分子醫(yī)學(xué)實驗 實驗一 DMD基因突變檢測學(xué)習(xí)課件

教師:俞萍Email:pingyu@電話:88208259整體實驗安排實驗一進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥（DMD）基因檢測實驗二人類外周血染色體標(biāo)本制備實驗三遺傳病基因突變分析（SSCP）實驗四人類染色體Ｇ帶標(biāo)本制備及觀察實驗五人類染色體核型分析1.進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥（DMD）基因檢測2.人類外周血染色體標(biāo)本制備3.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,

PCR）加樣（實驗三）第一次實驗內(nèi)容實驗一進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥（DMD）基因檢測進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥（Duchennemusculardystrophy，DMD）是肌肉組織的遺傳病，特點是進(jìn)行性加重的肌肉萎縮和無力。本病呈X連鎖隱性遺傳，一般男性兒童發(fā)病。GeneticsofDMDOMIM#310200occurringinabout1in3500males,X-linkedrecessive,lethalinmales,1/3ofpatientsarenewmutants;2/3havecarriermothers,GenelocationXp21,largegene(morethan2000kb),79exons.Highmutationrate,60%to65%ofthemutationsaredeletions,andabout6%areduplications,Allelicmutationsinthesamegenecauseamilderdisorder,Beckermusculardystrophy.DuchenneMuscularDystrophy,DMD

DMD基因定位于Xq21.2-21.3之間，79個外顯子組成，編碼3685個氨基酸、分子量為427kD的蛋白質(zhì)一抗肌營養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)，這種蛋白具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)的功能。DMD突變可以導(dǎo)致兩種肌營養(yǎng)不良

DMD,(Duchennemusculardystrophy)

缺失或重復(fù)引起讀框改變（frameshift），導(dǎo)致無蛋白表達(dá)或表達(dá)無功能的蛋白，癥狀嚴(yán)重。

BMD,Becker’smusculardystrophy

缺失或重復(fù)不引起讀框改變，產(chǎn)生有部分功能的蛋白質(zhì)，癥狀輕?？辜I養(yǎng)不良蛋白的編碼基因有多種突變形式，60％是外顯子缺失突變，通常選擇DMD基因中9個缺失熱點的外顯子擴增，可檢出缺失突變中的90%。本實驗設(shè)計為擴增DMD基因中4個外顯子，其中外顯子45和48在中國患者中的檢出率分別為26%和48%。多重PCR（MultiplexPCR）檢測DMD外顯子缺失在一個反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增不同的靶DNA片段。

DMD基因4個外顯子的引物順序：外顯子PCR產(chǎn)物大小

引物F引物R8360gtcctttacacactttacctgttgag

ggcctcattctcatgttctaattag19459ttctaccacatcccattttcttcca

gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc45547aaacatggaacatccttgtggggac

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48506ttgaatacattggttaaatcccaacatg

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聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是一種體外由引物介導(dǎo)的特定DNA序列的酶擴增方法，由于此方法對樣本要求的微量性以及它特異、敏感、高速的特性，近年來得到廣泛應(yīng)用。全過程是基于一套“三步曲”的若干輪次的循環(huán)組合而成的。依次為DNA模板熱變性，雙鏈DNA解鏈成單鏈；在低溫下與引物退火，引物與單鏈DNA互補配對；在適宜溫度下TaqDNA聚合酶催化引物延伸。以上三步為一個循環(huán)，循環(huán)25-35次，模板DNA可擴增100萬倍左右，整個反應(yīng)可在2到3小時內(nèi)完成。PCR操作如下：

每一個薄壁離心管中加入試劑的量為：（反應(yīng)總體積為25

l）：

雙蒸水17.8

l10XBuffer2.5

lMgCl22

l

dNTPs0.5

lPrimerR+F(混合)1.4

lDNA模板0.5

l

Taq-DNA聚合酶0.3

l

石蠟油1滴

放置在PCR循環(huán)儀上，循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：

Step1(1個循環(huán))94

C5分鐘

Step2(30個循環(huán))94

C30秒

56

C30秒72

C30秒

Step3(1個循環(huán))72

C7分鐘瓊脂糖凝膠電泳:①

配制2%的瓊脂糖凝膠配制1×TBE電泳緩沖液70ml于三角燒瓶中，稱取1.4克的瓊脂糖粉放入后，微波爐加熱熔化,冷卻至60℃，加入溴乙錠(EB)，倒入電泳槽中，插入梳子，待凝固。②

向電泳槽中倒入1×TBE，沒過膠面2mm，小心移去梳子。③

取PCR擴增樣品15

l加入3

l的6×載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi)。④接通電源，一般紅色為正，極黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(靠近加樣孔的一端為負(fù))。140V，電泳2小時左右。⑤卸下凝膠，于紫外儀上觀察電泳條帶，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)PUC19/MspⅠ(marker)比較。注意事項：1、引物設(shè)計時長度15～30個堿基為宜，G+C含量一般為40%～60%。2、退火溫度決定PCR反應(yīng)的特異性，退火溫度高PCR反應(yīng)的特異性好；溫度低，有時會有非特異性條帶。3、Mg