甘薯莖腐病菌檢疫鑒定方法

1甘薯莖腐病菌檢疫鑒定方法綱（Gammaproteobacteria）、腸桿菌目（Enterobacterales狄克氏菌屬（Dickeya）、達(dá)旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)。革蘭氏陰性細(xì)菌，菌體短桿注：癥狀特征見附錄A。4縮略語CFU：菌落形成單位（Colony-FormingCTAB：溴代十六烷基三甲胺（CetyltrimethyDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacidNTP：脫氧核苷三磷酸（DeoxyribHR：過敏性反應(yīng)(HypersensitiveReactioionization-timeoffligNA：營養(yǎng)瓊脂（NutrientAgar）NGM：營養(yǎng)瓊脂甘油培養(yǎng)基（NutrientAgarPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerasechainreactRT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReversetranscriptionpolymTaq：水生噬熱桿菌（Thermusaquati2根據(jù)甘薯莖腐病的菌落形態(tài)特征、田間危害癥狀特征、分子生物學(xué)PCR或RT-PCR反應(yīng)特征、蛋白質(zhì)7.18MALDI質(zhì)譜儀：需具有細(xì)菌鑒定分析39癥狀觀察對(duì)于植株樣品，參見附錄A中的癥狀描述觀察有無甘薯莖腐病典型癥狀，對(duì)出現(xiàn)典型癥狀或可疑癥培養(yǎng)2d～3d，獲得單菌落。4樣品DNA的提取可按CTAB方法，也可使用商品化的DNA提取試劑盒提取。提取的核酸用于PCR檢測(cè)或?qū)τ谟邪Y樣品，以標(biāo)準(zhǔn)菌株做陽性對(duì)照，健康植物組織做陰性對(duì)照，雙蒸水作為空白對(duì)照進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體檢測(cè)步驟和判定標(biāo)準(zhǔn)按附錄C執(zhí)行。單菌落可制成菌懸液直接進(jìn)行P對(duì)照為無菌水接種，保濕1d，25℃~30℃,12h/12h生長。接種2d～4d后觀察接種位置現(xiàn)癥狀。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病處組織再分離病菌，對(duì)于有癥狀樣品，PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性，即判定為檢出甘薯莖腐病菌；無癥狀樣品或新發(fā)生區(qū)的有癥狀樣品，PCR檢測(cè)結(jié)果陽性，且分離到病菌，參考致病性測(cè)試結(jié)果，判定檢出甘薯莖腐病菌。其中，PCR檢測(cè)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，選擇本標(biāo)準(zhǔn)10.2.2或10.2.3的一種進(jìn)行檢測(cè)，任意一種檢測(cè)方法的結(jié)果為陽性則判定為PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性。分離的疑似甘薯莖腐病菌單菌落鑒定可選用本標(biāo)準(zhǔn)10.2.2或10.2.3或薯莖腐病菌D.dadantii。5送樣人聯(lián)系方式和聯(lián)系地址、檢測(cè)時(shí)間、地點(diǎn)、方法和鑒定者。疑似癥狀等應(yīng)及時(shí)拍照保存，PCR檢測(cè)6A.1癥狀出現(xiàn)黑褐色斑，見圖A.1。早期發(fā)病全株枯死。中后期發(fā)病，在病斑部位上端的藤蔓有不定根深入土中發(fā)病斑一般以芽眼為中心圓形，稍凹陷，黑褐色，后逐A.2病原菌形態(tài)及培養(yǎng)性狀煙草上激發(fā)過敏性反應(yīng)（HR），見圖A.3。病原菌在NA平板上28℃培養(yǎng)2d后，菌落淡土黃色、不透明、邊緣不整齊、表面凸起稍皺縮，直徑2mm～3mm，見圖A.4的左圖。在NGM平板上28℃培養(yǎng)2d后，菌落呈煎雞蛋狀，邊緣不整齊，表面略凸起，產(chǎn)生靛藍(lán)，直徑2mm～3mm，見圖A.478A.3接種癥狀分離物108CFU/mL菌懸液針刺接種甘薯藤蔓進(jìn)行致病性測(cè)試。對(duì)照為無菌水接種，保濕1d，25℃~30℃生長。接種2d～4d后觀察接種位置附近是否出現(xiàn)癥狀，見圖A.5。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)9B.2.1營養(yǎng)瓊脂（BectonDickinsonandCo），72℃延伸5min。反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)不同儀器的要求作適當(dāng)調(diào)整。在NA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24h挑取單菌落，直接涂抹到質(zhì)