分析儀器-熒光光譜儀課件

光分析儀器分析儀器-熒光光譜儀主要內(nèi)容1.1紫外－可見分光光度計(jì)（自學(xué)）1.2熒光光譜儀（8學(xué)時(shí)）1.3紅外光譜儀（自學(xué)）1.4激光拉曼光譜儀（2學(xué)時(shí)）

分析儀器-熒光光譜儀熒光光譜儀Spectrophotofluorimetry分析儀器-熒光光譜儀一、熒光的發(fā)現(xiàn)二、熒光與熒光光譜三、熒光光譜儀及主要譜參量四、熒光生色團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)五、影響熒光測(cè)量的因素六、熒光技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用主要內(nèi)容分析儀器-熒光光譜儀一熒光的發(fā)現(xiàn)16世紀(jì)：在礦物和植物提取液中發(fā)現(xiàn)熒光；

1575年：紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家Monardes——植物愈創(chuàng)木切片黃色水溶液——天蘭色熒光；

1852年：Stokes闡明熒光發(fā)射機(jī)制(分光計(jì)觀測(cè)奎寧和葉綠素的熒光，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)稍長(zhǎng)于入

射光的波長(zhǎng)——認(rèn)識(shí)到熒光為“重新發(fā)光”而不是漫射光；

1905年：Wood發(fā)現(xiàn)氣體分子的共振熒光；

1926年：Gaviola直接測(cè)定了熒光壽命；

1923年：熒光X射線光譜；

1964年：原子熒光光譜分析的建立；

1965年：熒光分析在生物分析中廣泛應(yīng)用。

分析儀器-熒光光譜儀（一）熒光的產(chǎn)生（二）熒光光譜與吸收光譜二熒光與熒光光譜分析儀器-熒光光譜儀（一）熒光的產(chǎn)生1分子的能量狀態(tài)在光學(xué)分析中涉及的分子能量有：

Eo=Ee+Ev+ErEe：價(jià)電子運(yùn)動(dòng)能,electronEv：原子在平衡位置附近的振動(dòng),vibrationEr：分子繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)能,rotation

其中，

Ee>

Ev>

Er分析儀器-熒光光譜儀基態(tài)：電子自旋配對(duì)，多重度=2s+1=1，為單重態(tài)，以S0表示。激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對(duì)，為單重態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2…表示激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對(duì)，為三重態(tài)，稱為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2….表示。三重態(tài)能級(jí)低于單重態(tài)（Hund規(guī)則）分析儀器-熒光光譜儀2.去活化過程（Deactivation）

處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態(tài)。這些過程包括：1）振動(dòng)弛豫（VibrationalRelaxation,VR）在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動(dòng)能層失活至低振動(dòng)能層的過程，稱為振動(dòng)弛豫。2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（InternalConversion，IC）對(duì)于具有相同多重度的分子，若較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過振動(dòng)耦合產(chǎn)生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。分析儀器-熒光光譜儀3）外轉(zhuǎn)換（ExternalConversion，EC）受激分子與溶劑或其它分子相互作用發(fā)生能量轉(zhuǎn)換而使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失的過程，也稱“熄滅”或“猝滅”。4）系間跨躍（IntersystemConversion，ISC）系間跨躍是發(fā)生在兩個(gè)不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當(dāng)不同多重態(tài)的兩個(gè)電子能層有較大重疊時(shí)，處于這兩個(gè)能層上的受激電子的自旋方向發(fā)生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無輻射躍遷，該過程稱為系間跨躍。分析儀器-熒光光譜儀

5）熒光發(fā)射分子電子從單重激發(fā)態(tài)（Kasha規(guī)則）的最低振動(dòng)能級(jí)在很短時(shí)間（10-9-10-6s）躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能層時(shí)所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。由于各種去活化過程的存在，熒光輻射能通常要比激發(fā)能量低，或者說，熒光波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)（Stokes效應(yīng)）。6）磷光發(fā)射從單重態(tài)到三重態(tài)分子間發(fā)生系間跨躍躍遷后，再經(jīng)振動(dòng)弛豫回到三重態(tài)最低振動(dòng)能層，最后，在10-4-10s內(nèi)躍遷到基態(tài)的各振動(dòng)能層所產(chǎn)生的輻射。分析儀器-熒光光譜儀（二）熒光光譜與吸收光譜分析儀器-熒光光譜儀熒光分光光度術(shù)：

又稱熒光光譜術(shù)，屬于光譜技術(shù)中的一種發(fā)射光譜術(shù)。其原理是電磁波和物質(zhì)作用后，物質(zhì)首先吸收電磁波的能量，然后再重新發(fā)射電磁波。激發(fā)波段在100-800nm之間，相當(dāng)于紫外與可見光波段。分析儀器-熒光光譜儀（一）熒光光譜儀（二）熒光分光光度術(shù)中的參量三熒光光譜儀與主要參量分析儀器-熒光光譜儀（一）熒光光譜儀吸收光譜儀光路圖熒光光譜儀光路圖分析儀器-熒光光譜儀氫燈的能量分布氘燈的能量分布氙燈（紅線）和帶有玻璃外套的汞燈的能量分布1激發(fā)光源在紫外-可見光區(qū)，可供熒光激發(fā)用的光源很多包括：鎢燈，碘鎢燈，氫燈，氘燈，汞燈，氙燈等。主要根據(jù)光源穩(wěn)定性和強(qiáng)度選擇光源。分析儀器-熒光光譜儀實(shí)踐中常不選用強(qiáng)光源：隨著光強(qiáng)的增加，會(huì)同時(shí)導(dǎo)致散射光和熱量的增多強(qiáng)光源照射，容易使樣品產(chǎn)生光化分解強(qiáng)光源需要的穩(wěn)壓穩(wěn)流裝置復(fù)雜而昂貴產(chǎn)生大量臭氧，損害健康分析儀器-熒光光譜儀對(duì)于光源要注意以下幾點(diǎn):（1）正負(fù)極不要接錯(cuò)。（2）拿燈時(shí)，不要碰窗口，以免手上的油污經(jīng)紫外照射后，難以清除。應(yīng)及時(shí)用無水乙醇擦干凈。（3）燈有壽命，要節(jié)約使用。（4）啟動(dòng)間隔一般要大于半小時(shí)，待燈冷卻后，在重新啟動(dòng)。啟動(dòng)后要預(yù)熱半小時(shí)。（5）不要用眼睛直視燈。分析儀器-熒光光譜儀2樣品池在可見可用玻璃池，但紫外區(qū)一定要用石英池。（1）設(shè)置空白對(duì)照。

（2）清洗問題，關(guān)鍵是即時(shí)沖洗。自來水沖洗SDS浸泡雙蒸水沖洗濃硝酸處理雙蒸水沖洗分析儀器-熒光光譜儀（二）熒光分光光度術(shù)中的參量ex—Maximumexcitationwavelength

em,max—Maximumemissionwavelength分析儀器-熒光光譜儀激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系i）波長(zhǎng)比較與激發(fā)（或吸收）波長(zhǎng)相比，熒光發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)，即產(chǎn)生所謂Stokes位移。（振動(dòng)弛豫失活所致）ii）形狀比較熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)。盡管分子受激后可到達(dá)不同能層的激發(fā)態(tài)，但由于去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫）到第一電子激發(fā)態(tài)的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達(dá)第一激發(fā)態(tài)一樣。換句話說，不管激發(fā)波長(zhǎng)如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層。分析儀器-熒光光譜儀iii）鏡像對(duì)稱通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。分析儀器-熒光光譜儀解釋1：能層結(jié)構(gòu)相似性熒光為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層而形成，即其形狀與基態(tài)振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。吸收光譜是由基態(tài)最低振動(dòng)能層躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層而形成，即其形狀與第一電子激發(fā)單重態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動(dòng)能層分布具有相似性，因而呈鏡像對(duì)稱。S1S0分析儀器-熒光光譜儀解釋2：位能曲線（Frank-Condon原理）

由于電子吸收躍遷速率極快（10-15s），此時(shí)核的相對(duì)位置可視為不變（核較重）。當(dāng)兩個(gè)能層間吸收躍遷的幾率越大，其相反躍遷的幾率也越大，即產(chǎn)生的光譜呈鏡像對(duì)稱。分析儀器-熒光光譜儀A熒光強(qiáng)度的定義：在一定激發(fā)波長(zhǎng)(λex)作用下，發(fā)射的熒光強(qiáng)弱。

F=Ia

Ia=I0-I，I=I010-εcL

F=

I0(1-10-εcL){當(dāng)C很低時(shí)F=

I0εcL，

{當(dāng)C較大時(shí)F=I0

B

=發(fā)射光子數(shù)/吸收光子數(shù)

2熒光強(qiáng)度（fluorescenceintensity,F,I）與量子產(chǎn)率（quantumyield,

）（二）熒光分光光度術(shù)中的參量分析儀器-熒光光譜儀熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系分析儀器-熒光光譜儀熒光偏振(fluorescencepolarization)（二）熒光分光光度術(shù)中的參量自然光部分偏振光偏振光分析儀器-熒光光譜儀I//-I

I//+I

P=I//-I

I//+2I

A=熒光偏振度Fluorescencepolarization--p

熒光各向異性Fluorescenceanisotropy--A分析儀器-熒光光譜儀(1)熒光偏振度的物理意義：A：I//=I

，P=0，自然光，熒光分子運(yùn)動(dòng)很快，取向隨機(jī)。（稀溶液）B：I//或I

為0，P=±1偏振光，熒光分子運(yùn)動(dòng)很慢，取向有序。C：I//

I

0，0<P<1，生物大分子的熒光屬于這種情況。分析儀器-熒光光譜儀(2)環(huán)境因素及分子運(yùn)動(dòng)對(duì)熒光偏振度的影響

A.溫度的影響：溶液粘度

A：溫度的影響溫度升高，P降低

B：溶液粘度粘度升高，P升高C：分子的運(yùn)動(dòng)—轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)弛豫時(shí)間rotationalrelaxationtime—

分析儀器-熒光光譜儀（二）熒光分光光度術(shù)中的參量4熒光壽命（Fluorescenceliftime--

）熒光衰減為原來激發(fā)時(shí)最大熒光強(qiáng)度的1/e所需要的時(shí)間I=I0e-kt,=1/k

分子所處的環(huán)境有無淬滅有無能量轉(zhuǎn)移有無分子間相互作用影響因素分析儀器-熒光光譜儀熒光壽命除去激發(fā)光源后熒光衰減為原來激發(fā)時(shí)最大熒光強(qiáng)度的1/e所需要的時(shí)間。熒光分子吸收能量后其基態(tài)電子被激發(fā)到單線激發(fā)態(tài)后由第一單線激發(fā)態(tài)（總自旋S=0,兩個(gè)電子自旋相反，M=2S+1=0)最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)任一振動(dòng)能級(jí)時(shí)發(fā)射的光。4.1、熒光壽命分析儀器-熒光光譜儀

基于熒光壽命測(cè)量的熒光猝滅技術(shù)研究猝滅劑與熒光標(biāo)記物靠近的難易，研究標(biāo)記物所處的微環(huán)境。時(shí)間分辨熒光光譜用來研究激發(fā)態(tài)分子間相互作用，非輻射能量轉(zhuǎn)移及時(shí)間分辨熒光各向異性主要熒光技術(shù)都離不開熒光壽命的測(cè)定。分析儀器-熒光光譜儀1821，首次記錄了熒光現(xiàn)象。1852，Stokes，窐寧、葉綠素，熒光是吸收后的發(fā)射光不是漫反射，猝滅現(xiàn)象。1867，Goppelsorder首次熒光分析，鋁-桑色素配合物進(jìn)行鋁的測(cè)定。19世紀(jì)末合成了一些有機(jī)染料，認(rèn)識(shí)了熒光素、署紅、多環(huán)芳烴600多種熒光物質(zhì)。4.2、熒光壽命的發(fā)展歷史分析儀器-熒光光譜儀光速的測(cè)定及磷光計(jì)的發(fā)明，測(cè)定時(shí)間間隔0.0001s,不能測(cè)定熒光。Kerrcell(克爾盒）和熒光壽命的測(cè)定。時(shí)間間隔0.00000001s(熒光壽命通常在納秒級(jí)）。電子快門，前后放置偏振濾光鏡，不加電壓光線不通過，加電壓后，分子有序允許光線通過。分析儀器-熒光光譜儀分析儀器-熒光光譜儀分析儀器-熒光光譜儀4.3、熒光壽命測(cè)定方法1、時(shí)域法用超短光脈沖(1-2ns)激發(fā)樣品，測(cè)量樣品在激發(fā)后熒光強(qiáng)度的衰減將規(guī)律，根據(jù)樣品中各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度衰減曲線來擬合分析熒光壽命值。2、頻域法用強(qiáng)度按正弦規(guī)律調(diào)制的激光激發(fā)樣品，熒光強(qiáng)度按正弦調(diào)制，兩者頻率相同，通過激光相對(duì)與熒光的相位差及解調(diào)系數(shù)來測(cè)定熒光壽命。3、時(shí)間分辨熒光各向異性。4、多光子激發(fā)。分析儀器-熒光光譜儀5熒光探針具有環(huán)狀共軛雙鍵即π電子系統(tǒng)量子產(chǎn)率隨環(huán)境變化，而且變化很大(3)能產(chǎn)生穩(wěn)定熒光的小分子藻膽蛋白phycobiliprotein

綠色熒光蛋白GreenFluorescentProtein(4)與研究對(duì)象的特定基團(tuán)共價(jià)結(jié)合或與蛋白質(zhì)非共價(jià)結(jié)合分析儀器-熒光光譜儀熒光成像在醫(yī)學(xué)上有很長(zhǎng)的發(fā)展歷史。只有兩種熒光基團(tuán)被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）認(rèn)可，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，分別是吲哚花青綠（IGG）和熒光素。熒光素已經(jīng)有三十年的應(yīng)用史，最初是應(yīng)用于眼科；吲哚花青綠已經(jīng)被用作眼科劑，并且作為肝功能劑有五十年的歷史。

熒光探針在醫(yī)學(xué)成像中的發(fā)展歷史分析儀器-熒光光譜儀第三種熒光基團(tuán)是羅丹明B，1966年得到認(rèn)可并應(yīng)用，但是在1987年因?yàn)楹托∈蟀┌Y有關(guān)而被禁止使用。這兩種藥物主要用于獲得視網(wǎng)膜血管造影。要求相當(dāng)高劑量。（熒光素和吲哚花青綠的單人劑量分別為500和40毫克）雖然會(huì)發(fā)生過敏反應(yīng)之類的副作用，但是特殊的器官毒性還沒有被報(bào)道。分析儀器-熒光光譜儀熒光探針用于醫(yī)學(xué)成像的一般要求用于醫(yī)學(xué)成像的分子探針有以下要求：波長(zhǎng)亮度生物和光穩(wěn)定性藥物動(dòng)力學(xué)分析儀器-熒光光譜儀5.1波長(zhǎng)熒光基團(tuán)需要激發(fā)光才可以發(fā)射光。紫外區(qū)的激發(fā)光能引起組織損傷，近紅外區(qū)的激發(fā)光能給組織加熱。藍(lán)色和綠色激發(fā)光組織穿透性很差，使他們只能在表面組織或小的動(dòng)物組織中成像。黃光或紅光區(qū)（大約600nm），這些波長(zhǎng)會(huì)有過量的熒光出現(xiàn)，因?yàn)橛凶詣?dòng)生成的內(nèi)源性熒光。分析儀器-熒光光譜儀5.1

波長(zhǎng)較低波長(zhǎng)的激發(fā)光不能穿透組織產(chǎn)生散射光，所以即使散射波長(zhǎng)在理論成像上是合適的，激發(fā)光也不能穿透較深組織。激發(fā)光和散射光理想波長(zhǎng)在650-900nm。在這個(gè)波程內(nèi)，吸收和自發(fā)熒光都是最小的，所以光穿透是最大的

。分析儀器-熒光光譜儀5.2亮度

選擇熒光基團(tuán)需考慮的第二個(gè)因素是亮度。越明亮的試劑，穿透能力越強(qiáng)。但是，亮度的增加通常會(huì)導(dǎo)致探針尺寸的增長(zhǎng)。例如，用于基因編碼的綠色熒光蛋白基團(tuán)在深層的可視化活體成像中是非常明亮的，但它非常大，有25-50kDa，難于連接，使得它對(duì)許多應(yīng)用是不切實(shí)際的。量子點(diǎn)也是非常明亮的，但是由于較大的尺寸而難于接上目標(biāo)。其組成部分，例如硒和鎘，都是重金屬，其潛在的毒性問題必須考慮。分析儀器-熒光光譜儀5.3

穩(wěn)定性熒光基團(tuán)的穩(wěn)定性是又一個(gè)需要考慮的因素。雖然這些分子在體外通常是穩(wěn)定的，但是在體內(nèi)的穩(wěn)定性，尤其是在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化作用之后，穩(wěn)定性通常是值得商榷的。一旦被內(nèi)化到溶酶體內(nèi)，大部分的熒光基團(tuán)，除了羅丹明，包括熒光素，氟硼熒（BODIPY）和喹啉藍(lán)衍生物，都會(huì)在數(shù)天內(nèi)失去熒光。在羅丹明衍生物的案例中，熒光能維持至少一個(gè)星期的時(shí)間。此外，大多數(shù)有機(jī)熒光基團(tuán)被光漂白之后它們的熒光能力會(huì)受到威脅。因此，當(dāng)連續(xù)性觀察是必須之時(shí)，有機(jī)熒光探針必須反復(fù)被注射。而且在體外成功可能無法預(yù)知在體內(nèi)成功，因?yàn)樵噭┑纳锇胨テ诳赡芴?，起不到作用?/p>

分析儀器-熒光光譜儀5.3

穩(wěn)定性從運(yùn)動(dòng)的角度來看，一定水平的降解是合理的，因?yàn)檫@樣產(chǎn)品就能夠排泄出來。例如量子點(diǎn)，代謝起來非常慢，用于臨床必須完全的排泄出來。穩(wěn)定性不僅取決于熒光基團(tuán)，而且也取決于其偶合物。一旦熒光基團(tuán)通過一個(gè)連接器分子偶合到靶向配體，其穩(wěn)定性可能會(huì)因?yàn)橛煞纸獯x而產(chǎn)生的藥物動(dòng)力學(xué)改變而受到損害。例如，一個(gè)熒光基團(tuán)自身可能被迅速的排泄出去，但是當(dāng)將其與一個(gè)大的載體分子連接時(shí)，將會(huì)在體內(nèi)存在更長(zhǎng)的時(shí)間，從而產(chǎn)生不可預(yù)見的可能對(duì)熒光有害的作用。分析儀器-熒光光譜儀5.4

藥物動(dòng)力學(xué)

大部分小分子熒光基團(tuán)都能改變與之共軛的靶標(biāo)基團(tuán)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)，如多肽和蛋白質(zhì)，尤其是當(dāng)一個(gè)以上的熒光基團(tuán)連接到目標(biāo)共軛配體上時(shí)。例如，當(dāng)幾個(gè)熒光基團(tuán)，如羅丹明X和Cy5.5被連接到一個(gè)單一的蛋白質(zhì)分子時(shí)，熒光基團(tuán)能夠徹底改變靶向探針的藥物動(dòng)力學(xué)。當(dāng)這些小熒光連接到糖或氨基酸時(shí)，這些熒光基團(tuán)主導(dǎo)了藥物與人體之間的作用。量子點(diǎn)（Qdots）或其它的熒光納米微粒甚至比抗體更大，因此，與熒光顆粒如Qdots相連的特定目標(biāo)分子的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)與最終形式的探針差別很大。48分析儀器-熒光光譜儀（5）熒光探針的應(yīng)用分類測(cè)定細(xì)胞活性的熒光探針：活細(xì)胞探針和死細(xì)胞探針膜熒光探針：熒光基團(tuán)標(biāo)記的磷脂，陰離子膜探針，陽離子膜探針，其它非極性和雙親性膜探針。細(xì)胞器熒光探針：線粒體探針，溶酶體、酵母菌液泡和其它酸性細(xì)胞器的探針Ca2＋，

Mg2＋，Zn2＋，Na＋，

K＋，

Cl－等離子熒光探針pH熒光探針:近中性pH應(yīng)用的探針，酸性，探針交聯(lián)物活性氧和一氧化氮探針信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)探針：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸結(jié)合蛋白探針入胞作用、受體和離子通道探針pH細(xì)胞形態(tài)和流體測(cè)量的熒光示蹤劑細(xì)胞骨架蛋白熒光探針分析儀器-熒光光譜儀四熒光生色團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1天然熒光生色團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（1）碳原子骨架：分子具有共軛雙鍵體系，大多含有芳香環(huán)或雜環(huán)任何有利于提高π電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都將提高

熒光效率。例如：對(duì)苯基化，間苯基化等。

分析儀器-熒光光譜儀（2）分子的幾何排布：

具有剛性平面結(jié)構(gòu)

熒光素酚酞四熒光生色團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析儀器-熒光光譜儀（4）取代基的位置：鄰位、對(duì)位—熒光增強(qiáng)，間位—熒光減弱（-CN基例外）(5)環(huán)境、溶劑、溫度及pH等均會(huì)影響分子結(jié)構(gòu)，從而影響熒光四熒光生色團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（3）取代基的類型：（1）加強(qiáng)熒光的基團(tuán)：給電子取代基，

-NH2,-NHR,-OH,-OR,-CN,-OCH3,-OC2H5

（2）減弱熒光的基團(tuán)：得電子取代基，

-CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I

（3）影響不明顯的基團(tuán)：-R,-SO3H,-NH3分析儀器-熒光光譜儀2蛋白質(zhì)和核酸中的熒光生色團(tuán)Tryptophan(W,Trp)Phenylalanine(F,Phe)Tyrosine(Y,Tyr)四熒光生色團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析儀器-熒光光譜儀生色團(tuán)條件exnmmax10-3emnm

F

Fns敏感度

max

F10-2TrpH2O,pH72805.63480.22.611TyrH2O,pH72741.43030.13.61.4PheH2O,pH72570.22820.046.40.08Y-baseYeast-RNAPhe3201.34600.076.30.91亞硝基奈酚+Tyr茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Pheex:460nm,em:570nmex:365nm,em:515nm四熒光生色團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析儀器-熒光光譜儀

五影響熒光測(cè)量的因素1光化分解（photodissociation）光照后導(dǎo)致化學(xué)鍵斷裂——熒光減弱2淬滅(quenching)溫度淬滅：

溫度每升高10C，熒光減少的百分比，稱為溫度系數(shù)。在20-300C的范圍內(nèi)，溫度系數(shù)大約為1.5。濃度淬滅：21

內(nèi)濾光效應(yīng)（innerfiltereffect)(3)雜質(zhì)淬滅：3O2

1O2分析儀器-熒光光譜儀5.1.1動(dòng)態(tài)猝滅熒光猝滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致熒光強(qiáng)度變化或相關(guān)的激發(fā)峰位變化或熒光峰位變化的物理或化學(xué)作用過程。熒光的猝滅可以分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。一般情況下,動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅可根據(jù)不同溫度下的猝滅常數(shù)來判斷。動(dòng)態(tài)猝滅又稱碰撞猝滅,它是熒光體之間相互碰撞導(dǎo)致的猝滅,而靜態(tài)猝滅是由于生成了復(fù)合物而引起的熒光猝滅。5.1.熒光猝滅理論分析儀器-熒光光譜儀

動(dòng)態(tài)的碰撞猝滅理論可以用Stern–Volmer方程來描述:F0,F—分別是不存在和存在猝滅體時(shí)的熒光強(qiáng)度

kq—是生物大分子的猝滅常數(shù)

τ0—是不存在猝滅時(shí)熒光體的熒光壽命

[Q]—是猝滅體的濃度

kqτ0=Ksv稱為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。根據(jù)方程,以猝滅據(jù)F0/F和猝滅體濃度作圖應(yīng)得到一條直線,其中斜率為Stern-Volmer猝滅常數(shù),

Ksv

隨著溫度的升高而升高。分析儀器-熒光光譜儀

靜態(tài)猝滅是熒光體和猝滅體之間形成了不產(chǎn)生熒光的復(fù)合物而引起的。靜態(tài)猝滅可以用Lineweave-Burk方程來描述:

式中K是熒光體和猝滅體之間的結(jié)合常數(shù)，可以通過方程得到的直線的斜率和截距求得。5.1.2靜態(tài)猝滅分析儀器-熒光光譜儀

由于靜態(tài)猝滅是由熒光體和猝滅體形成了復(fù)合物而引起的,溫度升高會(huì)降低復(fù)合物的穩(wěn)定性,因此,靜態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)會(huì)隨著溫度的升高而降低;動(dòng)態(tài)猝滅是由于熒光體和猝滅體之間的碰撞引起的,所以,溫度升高會(huì)增加它們之間的有效碰撞,導(dǎo)致猝滅速率加快,猝滅常數(shù)也增大。分析儀器-熒光光譜儀

激基締合物(Excimer)是指兩個(gè)同種分子或原子的聚集體在激發(fā)態(tài)時(shí)兩分子或原子作用較強(qiáng)，產(chǎn)生新的能級(jí)，使發(fā)射光譜不同于單個(gè)物種,無精細(xì)結(jié)構(gòu),而在基態(tài)時(shí)作用較弱或無作用。

5.2激基締合物分析儀器-熒光光譜儀3溶液pH的影響利用一些物質(zhì)在不同pH值溶液中熒光強(qiáng)度和顏色的改變，可以判別各種滴定的終點(diǎn)。指示劑顏色變化pH范圍萘酚無色變黃綠8.2-10.3熒光素淺綠變綠4.0-5.0丫啶橙淺黃綠變黃8.0-10.0分析儀器-熒光光譜儀4溶液極性的影響熒光物質(zhì)在非極性溶液中的發(fā)射峰位比其在極性溶液中的峰位向短波方向（或高頻方向）移動(dòng)，即藍(lán)移，同時(shí)熒光強(qiáng)度前者也高于后者。DPH水溶液中膜中發(fā)射波長(zhǎng)：440nm發(fā)射波長(zhǎng)：430nm分析儀器-熒光光譜儀5溶劑和化學(xué)試劑(1)溶劑選擇要適宜例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。(2)溶劑要純6熒光污染(1)涂活塞用的潤(rùn)滑油以及橡皮塞和軟木塞(2)去污劑(3)微生物污染(4)濾紙分析儀器-熒光光譜儀六熒光分光光度術(shù)的應(yīng)用(一）.物質(zhì)的檢測(cè)

1測(cè)量原理：稀溶液，F(xiàn)=

I0εcL

2結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：含有“芳香環(huán)”結(jié)構(gòu)

3靈敏度：10-7~10-8g/ml分析儀器-熒光光譜儀檢測(cè)物質(zhì)激發(fā)波長(zhǎng)nm發(fā)射波長(zhǎng)nm維生素A345490維生素B2，pH7370565維生素B12，pH7275305維生素C4905303,4-苯并芘10-6g/ml3814035羥色胺，中性或弱酸性2953305羥色胺，鹽酸295550，330分析儀器-熒光光譜儀研究生物大分子構(gòu)象

（二）蛋白質(zhì)的熒光分析1蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光分析儀器-熒光光譜儀2蛋白質(zhì)的外源熒光分析儀器-熒光光譜儀（三）核酸的熒光分析１嘌呤及衍生物室溫，用紫外和可見光照射，中性水溶液中，均無熒光。酸性介質(zhì)中，腺嘌呤和鳥嘌呤有熒光。堿性介質(zhì)中，鳥嘌呤有熒光２嘧啶及衍生物游離的胸腺嘧啶有自發(fā)熒光，但量子產(chǎn)率極低Φ＝0.00153核酸的熒光標(biāo)記分析儀器-熒光光譜儀ProbesexemNoteEthidiumBromide545610非透膜，RNA,DNAPropidiumIodine530615PO-PRO-1iodine435455AcridineOrange490590透膜，RNA,DNAPyroninY545580Bisbenzimide345460透膜，DNA分析儀器-熒光光譜儀（四）利用熒光技術(shù)檢測(cè)分子間結(jié)合程度1用熒光偏振變化檢測(cè)結(jié)合程度當(dāng)一些小分子，如輔酶、輔基、半抗原等與特異蛋白質(zhì)反應(yīng)時(shí)，改變其熒光特性（強(qiáng)度與偏振），通過這些參數(shù)的變化，可以了解他們結(jié)合時(shí)的信息。結(jié)合后的大分子馳豫時(shí)間長(zhǎng)，熒光偏振就大。分析儀器-熒光光譜儀用殺鼠靈滴定HSAScatchard圖r

=[L]

Ka(n-r)

[L]=[L0]–[LP]=[L0]–r[P0]λex=320nmλem=400nm2用熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)結(jié)合程度分析儀器-熒光光譜儀（五）大分子內(nèi)基團(tuán)間或分子間距離的測(cè)定熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)分析儀器-熒光光譜儀熒光共振能量轉(zhuǎn)移的三個(gè)條件：供體和受體都能發(fā)光供體的發(fā)射譜和受體的激發(fā)譜必須有部分重疊供體和受體的距離必須小于100?分析儀器-熒光光譜儀Forster公式E=R06/(R6+R06)R0:臨界距離，E：轉(zhuǎn)移效率，R：基團(tuán)間距離E=1-IDA/ID

IDA:受體存在時(shí)的熒光強(qiáng)度，ID：受體不存在時(shí)的熒光強(qiáng)度

大分子內(nèi)基團(tuán)間或分子間距離的測(cè)定分析儀器-熒光光譜儀分析儀器-熒光光譜儀

寡核苷酸用作分子探針和生物傳感器(通過連接許多熒光團(tuán)到寡核苷酸鏈上)

1.雜交型探針：靶標(biāo)分子與探針互補(bǔ)匹配。

2.適配子探針：（傳感器）三維空間生物識(shí)別

分析儀器-熒光光譜儀熒光團(tuán)猝滅劑凝血酶寡核苷酸發(fā)夾結(jié)構(gòu)同理，若將猝滅劑改為另一種熒光團(tuán)，利用FRET原理也可用于檢測(cè)凝血酶的活性。寡核苷酸的適配子探針分析儀器-熒光光譜儀

雙重芘標(biāo)記的DNA探針，芘部分被發(fā)夾結(jié)構(gòu)牢牢的拴在一起，形成激態(tài)聚合體，在485nm發(fā)射熒光。當(dāng)與RNA結(jié)合時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，芘分成兩部分，熒光發(fā)射藍(lán)移到378nm和397nm（單體）形成DNA-RNA的雜交體。加入RNaseH后，RNA鏈被分裂下來，DNA又恢復(fù)為原來的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，芘部分重新結(jié)合形成激態(tài)聚合體，發(fā)射波長(zhǎng)為485nm，熒光增強(qiáng)。整個(gè)過程可用于檢測(cè)RNaseH的活性。分析儀器-熒光光譜儀1膜流動(dòng)性

DPH：P值小，流動(dòng)性高

2-AS，6-AS，9-AS，12-AS高2膜滲漏性羧基熒光素(selfquenching)3膜電位的測(cè)量Nernst公式：E(mV)=59log(KO+/KI+)

KO+：細(xì)胞外濃度，KI+：細(xì)胞內(nèi)濃度熒光探劑：花菁（cyanine)

K+載體：纈氨霉素：

（六）膜生物物理研究分析儀器-熒光光譜儀4膜融