6.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

免疫標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）抗體抗體（Antibody，Ab）是B細(xì)胞產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能?？贵w具有兩個(gè)特點(diǎn)：高度的特異性和龐大的多樣性。背景知識(shí)抗體的基本結(jié)構(gòu)抗體天然Ig分子含有四條異源性多肽鏈，其中，分子量較大的兩條鏈稱為重鏈(heavychain,H)，而分子量較小的兩條鏈稱為輕鏈(Lightchain,L)。同一Ig分子中的兩條H鏈和兩條L鏈的氨基酸組成完全相同?？贵w的制備流程一個(gè)抗原上可以有好幾個(gè)不同的抗原決定簇，因而使機(jī)體產(chǎn)生好幾種不同的抗體，最終產(chǎn)生出抗體是漿細(xì)胞。只針對一個(gè)抗原決定簇起作用的B細(xì)胞群或漿細(xì)胞群就是一個(gè)純系，純系的英文為Clone，音譯就是克隆。由一種B細(xì)胞群或漿細(xì)胞克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就象導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一種抗原刺激機(jī)體，也存在多種抗原決定簇，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體?？贵w的克隆性抗原抗原（Antigen）：抗原就是能引起免疫反應(yīng)的物質(zhì)，它主要是大分子的蛋白質(zhì)以及病原體，也可以是其它小分子，如多肽、糖、脂肪分子等?？乖碳C(jī)體的免疫系統(tǒng)，引起免疫反應(yīng)?？乖乖哂袃煞N性能：?免疫原性(immunogenicity):指抗原分子具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。?反應(yīng)原性(reactogenicity):指抗原分子與抗體或效應(yīng)T細(xì)胞等免疫應(yīng)答產(chǎn)物發(fā)生特異性反應(yīng)的特性?？乖瓫Q定簇抗原決定簇（Antigenicdeterminant）：又稱為表位（epitope），指抗原表面決定該抗原特異性的一個(gè)特定的分子結(jié)構(gòu)，它可以是氨基酸基團(tuán)或者單糖殘基，只能被一個(gè)單獨(dú)的抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合?？乖瓫Q定簇抗原決定簇決定著抗原的特異性，即決定著抗原與抗體發(fā)生特異結(jié)合的能力。抗原決定簇多位于蛋白質(zhì)的表面，一個(gè)蛋白質(zhì)大分子常有許多抗原決定簇?？乖瓫Q定簇依賴于氨基酸序列和空間構(gòu)象兩種因素，又分為線性決定簇(Lineardeterminants)、構(gòu)象決定簇(conformationaldeterminants)和新生抗原決定簇(Neoantigenicdeterminant)。免疫標(biāo)記技術(shù)原理：利用抗原抗體反應(yīng)的原理，于抗原或抗體上加載各種標(biāo)志物，抗原抗體反應(yīng)中加入標(biāo)志物示蹤，利用標(biāo)志物的可測量性來達(dá)到快速、敏感地檢測各種體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)。特點(diǎn)：特異性、轉(zhuǎn)移性、高效性。發(fā)展1941年Coons建立熒光抗體技術(shù)1959年Yalow和Berson創(chuàng)建放射免疫分析1971年Engvall和Perlaman以及Weeman和Schuur用酶代替放射性核素制備了酶標(biāo)記物，創(chuàng)立了酶免疫分析技術(shù)。

ELISA的基礎(chǔ)一13ELISA影響因素三實(shí)驗(yàn)常見問題四

ELISA分類二酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）1.1ELISA的概念指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。ELISA已成為分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。14一、ELISA基礎(chǔ)知識(shí)酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlman，荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。也是目前應(yīng)用最廣泛的傳染病檢測方法。1.2ELISA原理以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）酶標(biāo)記的抗體或抗原（標(biāo)記物）酶作用的底物（顯色劑）1.2ELISA原理固相載體：許多物質(zhì)可以作為固相載體，如纖維素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和聚苯乙烯等等。目前最為常用的是聚苯乙烯材質(zhì)的微孔板，多為8×12道96孔板條。吸附能力、通透性、均一性固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）酶標(biāo)記物：酶與抗體的共價(jià)結(jié)合首先不影響酶及抗體的活性、不產(chǎn)生干擾物質(zhì)、不產(chǎn)生非特異反應(yīng)。辣根過氧物酶（HRP）是目前應(yīng)用最為廣泛的酶，是從辣根菜的根中提取。堿性磷酸酶（AP）是從小牛粘膜中提取?；钚愿?，工藝復(fù)雜，價(jià)格昂貴。酶標(biāo)記的抗體或抗原（標(biāo)記物）底物：不同種類的酶要求使用不同的底物。HRP:鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等等，顯色后，前者變?yōu)槌燃t色，后者變?yōu)樗{(lán)色。甲酸停止顯色后，變?yōu)辄S色。AP:對硝基苯磷酸酯（p-NPP）。顯色后，為黃色。底物常用酶與底物酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色360,450

4201.3ELISA特點(diǎn)靈敏性高該測定法的靈敏度來自作為報(bào)告基團(tuán)的酶。眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)

，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進(jìn)行定量。特異性強(qiáng)其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。1.3ELISA特點(diǎn)準(zhǔn)確性高、檢測時(shí)間短、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批標(biāo)本的檢測，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、醫(yī)療檢測以及免疫實(shí)驗(yàn)分析等領(lǐng)域。試劑比較穩(wěn)定，易于保存操作簡單，價(jià)格便宜，易于在基層大規(guī)模使用易于標(biāo)準(zhǔn)化和對檢測對象進(jìn)行定量可以自動(dòng)化1.3ELISA特點(diǎn)ELISA-酶標(biāo)儀ELISA-酶標(biāo)儀ELISA-試劑盒ELISA-試劑盒ELISA-試劑盒夾心法（測抗原、抗體）間接法（測抗體）競爭法（測抗原）ABS-ELISA法（測抗原、抗體）二、ELISA分類2.1夾心法雙抗體夾心法測抗原雙抗原夾心法測抗體2.1.1雙抗體夾心法測抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。

用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。2.1.2雙抗原夾心法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。2.1.3間接法

當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的抗體結(jié)合位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。2.1.4競爭法2.1.4競爭法小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。優(yōu)點(diǎn)是快，缺點(diǎn)是需要較多量的酶標(biāo)記抗原。常用于病毒性疾病的早期感染洗滌洗滌2.1.5捕獲法2.1.6ABS-ELISA法親和素生物素系統(tǒng)(AvidinBiotinSystem，ABS)。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，它們之間的作用力是目前已知最強(qiáng)的非共價(jià)作用。2.1.6ABS-ELISA法生物素易與蛋白質(zhì)（如抗體等）以共價(jià)鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級(jí)放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)的催化作用而呈色，達(dá)到檢測未知抗原（或抗體）分子的目的。固相載體：ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板抗原：可溶性、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗(yàn)樣品三、ELISA影響因素4.結(jié)合物：酶結(jié)合物要求穩(wěn)定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產(chǎn)量高及成本低5.底物：各種酶都有對底物的特異性，不同種類的酶要求有不同的底物6.作用時(shí)間：加底物后終止時(shí)間？三、ELISA影響因素7.結(jié)果判定：ELISA的試驗(yàn)結(jié)果可用肉眼觀察顏色反應(yīng)的深淺作出判斷，也可用分光光度計(jì)作精確測定8.試驗(yàn)的重復(fù)性（精確度）：通常用變異系數(shù)來表示三、ELISA影響因素4.1顯色淺，靈敏度低序號(hào)原因解決方法1試劑盒運(yùn)輸時(shí)間過長，受高溫天氣影響，酶活性降低試劑運(yùn)輸過程放足夠冰袋并盡可能縮短運(yùn)輸時(shí)間2試劑盒(包括未用完的板條及其他組分）保藏條件不正確試劑盒內(nèi)所有組分都應(yīng)當(dāng)在4℃冷藏，未使用完的板條用密封保存3試劑盒使用時(shí)已超出有效期過期試劑盒不可以使用4溫浴時(shí)間不夠嚴(yán)格按說明書操作5恒溫箱溫度達(dá)不到37℃注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃；盡量避免頻繁開關(guān)恒溫箱門；經(jīng)常注意水箱中合適的水位；在保證水不沒過酶標(biāo)板的前提下，使水位盡量高，以保證反應(yīng)溫度6加樣量不足經(jīng)常校正移液器，注意吸頭要與移液器吻合。移液不宜過快，排放要完全7顯色劑加量不足，或加入順序顛倒按照說明書要求操作8樣品用NaN3防腐，影響了酶的活性不可以使用NaN3防腐9試劑、樣品使用前未平衡室溫試劑、樣品從低溫保藏條件中拿出來后，要先平衡至室溫方可使用10試劑開啟時(shí)間過長，污染試劑開啟后應(yīng)該在盡可能短時(shí)間內(nèi)用完11不同批號(hào)試劑中混用不同批號(hào)試劑不能混用四、常見問題4.2假陽性多，本底高甚至花板序號(hào)原因解決方法1試劑過期過期試劑不能使用2加樣時(shí)污染注意更換吸頭，盡可能避免污染3加酶時(shí)污染對先加樣后加酶的操作，加酶時(shí)要注意吸頭不要接觸標(biāo)本，造成污染。當(dāng)可能造成污染時(shí)，一定要更換吸頭，切忌僥幸心理4恒溫箱溫度過高注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其溫度在37±0.5℃5整個(gè)操作時(shí)間過長、造成反應(yīng)時(shí)間不同。氣溫高時(shí)更明顯在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成操作。盡量不要堆積多塊板操作6洗液稀釋倍數(shù)過高按要求倍數(shù)稀釋洗液7洗板次數(shù)不夠按試劑要求，不可任意減少洗板次數(shù)8洗板時(shí)浸泡時(shí)間不夠按要求操作，并適當(dāng)延長浸泡時(shí)間9手工洗板方式不正確洗板時(shí)，垂直加入洗液，保證一定的沖擊力；洗液要注滿板孔，并保證30-60秒的浸泡時(shí)間10洗板機(jī)調(diào)試不正確或有故障（可通過手工洗板判定）手工洗板，并聯(lián)系儀器廠家維修11酶被污染防止組分的污染。如使用容器，注意容器的清潔12顯色液B液被污染13顯色完后沒有終止反應(yīng)顯色完立即終止反應(yīng)4.3重復(fù)性不好序號(hào)原因解決方案1加樣量