神經(jīng)生物學(xué)研究方法

神經(jīng)生物學(xué)研究方法體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體外實(shí)驗(yàn)活：培養(yǎng)、干預(yù)、觀察、分析死：檢測(cè)、分析活：培養(yǎng)、干預(yù)、觀察、分析死：檢測(cè)、分析3解剖和組織形態(tài)學(xué)研究方法4常規(guī)普通染色：確定神經(jīng)核團(tuán)和神經(jīng)細(xì)胞類型5HRP束路追蹤法：確定神經(jīng)對(duì)靶組織的支配通路激光共聚焦：確定蛋白在神經(jīng)中的表達(dá)方式7原位雜交：確定mRNA的表達(dá)模式9電鏡：觀察細(xì)微結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞機(jī)構(gòu)雙光子顯微鏡：觀察活細(xì)胞雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。因?yàn)殡p光子激發(fā)需要很高的光子密度，所以為了不損傷細(xì)胞。1）腦立體定位活體注射2）活體電轉(zhuǎn)染（腦泡、神經(jīng)管）3）基因修飾小鼠

3.1基因突變（mutation）

3.2基因敲除（Knock-out）

3.3基因抑制（Knock-down）

3.4轉(zhuǎn)基因（Over-expression）

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)1）腦立體定位活體注射：藥物電損毀質(zhì)粒DNARNA病毒載體確定對(duì)功能基因干預(yù)是否成功檢測(cè)1.行為變化2.生理指標(biāo)變化3.其它基因表達(dá)變化4.電活動(dòng)變化RNAi-mediatedsilencingofestrogenreceptorαintheventromedialnucleusofhypothalamusabolishesfemalesexualbehaviorsPNAS2006行為學(xué)結(jié)果：Silencingofestrogenreceptorαintheventromedialnucleusofhypothalamusleadstometabolicsyndrome

PNAS20072）活體電轉(zhuǎn)染（腦泡、神經(jīng)管）１、雞蛋開(kāi)殼暴露雞胚。２、圖中黑線所示為神經(jīng)管所在位置。３、向神經(jīng)管中注入質(zhì)粒DNA。雞胚神經(jīng)管電轉(zhuǎn)染示意圖+-4、45V電壓，5次電擊。5、封口，37℃培養(yǎng)24h，取胚進(jìn)行觀察。3）基因修飾動(dòng)物：3.1基因突變（mutation）：自發(fā)突變和誘發(fā)突變3.2基因敲除（Knock-out）3.3基因抑制（Knock-down）3.4轉(zhuǎn)基因（Over-expression）Morpholino

Inmolecularbiology,aMorpholinoisamoleculeusedtomodifygeneexpression.Morpholino

oligomers(oligos)areanantisensetechnologyusedtoblockaccessofothermoleculestospecificsequenceswithinnucleicacid.Morpholinosblocksmall(~25base)regionsofthebase-pairingsurfacesofribonucleicacid(RNA).

DevelopmentalbiologistsinjectMorpholino

oligosintoeggsorembryosofzebrafish,[9]Africanclawedfrog(Xenopus),[10]

seaurchin,[11]andkillifish(F.heteroclitus)producingmorphantembryos,orelectroporate

Morpholinosintochick[12]embryosatlaterstagesofdevelopment3.1基因突變（mutation）：自發(fā)突變和誘發(fā)突變3.2基因敲除（Knock-out）CRISP-CAS9技術(shù)張峰是愛(ài)迪塔斯醫(yī)藥公司的創(chuàng)始人之一，該公司打算利用CRISPR基因編輯技術(shù)治療疾病。張峰:劍橋市麻省理工學(xué)院麥戈文腦研究學(xué)院神經(jīng)學(xué)家4300萬(wàn)美元的風(fēng)險(xiǎn)投資愛(ài)迪塔斯醫(yī)藥公司的贊助人之一、風(fēng)險(xiǎn)投資人KevinBitterman表示：“這是一個(gè)平臺(tái)，可以對(duì)各種家族遺傳病產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響?！盋RISPR/CassystemClustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats(CRISPR)-CRISPR-associated(Cas)systemsprovideadaptiveimmunityagainstforeignnucleicacids(virusesandplasmidsDNA/RNA)inbacteriaandarchaea.ThreeclassesofCRISPRsystemsTypeI,IIandIII.TypeIICRISPRsystem,whichutilizesasingleeffectorenzyme,Cas9,tocleavedsDNA,whereasTypeIandTypeIIIsystemsrequiremultipledistincteffectorsactingasacomplex.Makarova,K.S.,D.H.Haft,etal.(2011).NatRevMicrobiol.CRISPR/Cas9Thesilencingofinvadingnucleicacidsisexecutedbyribonucleoproteincomplexespreloadedwithsmall,interferingCRISPRRNAs(crRNAs)thatactasguidesfortargetinganddegradationofforeignnucleicacid.Mali,P.,L.Yang,etal.(03January2013).Science.Hwang,W.Y.,Y.Fu,etal.(10January2013).NatureBiotechnology.Jinek,M.,A.East,etal.(29January2013).elife.CRISPR/Cas9Jinek,M.,K.Chylinski,etal.(17AUGUST2012)Science.CRISPR/Cas9proceedingLeCong,etal.(03January2013).Science.LeCong,F.A.R.,DavidCox,ShuailiangLin,RobertBarretto,NaomiHabib,PatrickD.Hsu,XuebingWu,WenyanJiang,LucianoA.Marraffini,FengZhang(2013).MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science339,819–823.主要工作：CRISPR系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)用載體的建立CRISPR系統(tǒng)crRNA的結(jié)構(gòu)篩選利用CRISPR系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)外源DNA片段重組利用CRISPR系統(tǒng)進(jìn)行基因組片段刪除CRISPR/Cas9proceedingSchematicofthetypeIICRISPR-mediatedDNAdouble-strandbreakLeCong,etal.(03January2013).Science.CRISPR/Cas9proceedingLeCong,etal.(03January2013).Science.CRISPR/Cas9proceedingSingle-andDouble-GeneTargetingInVivobyInjectionintoFertilizedEggsWang,H.,H.Yang,etal.(9May2013).Cell.顯微注射Site-specificrecombinase:Cre

recombinasesystemCre-loxp

系統(tǒng)：用于定點(diǎn)基因敲除Onlyhippocampal

neuronesexpresstheCregene

舉例：Sitespecificgeneknockout時(shí)間特異性轉(zhuǎn)基因技術(shù)：四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)強(qiáng)力霉素Turnonsystem強(qiáng)力霉素Turnoffsystem返回3.3基因抑制（Knock-down）獲得Knock-down轉(zhuǎn)基因小/大鼠：（1）常規(guī)的雄原核顯微注射方法3.4轉(zhuǎn)基因（Over-expression）組織特異性轉(zhuǎn)基因技術(shù):

（1）組織特異性啟動(dòng)子

PNAS2005雞胚HSYNpromoter體外實(shí)驗(yàn)

組織培養(yǎng)：下丘腦、垂體、海馬、活體腦切片培養(yǎng)等（胚胎、成年）細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞基因功能細(xì)胞通路膜片鉗細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞系永生化細(xì)胞：P19一、組織培養(yǎng)：下丘腦、垂體、海馬、活體腦切片培養(yǎng)等（胚胎、成年）Brainslicecultures

Bothfiguresshowssliceculturesofthecerebellum.Leftpicture:Thetypicalcytoarchitectonicorganizationofthecerebellarcortexismaintained,anditispossibletonicelydistinguishthemolecularlayer(ML)withthePurkinjecelldendrites(red),thePurkinjecelllayer(PCL)withthePurkinjecellbodies(red)andthegranulecelllayer(GCL)withthegranulecells.(green).Rightpicture:Besidesthedendritic

arbours,alsotheaxonalprojectionofthePurkinjecellsispresentintheslicecultures.細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.磷酸鈣沉淀法2.電穿孔法

3.機(jī)械法

動(dòng)物細(xì)胞：顯微注射4.陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑

神經(jīng)生物學(xué)研究新技術(shù)光遺傳學(xué)

Optogenetics

用光照射整合在細(xì)胞中的光敏蛋白，可以非侵入性的改變細(xì)胞行為。光遺傳學(xué)技術(shù)在神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域特別受歡迎，研究者們用這一技術(shù)來(lái)激活或抑制神經(jīng)元的活性，實(shí)現(xiàn)精確的時(shí)間和空間控制。光遺傳學(xué)工具既可以用于體外也可以用于體內(nèi)，有助于探索神經(jīng)元功能、神經(jīng)元興奮性、突觸傳遞等問(wèn)題。此外，光敏工具也可以用來(lái)二聚化蛋白或者激活轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)有光敏蛋白的不斷改進(jìn)和新光敏蛋白的發(fā)現(xiàn)，正