海南講課無菌檢查法課件

2005年版無菌檢查法修訂情況2025/2/111海南講課無菌檢查法無菌檢查法是作為批無菌產(chǎn)品放行檢驗或監(jiān)管部門對無菌產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督中的一個檢查項目，它建立在批產(chǎn)品受微生物污染是均一的假設(shè)上。

從檢查類型看：檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種。從標(biāo)準(zhǔn)看：品種項下、制劑通則、微生物限度標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)簽標(biāo)示無菌。無菌檢查法的應(yīng)用

2025/2/112海南講課無菌檢查法無菌檢查法的局限性。修訂：試驗環(huán)境、培養(yǎng)基質(zhì)量、檢驗量、檢查法、結(jié)果判斷等方面。防止假陽性和假陰性，增加了試驗的可操作性。方法更具科學(xué)性，提高檢出率，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性?？s小與先進(jìn)國家藥典的無菌檢查法的差別。無菌檢查法修訂的特點(diǎn)

2025/2/113海南講課無菌檢查法

若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定,僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。也就是無菌試驗并不能用于保證整批產(chǎn)品的無菌性，但是它可用于確定批產(chǎn)品不符合無菌要求。無菌產(chǎn)品的無菌概念;無菌檢查法的局限性。

2025/2/114海南講課無菌檢查法無菌物品是指物品中不含任何活的微生物。實際生產(chǎn)過程中，批滅菌是指將物品中污染的微生物殘存概率下降至一定水平，最終滅菌產(chǎn)品微生物存活的概率一般不得高于10-6，即滅菌后微生物存活的概率不得大于百萬分之一。滅菌產(chǎn)品的無菌保證并不能依賴于最終產(chǎn)品的無菌檢驗，而是取決于生產(chǎn)過程中采用合格的滅菌工藝、嚴(yán)格的GMP管理和良好的全面質(zhì)量保證體系(生產(chǎn)過程的控制)。

無菌產(chǎn)品的無菌概念

2025/2/115海南講課無菌檢查法無菌檢查法的局限性

-1

從理論上來說，要確定批產(chǎn)品的無菌性，應(yīng)對每個容器進(jìn)行無菌檢查。但是無菌試驗對樣品是破壞性的，因此不可能對每一最小包裝的產(chǎn)品進(jìn)行檢查。2025/2/116海南講課無菌檢查法無菌檢查法的局限性-2

統(tǒng)計概率的局限性：對于低污染水平的產(chǎn)品，其局限性在統(tǒng)計學(xué)上更為明顯。產(chǎn)品的污染率越低，以無菌試驗結(jié)果判斷批產(chǎn)品無菌的可信度就越差。污染率越低，同樣的取樣量，誤將產(chǎn)品判為合格的概率越高。在同一個污染水平的條件下，取樣數(shù)越大，以菌試驗結(jié)果判斷批產(chǎn)品無菌的可信度就越大。但是，對于污染水平極低的產(chǎn)品，即使加大取樣數(shù)，提高的可信度也是微不足道的。同時，過多的取樣數(shù)也增加了試驗過程的污染機(jī)率，對無菌試驗結(jié)果的判斷同樣造成影響。2025/2/117海南講課無菌檢查法無菌檢查法的局限性-3

檢驗條件的局限：無菌檢查法是根據(jù)試驗的培養(yǎng)基中是否有微生物生長來判斷樣品的無菌性，液體培養(yǎng)基渾濁一般表明樣品受微生物的污染。因此,樣品中污染的微生物的檢出受多種因數(shù)的影響，只有在各檢驗條件符合污染微生物的修復(fù)和生長時，才能保證被檢樣品的無菌檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。污染的檢出率要比實際產(chǎn)品的污染率低。2025/2/118海南講課無菌檢查法無菌檢查的設(shè)施及環(huán)境要求2000版：無菌檢查在局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)。2005版：環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單項流空氣區(qū)域。

無菌隔離系統(tǒng)。2025/2/119海南講課無菌檢查法保證無菌試驗結(jié)果正確判斷的先決條件。防止試驗過程污染的措施不能影響試驗中應(yīng)生長的微生物的生長。無菌室的清潔處理：試驗前后。試驗物品：如有可能，進(jìn)入無菌操作區(qū)的所有物品都應(yīng)采用適宜的方法進(jìn)行消毒處理。潔凈區(qū)域的大小應(yīng)滿足試驗所用的物品能合理的擺放，以不影響無菌空氣的流向。2025/2/1110海南講課無菌檢查法無菌檢查設(shè)施及環(huán)境的檢查單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。每次無菌試驗的無菌操作區(qū)域的沉降菌檢查。2025/2/1111海南講課無菌檢查法無菌試驗用培養(yǎng)基無菌檢查法是建立在樣品污染的微生物能在規(guī)定的培養(yǎng)基中生長的基礎(chǔ)上。因此，無菌檢查用的培養(yǎng)基質(zhì)量是無菌試驗成功與否的關(guān)鍵因素。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。2025/2/1112海南講課無菌檢查法培養(yǎng)基的命名依培養(yǎng)基處方命名,與國外藥典一致。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基）—可培養(yǎng)好氧菌、厭氧菌。改良馬丁培養(yǎng)基（真菌培養(yǎng)基）—可培養(yǎng)真菌、好氧菌。2025/2/1113海南講課無菌檢查法

培養(yǎng)基的裝量

不做具體量的規(guī)定，應(yīng)根據(jù)使用目的而定如培養(yǎng)基的容器高度、檢驗量及檢查方法。2025/2/1114海南講課無菌檢查法

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基氧化層的顏色

接種前：在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并應(yīng)防止被污染。培養(yǎng)后：裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。2025/2/1115海南講課無菌檢查法培養(yǎng)基配制后應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。培養(yǎng)基配制后應(yīng)盡快滅菌，避免微生物的繁殖。一般采用濕熱滅菌法，滅菌程序均應(yīng)驗證后方可采用。以防止采用不適當(dāng)?shù)募訜岷蜏缇鷹l件導(dǎo)致滅菌不徹底或培養(yǎng)基顏色及PH的變化、透明度及瓊脂凝固力的降低等變化，導(dǎo)致培養(yǎng)基不符合質(zhì)量要求。培養(yǎng)基的滅菌2025/2/1116海南講課無菌檢查法培養(yǎng)基滅菌程序的驗證合格的培養(yǎng)基滅菌程序，應(yīng)通過無菌性試驗、靈敏度試驗及生物指示劑進(jìn)行驗證。此外，還需驗證高壓滅菌器的蒸汽循環(huán)系統(tǒng)以保證在一定裝載條件下的正常熱分布。同時應(yīng)注意滅菌器的溫度上升和下降不能太慢，防止培養(yǎng)基的過熱滅菌。由于滅菌器的裝載將影響滅菌時間和效果，所以合格的滅菌程序是指一定裝載下的滅菌程序。2025/2/1117海南講課無菌檢查法培養(yǎng)基的貯藏制備好的培養(yǎng)基應(yīng)在2-25℃保存，保存在非密容器中，應(yīng)在3周內(nèi)使用；保存在密閉容器中，可在1年內(nèi)使用。在使用前應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，合格后方可使用。培養(yǎng)基若保存在非密容器中，培養(yǎng)基的外部應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)陌?，培養(yǎng)基容器的塞子和保藏的條件應(yīng)使配制好的培養(yǎng)基最低限度的失去水分，并防止微生物的污染。2025/2/1118海南講課無菌檢查法無菌檢查培養(yǎng)溫度改良馬丁培養(yǎng)基置23～28℃培養(yǎng)。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30～35℃培養(yǎng)。2025/2/1119海南講課無菌檢查法培養(yǎng)基的適用性檢查無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行。在實驗室中，培養(yǎng)基若使用同一批脫水培養(yǎng)基，并采用已驗證過的配制和滅菌方法配制，那么由同一批脫水培養(yǎng)基配制的培養(yǎng)基可以不進(jìn)行批批靈敏度檢查。如果培養(yǎng)基制備的方法不經(jīng)驗證，那么，每一批配制的培養(yǎng)基必須進(jìn)行靈敏度試驗。2025/2/1120海南講課無菌檢查法培養(yǎng)基的無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。2025/2/1121海南講課無菌檢查法培養(yǎng)基的靈敏度檢查增加靈敏度檢查用菌種增加菌種傳代要求對菌液制備方法不做具體要求提高判斷標(biāo)準(zhǔn)2025/2/1122海南講課無菌檢查法靈敏度檢查用菌種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基-金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌。改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基-白色念珠菌、黑曲霉。菌種要求菌株傳代次數(shù)不得超過5代，采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物特性。2025/2/1123海南講課無菌檢查法菌液制備方法加菌量：小于100cfu（１ml,0.1ml)。培養(yǎng)時間：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基-3天；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基-5天。結(jié)果判斷：加菌的培養(yǎng)基管均應(yīng)生長良好。2025/2/1124海南講課無菌檢查法稀釋液、沖洗液0.1%蛋白胨無菌水溶液

PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋液、沖洗液配制后應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑。2025/2/1125海南講課無菌檢查法無菌檢查方法的驗證2000年版的中國藥典無菌檢查法的抑細(xì)菌和抑真菌的試驗，其目的是采用直接接種法確定供試品是否具有抑菌作用。而2005年版驗證試驗的目的是確定供試品的無菌檢查的方法，它既確定了該檢驗方法下供試品的抑菌性，又確定了適宜的檢驗方法和檢驗條件。2025/2/1126海南講課無菌檢查法抽樣

無菌檢查的樣品除特殊規(guī)定外，一般采取隨機(jī)抽樣原則進(jìn)行取樣。由于無菌檢查法的統(tǒng)計學(xué)局限性，對于同一批的無菌分裝的產(chǎn)品，應(yīng)盡量抽取批生產(chǎn)開始和結(jié)束或生產(chǎn)過程出現(xiàn)異常情況下的產(chǎn)品組成樣本進(jìn)行檢驗。對于采用最終滅菌的產(chǎn)品，應(yīng)抽取每一滅菌柜中經(jīng)驗證過的可能存在滅菌不徹底的點(diǎn)的產(chǎn)品組成樣本進(jìn)行檢驗。如果試驗結(jié)果判為無效，那么重試試驗的樣品應(yīng)盡量取與初試同一時間分裝或同一滅菌位置的樣品進(jìn)行檢驗。2025/2/1127海南講課無菌檢查法批產(chǎn)品出廠的檢驗數(shù)量-1是指批產(chǎn)品出廠檢驗時，每種培養(yǎng)基接種的最少樣品容器數(shù),依批生產(chǎn)量而定。出廠檢驗與上市抽驗檢驗批次的界定區(qū)別。

2025/2/1128海南講課無菌檢查法批產(chǎn)品出廠的檢驗數(shù)量-2每種培養(yǎng)基的最小檢驗數(shù)量若每個容器的樣品裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基，應(yīng)增加一倍的檢驗數(shù)量。＜100，10%或最少4個→≤100，10%或4個（取較多者）。

＞500，

2%或最多20個→＞500

，2%或20個（取較少者）。大體積注射劑、抗生素原料藥、醫(yī)療器具的批產(chǎn)品最低檢驗數(shù)量。

2025/2/1129海南講課無菌檢查法

批產(chǎn)品出廠最少檢驗數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個）每種培養(yǎng)基最少檢驗數(shù)量注射劑

≤10010%或4個（取較多者）

100＜N≤50010個

＞5002%或20個（取較少者）大體積注射劑（>100ml)

2%或10個（取較少者）眼用及其他非注射產(chǎn)品

≤200＞2005%或2個（取較多者）

10個桶裝固體原料

≤4每個容器海南講課無菌檢查法續(xù)上

批產(chǎn)量N（個）每種培養(yǎng)基最少檢驗數(shù)量桶裝固體原料

4＜N≤5020%或4個容器（取較大者）

＞50

2%或10個容器（取較大者）

抗生素固體原料藥（≥5克）6個容器醫(yī)療器具

≤10010%或4件（取較大者）

100＜N≤500

10件

＞5002%或20件（取較少者）

2025/2/1131海南講課無菌檢查法上市抽驗樣品的最少檢驗數(shù)量-1采用固定抽樣法,不依批生產(chǎn)量而定。表2、3的最少檢驗數(shù)量–每種培養(yǎng)基的最少檢驗量。各容器的樣品裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基，應(yīng)增加一倍的檢驗數(shù)量。2025/2/1132海南講課無菌檢查法上市抽驗樣品的最少檢驗數(shù)量-2規(guī)定同一品種用直接接種法與薄膜過濾法的檢驗數(shù)量應(yīng)一致，實際上是增加了薄膜過濾法的檢驗數(shù)量。修訂了液體樣品上市抽驗的最小檢驗數(shù)量，增加了固體樣品上市抽驗的最小檢驗數(shù)量的規(guī)定。對上市的抗生素制劑檢驗不另作規(guī)定。抗生素粉針劑（≥5克）及抗生素原料藥（≥5克）的最少檢驗數(shù)量為6瓶（或支），桶裝固體原料的最少檢驗數(shù)量為4個包裝。2025/2/1133海南講課無菌檢查法陽性對照試驗的供試品數(shù)量一般情況下：供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗數(shù)量作陽性對照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。特殊處理2025/2/1134海南講課無菌檢查法

上市抽驗樣品（液體制劑）的最少檢驗量供試品裝量V(ml)每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少量（ml)最少檢驗數(shù)量（瓶或支）≤11<V<55≤V<2020≤V<5050≤V<10050≤V<100(靜脈給藥）100≤V≤500V＞500全量半量2510半量半量50020101010101066海南講課無菌檢查法

上市抽驗樣品（固體制劑）的最少檢驗量供試品裝量M（mg/支或瓶）每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最小量（mg)最少檢驗數(shù)量（瓶或支）M<5050≤M<300300≤M<5gM≥5g外科用敷料棉花及紗布縫合線、一次性醫(yī)用材料帶導(dǎo)管的一次性醫(yī)療器具（輸液袋）其它醫(yī)療器具全量半量150500取100mg或1cm×3cm整個材料整個器具（切碎或拆散開）2010101020101020海南講課無菌檢查法檢驗量-1是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按表2、表3規(guī)定。固體供試品的檢驗量。采用直接接種法時，若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。2025/2/1137海南講課無菌檢查法檢驗量-2薄膜過濾法的檢驗量應(yīng)不少于直接接種法的總接種量（接種兩種培養(yǎng)基的量的和）每個容器裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基：檢驗容器數(shù)加倍。每個容器裝量夠接種兩種培養(yǎng)基只要供試品特性允許（包括溶解性，抑菌性等），應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。若由于供試品的特性（如抑菌作用太強(qiáng)），按要求對其供試液進(jìn)行處理后，還不符合驗證試驗的規(guī)定，那么檢驗量可酌情減少，但是每支（瓶）供試品的取樣量應(yīng)不少于直接接種法供試品的接種量。2025/2/1138海南講課無菌檢查法如何確定總?cè)恿浚ㄗ銐蚪臃N三份培養(yǎng)基）依據(jù)：生產(chǎn)量、裝量、產(chǎn)品特性。舉例：批（柜）生產(chǎn)量＞1000個每種培養(yǎng)基最少檢驗數(shù)量20個–2%或20個（取較少者）裝量≤1ml（全量接種）,直接接種法40+1=41個容器薄膜過濾法40+20=60個容器裝量1＜V＜5ml（半量接種）,直接接種法20+1=21個容器薄膜過濾法20+10=30個容器2025/2/1139海南講課無菌檢查法如何確定總?cè)恿垦b量5≤V＜6ml（接種2ml）直接接種法20個容器薄膜過濾法20+10=30個容器裝量6≤V＜20ml（接種2ml）直接接種法20個容器薄膜過濾法一般產(chǎn)品20+10=30個容器特殊產(chǎn)品（如抑菌作用很強(qiáng)）20個容器，需要時，可不全部過濾。

2025/2/1140海南講課無菌檢查法

供試品的無菌檢查

無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。如只要供試品性狀允許（包括能直接過濾或經(jīng)過處理后能過濾的供試品），應(yīng)采用薄膜過濾法。在供試品的無菌檢查中，所采用的方法及檢驗條件應(yīng)同驗證的方法。2025/2/1141海南講課無菌檢查法供試品的處理

無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對微生物生長及存活無影響（計數(shù)）。2025/2/1142海南講課無菌檢查法薄膜過濾法-1薄膜過濾法應(yīng)優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器,也可使用一般薄膜過濾器。無菌檢查用薄膜過濾器的濾膜孔徑應(yīng)為不大0.45μm，直徑約為50mm。（若需要采用其他直徑的濾膜，其稀釋掖和沖洗液的體積應(yīng)做相應(yīng)的調(diào)整）根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)，如硝酸纖維素膜可用于水溶性的、油類及低濃度乙醇樣品；醋酸纖維素膜可用于高濃度乙醇樣品；特殊的樣品需用特殊的濾膜，如抑菌性供試品采用具有疏水性邊緣及低吸附性的濾膜。2025/2/1143海南講課無菌檢查法薄膜過濾法-2濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法進(jìn)行滅菌。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，沖洗液、沖洗量及沖洗方法同方法驗證試驗。每片濾膜的總過濾量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損傷。2025/2/1144海南講課無菌檢查法水溶液供試品

取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100ml培養(yǎng)細(xì)菌及真菌的培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。如采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含50ml培養(yǎng)細(xì)菌及真菌培養(yǎng)基的容器中，其中一份做陽性對照用。2025/2/1145海南講課無菌檢查法可溶性固體制劑供試品

取規(guī)定量，加適宜的溶劑溶解或按標(biāo)簽說明復(fù)溶，根據(jù)其溶解性按水溶液或非水溶性供試品項下的方法操作。2025/2/1146海南講課無菌檢查法?-內(nèi)酰胺類抗生素供試品

取規(guī)定量，按水溶液或固體制劑供試品的處理法處理，立即過濾，用適宜的沖洗液沖洗濾膜。再用含適量?-內(nèi)酰胺酶的沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜上的抗生素后接種培養(yǎng)基，必要時培養(yǎng)基中可加少量的?-內(nèi)酰胺酶；或?qū)V膜直接接種至含適量?-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基中。接種培養(yǎng)基的方法按水溶液供試品項下的方法操作。試驗證明，為使?-內(nèi)酰胺酶發(fā)揮充分作用，又避免試驗操作時間太長而損傷微生物，含?-內(nèi)酰胺酶的沖洗液注入后應(yīng)輕輕搖晃濾筒，使酶充分接觸濾筒壁和濾膜上的抗生素，放置15分鐘再過濾比較適宜。另外，?-內(nèi)酰胺酶的使用量應(yīng)經(jīng)驗證試驗確認(rèn)，使用前應(yīng)進(jìn)行無菌檢查。2025/2/1147海南講課無菌檢查法非水溶性制劑供試品

取規(guī)定量，直接過濾；或混合溶于含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾。用含0.1～1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少3次。濾膜于含或不含聚山梨酯80的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接種培養(yǎng)基的方法按水溶液供試品項下的方法操作。2025/2/1148海南講課無菌檢查法可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品

取規(guī)定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯中，無菌十四烷酸異丙酯的用量同方法驗證試驗。劇烈振搖，使供試品充分溶解，如果需要可適當(dāng)加熱，但溫度不得超過44℃，趁熱迅速過濾。若無法過濾，接著應(yīng)加入不少于100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾后濾膜沖洗及接種培養(yǎng)基按非水溶性供試品項下的方法操作。2025/2/1149海南講課無菌檢查法無菌氣（噴）霧劑供試品

無菌氣霧劑及含供試品拋射劑的噴霧劑由于容器內(nèi)的壓力大，出于對試驗的準(zhǔn)確性和操作安全考慮，應(yīng)將試驗容器置低溫一定時間后，再無菌開啟容器進(jìn)行無菌檢查。取規(guī)定數(shù)量的供試品，將各容器置冰室冷凍約1小時。用無菌鋼錐按無菌操作迅速在容器上端鉆一小孔，勿移出鋼錐，轉(zhuǎn)動容器使拋射劑釋放后再無菌開啟容器，然后按水溶性制劑或非水溶性制劑項下的方法操作。2025/2/1150海南講課無菌檢查法裝有藥物的注射器供試品

取規(guī)定量，裝上無菌針頭（非包裝中所配帶的），吸入稀釋液或標(biāo)簽所示的溶劑溶解，按水溶性制劑或非水溶性供試品項下方法操作。同時應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。2025/2/1151海南講課無菌檢查法具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具(輸血、輸液袋等)供試品

取規(guī)定量，用沖洗液50~100ml/袋分別沖洗內(nèi)壁，收集沖洗液于無菌容器中，按水溶性制劑項下方法操作。同時應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。2025/2/1152海南講課無菌檢查法直接接種法每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%。同時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。直接接種法的培養(yǎng)基用量應(yīng)根據(jù)接種的樣品量而定，當(dāng)檢驗量為大體積時，根據(jù)檢驗量可采用適宜倍數(shù)濃縮的培養(yǎng)基。適宜倍數(shù)濃縮的培養(yǎng)基也可直接加入樣品的容器中。每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗數(shù)量。2025/2/1153海南講課無菌檢查法采用直接接種法的供試品

混懸液等非澄清水溶液

?-內(nèi)酰胺類或磺胺類非水溶性制劑敷料腸線、縫合線等滅菌醫(yī)用器具放射性藥品2025/2/1154海南講課無菌檢查法敷料供試品取規(guī)定數(shù)量，以無菌操作拆開包裝，于不同部位分別剪取約100mg或1cm×3cm的供試品，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。腸線、縫合線等供試品

腸線、縫合線及其它一次性使用的醫(yī)用材料按規(guī)定量取最小包裝，無菌拆開包裝，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。滅菌醫(yī)用器具供試品取規(guī)定量，必要時應(yīng)將其拆散或切成小碎段，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。2025/2/1155海南講課無菌檢查法陽性對照試驗-1

陽性對照試驗是用于確認(rèn)試驗結(jié)果是否為假陰性，也就是確證檢驗系統(tǒng)是否正常及檢驗過程的操作是否正確。當(dāng)驗證試驗與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行時，可不進(jìn)行該項試驗。除加陽性菌外，陽性對照管的操作同供試品檢查管。陽性對照管在接種培養(yǎng)基和供試品后移應(yīng)至陽性菌接種室接入小于100cfu的對照菌，并與供試品檢查管分開培養(yǎng)，以避免交叉污染。陽性對照管培養(yǎng)48～72小時應(yīng)生長良好。2025/2/1156海南講課無菌檢查法陽性對照試驗

-2

試驗時根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌。無抑菌作用的供試品、抗細(xì)菌為主的中藥制劑及抗革蘭陽性菌為主的化學(xué)制劑，以金黃色葡萄球菌為對照菌?？垢锾m陰性菌為主的化學(xué)制劑以大腸埃希菌為對照菌?？箙捬蹙墓┰嚻?，以生孢梭菌為對照菌。抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。2025/2/1157海南講課無菌檢查法陰性對照試驗陰性對照試驗是用于確認(rèn)試驗結(jié)果是否為假陽性，也就是確認(rèn)無菌試驗的環(huán)境、無菌操作及試驗相關(guān)材料的無菌性。陰性對照管，除不加供試品外，其他所有的操作及培養(yǎng)時間同供試品檢查管。陰性對照不得有菌生長。2025/2/1158海南講課無菌檢查法培養(yǎng)時間

各容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。國外藥典：培養(yǎng)時間不得少于14天。參數(shù)放行2025/2/1159海南講課無菌檢查法

觀察

培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)2日、真菌培養(yǎng)3日，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面有無菌生長；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。2025/2/1160海南講課無菌檢查法

結(jié)果判斷培養(yǎng)結(jié)束后，陽性對照管應(yīng)有菌生長，陰性對照管應(yīng)澄清。否則，應(yīng)判試驗結(jié)果無效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定。若供試品管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。以一次檢出為準(zhǔn)，不得復(fù)試。除非有證據(jù)充分證明檢出的微生物非供試品本身所致，原檢驗結(jié)果無效，應(yīng)重試。2025/2/1161海南講課無菌檢查法一次檢出理由低污染供試品的檢出率問題操作環(huán)境、實驗條件的改善2025/2/1162海南講課無菌檢查法當(dāng)符合下列至少一個條件時，方可判試驗結(jié)果無效：⑴無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。⑵回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。⑶陰性對照管有菌生長。⑷供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。2025/2/1163海南講課無菌檢查法

常規(guī)的微生物或生化技術(shù)一般用于鑒定無菌試驗中發(fā)現(xiàn)的微生物。然而，如果生產(chǎn)企業(yè)希望采用這些作為唯一的無菌試驗結(jié)果驗證標(biāo)準(zhǔn)，那么必須采用敏感的方法去論證來自樣品的微生物與來自試驗用材料和環(huán)境的微生物是同一種。當(dāng)日常微生物或生化鑒定技術(shù)能夠論證兩種分離物是不同的時候，那些方法可能是不夠靈敏或不足以提供明確的證據(jù)以證明兩種分離的微生物是同一來源。更敏感的試驗方法（如同源的RNA/DNA分子復(fù)制）可能需被用于測定分離的微生物是克隆關(guān)系及由同一菌株繁殖而成的。2025/2/1164海南講課無菌檢查法重試

試驗若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。2025/2/1165海南講課無菌檢查法2005年版藥典微生物限度檢查法的修訂情況海南講課無菌檢查法

起草的指導(dǎo)思想:

完善檢查法.

增加試驗的可操作性.

使方法更具科學(xué)性，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性.

與國際接軌.微生物限度檢查法

2025/2/1167海南講課無菌檢查法操作環(huán)境的潔凈度要求及定期檢查;滅菌程序的驗證；非水溶性供試品的供試液制備法；乳化劑、中和劑可行性及用量驗證；細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)方法及控制菌檢查法的驗證；細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)增加薄膜過濾法;大腸菌群檢查法；梭菌檢查法。增訂的內(nèi)容2025/2/1168海南講課無菌檢查法檢驗量培養(yǎng)溫度稀釋劑菌數(shù)報告規(guī)則沙門菌檢查法控制菌檢查法的寫法修訂的內(nèi)容2025/2/11海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（1）-總則

操作環(huán)境●潔凈度：微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染。

●潔凈度定期檢測:單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌、和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗證。2025/2/1170海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（1）-總則●霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23～28℃?！窠Y(jié)果報告：以1g、1ml、10g、10ml

或

10cm2為單位報告。2025/2/1171海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（2）-檢驗量●隨機(jī)抽取不少于檢驗量（兩個以上最小包裝單位）的3倍。●貴重、微量樣品的檢驗量可以酌減?！?/p>

要求檢查沙門菌的供試品其檢驗量應(yīng)增加10g或10ml。

2025/2/1172海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（3）-供試液制備●

表面活性劑、中和劑或滅活劑：應(yīng)證明其有效性及對微生物的生長和存活無影響?！窆┰囈簭闹苽渲良尤霗z驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時?！窆┰囈褐苽淙粜栌盟〖訙貢r，溫度不應(yīng)超過45℃。

●供試液的體積：100ml。

2025/2/1173海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（3）-供試液制備供試品分類液體供試品固體、半固體或黏稠液性供試品需用特殊供試液制備方法的供試品

非水溶性供試品膜劑供試品腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品氣霧劑、噴霧劑供試品具抑菌活性的供試品

2025/2/1174海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（3）-供試液制備●非水溶性供試品：增加“十四烷酸異丙酯法”?！窠Y(jié)腸溶制劑供試品：用pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液溶解?！窬咭志钚缘墓┰嚻罚涸黾臃椒ǖ目刹僮餍?。2025/2/1175海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（4）——滅菌培養(yǎng)基及稀釋劑等滅菌:采用驗證合格的滅菌程序進(jìn)行滅菌。2025/2/1176海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（5）——稀釋劑稀釋劑：pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液

pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液

pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液

2025/2/1177海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（6）-細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)●計數(shù)方法：平皿法、薄膜過濾法●按已驗證的計數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。2025/2/1178海南講課無菌檢查法細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)-平皿法●培養(yǎng)時間:必要時，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至5～7天

.●點(diǎn)計霉菌和酵母菌數(shù).●同稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)不小于15時，則兩個平板菌落數(shù)不能相差1倍或以上。●培養(yǎng)基平板上生長特殊菌落.●菌數(shù)報告規(guī)則.2025/2/1179海南講課無菌檢查法細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)

-薄膜過濾法方法菌數(shù)報告規(guī)則2025/2/1180海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（7）-控制菌檢查⑴修訂特點(diǎn):

減少篇幅不作具體生化試驗的規(guī)定增加鑒定方法適應(yīng)微生物分類變化要求增加控制菌檢查項2025/2/1181海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（8）-控制菌檢查法⑵修訂的檢查法大腸埃希菌檢查法、銅綠假單胞菌檢查法、沙門菌檢查法、金黃色葡萄球菌檢查法。新增的檢查法大腸菌群檢查法、梭菌檢查法檢查法。2025/2/1182海南講課無菌檢查法增、修訂內(nèi)容（7）-控制菌檢查⑶供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗證的方法進(jìn)行，增菌培養(yǎng)基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。2025/2/1183海南講課無菌檢查法

大腸埃希菌檢查

供試品→供試液

↓

不少于100ml的膽鹽乳糖增菌液

↓35~37℃18~24h

取

0.2ml

↓5mlMUG培養(yǎng)基中

↓35~37℃5、24h366nm紫外光下觀察

↓加靛基質(zhì)試劑

┌────────────┐MUG陽性，靛基質(zhì)陽性MUG陰性，靛基質(zhì)陽性MUG陰性，靛基質(zhì)陰性MUG陽性，靛基質(zhì)陰性↓

↓取膽鹽乳糖培養(yǎng)液劃線報告曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板

↓36±1℃18~24h

┌────────────┐

陽性

陰性

↓

↓鏡檢、適宜的生化試驗

報告↓

報告海南講課無菌檢查法

銅綠假單胞菌檢驗

供試品

↓

供試液

↓

不少于100ml的BL增菌液↓35~37℃18~24h溴代十六烷三甲胺平板↓35~37℃18~24h營養(yǎng)瓊脂斜面↓35~37℃18~24h氧化酶、革蘭染色鏡檢┌────────────┐

氧化酶陰性

氧化酶陽性非革蘭陰性無芽孢桿菌革蘭陰性無芽孢桿菌

↓

↓報告綠膿菌素

┌────────────┐

綠膿菌素陽性

綠膿菌素陰性

↓

↓報告適宜的生化試驗

↓報告2025/2/1185海南講課無菌檢查法沙門菌檢驗

供試品10g/ml

↓

不少于200ml的營養(yǎng)肉湯↓35~37℃18~24h

四硫磺酸鹽增菌液10ml

↓35~37℃18~24h

DHL,EMB,MacC

↓35~37℃18~24h

┌────────────┐無典型菌落三糖鐵瓊脂（TSI)

↓↓35~37℃18~24h

報告┌────────┐

斜面未見紅色（黃色）其他底層未見黃色（黑色）

↓↓報告血清凝集、適宜的生化試驗2025/2/1186海南講課無菌檢查法大腸菌群檢查程序

供試液

↓

10ml膽鹽乳糖發(fā)酵管

↓35~37℃18~24h

┌────────────┐

不產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣產(chǎn)酸、產(chǎn)氣

↓

↓大腸菌群陰性

曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板

↓或麥康凱瓊脂平板報告↓35~37℃18~24h

┌────────────┐

無典型菌落革蘭陰性無芽孢桿菌

↓

↓

報告

乳糖發(fā)酵管

↓

35~37℃18~24h