生乙酸，因此要保證較低的葡萄糖濃度。氮源、微量元素和無機(jī)鹽對(duì)細(xì)菌的生長繁殖和外源蛋白的表達(dá)也有很大影響。溶氧濃度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌體密度迅速增加，溶氧濃度隨之下降，細(xì)胞的生長減慢。特別是高密度發(fā)酵的后期，由于菌體密度的擴(kuò)增，耗氧量極大，發(fā)酵罐各項(xiàng)物理參數(shù)均不能滿足對(duì)氧的供給，導(dǎo)致菌體生長極為緩慢，外源蛋白的表達(dá)量也較差。在發(fā)酵過程中保證適宜的溶氧濃度，必須確定發(fā)酵罐的通氣量和攪拌速度。大腸桿菌利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，特別是大量的乙酸和二氧化碳，使降低，必須調(diào)節(jié)在適宜的范圍。溫度培養(yǎng)溫度在適宜的范圍，對(duì)于溫控誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌來說，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間對(duì)于重組蛋白的產(chǎn)量由很大影響。代謝副產(chǎn)物乙酸二氧化碳葡萄糖的濃度超過某一閾值，會(huì)產(chǎn)生乙酸，或者比生長速率過高，供氧不足，也會(huì)產(chǎn)生乙酸。為降低培養(yǎng)基中代謝副產(chǎn)物的積累，可采用流加補(bǔ)料的措施，或保持適當(dāng)?shù)谋壬L速率，或在培養(yǎng)基中添加某些氨基酸。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及條件的確定首先了解幾種測(cè)定方法還原糖的測(cè)定方法氨基酸的測(cè)定方法大腸桿菌生長曲線測(cè)定查閱相關(guān)資料確定最佳培養(yǎng)基組成為

實(shí)驗(yàn)室提供的發(fā)酵罐容積為50L,可根據(jù)上圖中各成分的配比,確定最后所需要的量確定了最佳培養(yǎng)條件為：溫度37℃、培養(yǎng)基裝液量35250、培養(yǎng)基初始7．1、種子培養(yǎng)時(shí)間8h、接種量1％。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件發(fā)酵18h，菌體密度A600達(dá)到12.8，茵體干重為4.7g()／L，酶活力達(dá)到210U／發(fā)酵液，分別為初始條件下的3.1和14.9倍。采用分批補(bǔ)料的方法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵發(fā)酵流程與控制大腸桿菌的凍存復(fù)蘇培養(yǎng)液氮保藏20°C保藏保藏培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基一級(jí)平板二級(jí)平板液體培養(yǎng)基一級(jí)搖瓶二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基底物培養(yǎng)基補(bǔ)料培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基菌種復(fù)壯菌種保藏菌種培養(yǎng)發(fā)酵流程的基本框架發(fā)酵初始維持電機(jī)轉(zhuǎn)速300以便對(duì)菌體維持較小的剪切力，通氣量維持在12左右。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)液中葡萄糖耗盡,溶氧和pH驟增,采用流加方式連續(xù)流加葡萄糖和氮源維持菌體生長。同時(shí)用25%氨水自動(dòng)調(diào)節(jié)pH維持在6.8。分批培養(yǎng)()階段補(bǔ)料分批培養(yǎng)()階段發(fā)酵分為三個(gè)階段:而后溶氧逐漸下降，分步提高轉(zhuǎn)速,控制溶氧在30%以上。隨著菌體的大量繁殖，溶氧濃度迅速下降，當(dāng)溶氧低于20%時(shí)，手動(dòng)調(diào)節(jié)空氣流量直至最大，18反饋控制補(bǔ)料基于溶解氧恒定的反饋控制策略：當(dāng)發(fā)酵液中底物幾乎耗盡時(shí)，氧消耗速率會(huì)下降，溶解氧會(huì)突然升高，因此，溶解氧的突然變化可以成為底物補(bǔ)料開始的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)采取溶氧反饋調(diào)節(jié)措施，具體操作如下：發(fā)酵初始維持電機(jī)轉(zhuǎn)速300以便對(duì)菌體維持較小的剪切力，通氣量維持在12左右。由于本實(shí)驗(yàn)缺少調(diào)節(jié)空氣流量的電子閥裝置，對(duì)空氣流量只能采取手動(dòng)設(shè)置，隨著菌體的大量繁殖，溶氧濃度迅速下降，當(dāng)溶氧低于20%時(shí)，手動(dòng)調(diào)節(jié)空氣流量直至最大，18。而后采取提高攪拌轉(zhuǎn)速方法，提高溶氧，具體操作為當(dāng)溶氧低于20%時(shí)，發(fā)酵控制器輸出信號(hào)，驅(qū)動(dòng)電機(jī)每次提高轉(zhuǎn)速20轉(zhuǎn)，直至轉(zhuǎn)速達(dá)到最高轉(zhuǎn)速，1500。最優(yōu)解響應(yīng)面分析在眾多實(shí)驗(yàn)因素中找出主要因素應(yīng)用正交試驗(yàn)（因素比較少）和（）實(shí)驗(yàn)。尤其是實(shí)驗(yàn)，它可以在很多的因素中，用較少的實(shí)驗(yàn)篩選出主要因素（一般選取大于90%）。通過實(shí)驗(yàn)還可以看出各因素的作用效果，即是增加還是減少濃度會(huì)使響應(yīng)值向最優(yōu)移動(dòng)。主要因素的取值逼近中心點(diǎn)，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)這步實(shí)驗(yàn)不是必須做的，如果你確定你的實(shí)驗(yàn)取值已經(jīng)逼近中心點(diǎn)，那么你可以直接進(jìn)行第三步的分析。但是你要是不能確定或不相信這些取值那你就要進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。這步實(shí)驗(yàn)根據(jù)第一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。為了盡快逼近最優(yōu)值，增加步長通常取最大響應(yīng)面分析常用的有中心復(fù)合法和法（）。在這步實(shí)驗(yàn)時(shí)最好因素不要太多，因素太多直接影響到試驗(yàn)次數(shù)，現(xiàn)在經(jīng)典的一般是三因素。通過這步分析可以的回歸方程，進(jìn)而得到最優(yōu)培養(yǎng)基。并且還能得到因素相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。發(fā)酵注意事項(xiàng)1.發(fā)酵染菌發(fā)酵染菌的問題實(shí)在是個(gè)令人頭疼的問題，在這僅僅介紹一點(diǎn)簡單的方滕來判斷染菌：通過理化參數(shù)進(jìn)行判斷，一般僅用于無菌培養(yǎng)檢查。如、通過聞發(fā)酵液的氣味，每個(gè)菌種都有自身的氣味，當(dāng)有臭味或者酸臭味時(shí)幬可基本判定。.無菌培養(yǎng)時(shí)也可通過滿溫的突然消漲，罐壓的突然升高等現(xiàn)象來判斷。④.通過鏡檢來觀察。⑤.通過劃平板。2.甘油保存菌種常用最終濃度1030%的甘油.由于純甘油十分粘稠很難定量.使用時(shí)按50%甘油:菌液=1:1混合均勻，然后迅速凍結(jié)。如果是大腸桿菌保種，甘油終濃度為15%.

3.無菌操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%酒精擦拭無菌操作臺(tái)面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，實(shí)驗(yàn)操作者要用70%的酒精擦拭雙手后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)完畢后，凡實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70%酒精擦拭無菌操作臺(tái)面。無菌操