義翹講堂《免疫組化（IHC）實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹及IHC抗體開發(fā)案例分享》

IHC結(jié)果分析、疑難解析，分享IHC抗體篩選策略李天月北京義翹神州科技股份有限公司免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)全攻略CONTENTIHC技術(shù)流程與結(jié)果分析1義翹神州IHC常見問(wèn)題及解決方法2IHC抗體開發(fā)案例分享3IHC技術(shù)流程與結(jié)果分析01義翹神州免疫組織化學(xué)（IHC），是應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)酶標(biāo)抗體與底物反應(yīng)顯色，從而對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究。IHC染色原理義翹神州組織取樣固定脫水包埋切片樣本切片制備切片免疫染色CellAntigenPrimaryAntibodyConjugatedSecondaryAntibody底物有色產(chǎn)物IHC技術(shù)流程15脫蠟水化抗原修復(fù)滅活過(guò)氧化物酶24678封閉一抗孵育二抗孵育顯色10111293義翹神州Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)：/IHC染色結(jié)果分析SinoBiological官網(wǎng)：/抗原信息抗體信息表達(dá)定位表達(dá)強(qiáng)度計(jì)量方法文獻(xiàn)：/人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)：/義翹神州IHC染色結(jié)果分析抗原信息抗體信息表達(dá)定位表達(dá)強(qiáng)度計(jì)量方法義翹神州Ki67/MKI67Antibody,MouseMAbCat#:100130-MM19IHCstainingofhumanKI-67in

humanlungcancerwithmousemAb(1:60,formalin-fixedparaffinembeddedsections).IHCstainingofhumanKI-67in

humanbreastcarcinomawithmousemAb(1:60,formalin-fixe

dparaffinembeddedsections).IHCstainingofhumanKI-67in

humanesophagealcarcinomawithmousemAb(1:60,formalin-fixe

dparaffinembeddedsections).義翹神州IHC染色結(jié)果分析MembranoushumanbreastcarcinomaAnti-Her2/ERBB2Antibody,MouseMonoclonal(Cat:

10004-MM40)NuclearhumantonsilAnti-Ki67/MKI67Antibody,MouseMonoclonal(Cat:

100130-MM19)CytoplasmhumanliverAnti-P4HBAntibody,RabbitPolyclonal(Cat:

310904-T42)CytoplasmandnucleushumanmalignantmelanomaRecombinantAnti-S100BAntibody,RabbitMonoclonal(Cat:

100508-R034)CytoplasmandmembranehumancolonRecombinantAnti-CES3Antibody,RabbitMonoclonal(Cat:

11129-R033)IHC染色結(jié)果分析抗原信息抗體信息表達(dá)定位表達(dá)強(qiáng)度計(jì)量方法義翹神州淡黃色+棕黃色++棕黑色+++IHC染色結(jié)果分析抗原信息抗體信息表達(dá)定位表達(dá)強(qiáng)度計(jì)量方法義翹神州

陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量染色強(qiáng)度弱陽(yáng)性，1分（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%）中等陽(yáng)性，2分（25%＜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜49%）強(qiáng)陽(yáng)性，3分（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%）弱陽(yáng)性（+）1分2（陰性）3（陰性）4（陽(yáng)性）中等陽(yáng)性（++）2分3（陰性）4（陽(yáng)性）5（強(qiáng)陽(yáng)性）強(qiáng)陽(yáng)性（+++）3分4（陽(yáng)性）5（強(qiáng)陽(yáng)性）6（強(qiáng)陽(yáng)性）IHC染色結(jié)果分析抗原信息抗體信息表達(dá)定位表達(dá)強(qiáng)度計(jì)量方法義翹神州ImageJ1FIJI圖片來(lái)自NewDiscoveryIHC常見問(wèn)題及解決方法02義翹神州高背景非特異染色無(wú)染色義翹神州抗體工作濃度過(guò)高抗體本身質(zhì)量問(wèn)題抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或孵育溫度過(guò)高封閉不完全抗原修復(fù)方式不合適二抗發(fā)生非特異結(jié)合洗滌次數(shù)不足DAB顯色時(shí)間太長(zhǎng)，顯色濃度過(guò)高抗體工作濃度低，孵育時(shí)間短一抗和二抗是否匹配抗體保存不當(dāng)（反復(fù)凍融）檢測(cè)組織中不存在目的蛋白組織中目標(biāo)蛋白豐度不夠稀釋液和洗液的配制是否有誤更換抗原修復(fù)方法抗體工作濃度過(guò)高抗體本身特異性不佳內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性二抗發(fā)生非特異結(jié)合一抗的種屬來(lái)源與組織樣本的種屬相同（例如，用小鼠一抗測(cè)試小鼠組織）切片干片組織內(nèi)部壞死區(qū)域高背景非特異染色無(wú)染色邊緣效應(yīng)染料斑點(diǎn)加液量充足保持切片濕潤(rùn)，避免干片DAB顯色劑是否過(guò)期二抗是否過(guò)期，是否有聚集氣泡假象染色不均勻輕柔混勻滴加液體，避免氣泡產(chǎn)生檢查臺(tái)面是否傾斜避免直接從熱的修復(fù)液取出義翹神州IHC抗體開發(fā)案例分享03義翹神州義翹神州雜交瘤技術(shù)噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)單B細(xì)胞分選技術(shù)高效的抗體開發(fā)技術(shù)平臺(tái)：經(jīng)典技術(shù)優(yōu)化：電融合，建庫(kù)技術(shù)新技術(shù)：?jiǎn)蝹€(gè)B細(xì)胞技術(shù)，更快的速度多種篩選方案組合高效的重組抗體表達(dá)高質(zhì)量的候選抗體庫(kù)：數(shù)百-數(shù)千個(gè)候選抗體親和力達(dá)到nM-pM水平不同的抗原結(jié)合表位適用于不同應(yīng)用場(chǎng)景Beacon?技術(shù)

四大單克隆抗體制備技術(shù)抗原設(shè)計(jì)表位差異性構(gòu)象正確性抗原易獲得性1免疫方案高滴度免疫效價(jià)多表位免疫反應(yīng)識(shí)別功能位點(diǎn)2抗體篩選多樣化篩選平臺(tái)快速精準(zhǔn)篩選鑒別多功能抗體3表達(dá)生產(chǎn)減少外源污染高產(chǎn)能（≥mg級(jí)）高通量4質(zhì)控驗(yàn)證理化檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)生物安全檢測(cè)……5抗體平臺(tái)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)義翹神州佐劑：弗氏佐劑、鋁佐劑、MF59、QS21Titermax、Mn、MPL免疫途徑：皮內(nèi)、皮下、腹腔、靜脈、淋巴結(jié)、脾內(nèi)免疫周期：常規(guī)（7~12周）、快速（3周、5周）免疫劑量：小鼠10~100μg/只次；兔100~500μg/只次……根據(jù)最終需求選擇合適的免疫原、佐劑、免疫方式動(dòng)物免疫效價(jià)檢測(cè)篩選方式ELISA效價(jià)檢測(cè)為主，輔助IHC檢測(cè)多樣化抗體篩選平臺(tái)，關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行IHC功能介入篩選IHC指定功能的抗體開發(fā)功能需求為導(dǎo)向，盡早開展應(yīng)用特異性篩選義翹神州案例一：MKI67(Cat:

100130-MM19)抗體篩選鼠上清首篩介入鼠上清亞克隆介入單抗小樣初篩單抗小樣多組織復(fù)篩安排大樣生產(chǎn)鼠血清介入單抗大樣多組織復(fù)篩單抗大樣初篩靈敏度驗(yàn)證特異性驗(yàn)證穩(wěn)定性驗(yàn)證其他驗(yàn)證IVD原料級(jí)別義翹神州案例一：MKI67(Cat:

100130-MM19)抗體篩選操作流程：多肽免疫5只小鼠，免疫血清進(jìn)行ELISA效價(jià)檢測(cè)和IHC篩選（2個(gè)陽(yáng)性組織、1個(gè)陰性組織）挑選ELISA及IHC均合格的1只小鼠融合主克隆階段，ELISA&IHC（雙組織）-->200株結(jié)合陽(yáng)性，首批73株IHC檢測(cè)；挑選12株合格克隆進(jìn)行穩(wěn)定株篩選2~3次有限稀釋，ELISA&IHC（多組織）--獲得11株ELISA與IHC合格抗體；挑選最優(yōu)的6株克隆放大生產(chǎn)及抗體純化抗體質(zhì)控--1株抗體IHC多組織驗(yàn)證陽(yáng)性，可作為診斷原料；3株抗體滿足科研試劑要求Control37℃1week37℃2week0.1μg/mL1μg/mL5μg/mL抗體靈敏度驗(yàn)證抗體特異性驗(yàn)證加速穩(wěn)定性驗(yàn)證抗體經(jīng)多方面驗(yàn)證合格，滿足診斷原料需求案例二：Claudin18抗體(Cat:

109916-R179)靶點(diǎn)抗體篩選胃癌1胃癌2胃癌3胃癌4胃癌5胃癌6胃癌7胃癌8胰腺癌1胰腺癌2胃癌1胃癌2胃癌3胃癌4胃癌5胃癌6胃癌7胃癌8胰腺癌1胰腺癌2市售診斷抗體

（3μg/mL）Sinobiological（1μg/mL）義翹神州Claudin18抗體正常組織的表達(dá)情況扁桃體膽囊肝睪丸肌肉甲狀腺結(jié)腸闌尾淋巴結(jié)腦皮膚脾氣管前列腺乳腺腎腎上腺食管胎盤小腸心胸腺胰腺支氣管直腸義翹神州IHC應(yīng)用抗體共4421株SpeciesQtyHuman3861Mouse399Rat94Rhesus22Cynomolgus15SARS23AntibodyTypeQtyRabbitPAb3880RabbitMAb306MouseMAb230ChimeraMAb5ProductnameCatalogNumberDescriptionIsotypeCD2011007-MM06MouseMAbMouseIgG1CD2110811-MM28MouseMAbMouseIgG1CD3CT026-R301RabbitMAbRabbitIgGCD3410103-MM17MouseMAbMouseIgG1CD6811192-R179RabbitMAbRabbitIgGCD79a100128-R001RabbitMAbRabbitIgGKi-67100130-MM19MouseMAbMouseIgG1LCA100342-R145RabbitMAbRabbitIgGMSH6100973-R035RabbitMAbRabbitIgGMSLN13128-MM01MouseMAbMouseIgG1p5390001-R002RabbitMAbRabbitIgGp63100266-R143RabbitMAbRabbitIgGPD-110377-MM23MouseMAbMouseIgG1S100100508-R034RabbitMAbRabbitIgG100508-MM03MouseMAbMouseIgG1Vimentin100254-R001RabbitMAbRabbitIgG義翹神州義翹神州“一站式”試劑與技術(shù)服務(wù)蛋白表達(dá)和純化服務(wù)多種重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)基因合成密碼子優(yōu)化載體構(gòu)建蛋白表達(dá)純化抗體表達(dá)和純化服務(wù)單克隆抗體多克隆抗體磷酸化抗體抗獨(dú)特型（Anti-idiotype）抗體嵌合抗體WB/IHC保證型抗體制備ELISA試劑盒開發(fā)……生物分析檢測(cè)服務(wù)SPR/BLI分子互作檢測(cè)FcRn結(jié)合檢測(cè)服務(wù)SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike假病毒中和檢測(cè)體外活性檢測(cè)技術(shù)服務(wù)生物安全檢測(cè)服務(wù)CMA&CNAS認(rèn)證的病毒清除工藝驗(yàn)證服務(wù)雙C認(rèn)證的細(xì)胞庫(kù)檢測(cè)服務(wù)免疫學(xué)檢測(cè)服務(wù)WesternBlot檢測(cè)服務(wù)流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)服務(wù)ELISA/ELISpot檢測(cè)技術(shù)服務(wù)IHC/IF檢測(cè)技術(shù)服務(wù)IP/Co-IP技術(shù)服務(wù)堅(jiān)持自主研發(fā)生產(chǎn)打造中國(guó)生命科學(xué)研究“一站式”試劑與服務(wù)支撐平臺(tái)人才與設(shè)施榮譽(yù)資質(zhì)設(shè)施：

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