實(shí)驗(yàn)二 電泳課件

實(shí)驗(yàn)二電泳

蘭州大學(xué)生命學(xué)院沈喜2012.5第二部分免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)二電泳一、實(shí)驗(yàn)原理

人類免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同，分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中IgG占血清免疫球蛋白總量的70%～75%。

大多數(shù)抗菌性、抗毒性和抗病毒抗體屬于IgG，它在抗感染中是主力軍?；甲儜B(tài)反應(yīng)性疾病、自身免疫性疾病、各種感染以及多發(fā)性骨髓瘤等時(shí)，免疫球蛋白可異常增高。患獲得性免疫缺陷綜合征等免疫缺損病時(shí)免疫球蛋白可異常降低，臨床上常應(yīng)用免疫球蛋白制劑防治傳染病、某些腫瘤和免疫缺損病等。

實(shí)驗(yàn)二電泳

人的IgG由兩條重鏈（heavychain,H鏈）和兩條輕鏈（lightchain,L鏈）組成，H和L鏈上有可變區(qū)（variableregion,V區(qū)）和恒定區(qū)（constantregion,C區(qū)），它們之間以二硫鍵相連。在加SDS的電泳條件下，分子中的二硫鍵被還原成游離的巰基，四條鏈分開，重鏈遷移速度較慢，輕鏈遷移速度較快，可跑出兩條帶。實(shí)驗(yàn)二電泳特異性抗體檢測(cè)相應(yīng)抗原條帶

酶標(biāo)二抗第一抗體被測(cè)抗原封閉物

電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，不同的幾何形狀代表不同種類的蛋白質(zhì)。一抗(兔抗人IgG

)識(shí)別人IgG重鏈并與其結(jié)合，再用過氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG

)與一抗結(jié)合，最后加入過氧化物酶的底物，酶催化底物產(chǎn)生有色、不溶性的產(chǎn)物，沉積在人IgG的重鏈帶上。根據(jù)顏色的深淺和面積，可以估計(jì)被測(cè)蛋白的量。實(shí)驗(yàn)二電泳信號(hào)放大作用間接檢測(cè)法：

二級(jí)抗體可測(cè)定多種多樣的一級(jí)抗體從而避免了逐一標(biāo)記一級(jí)抗體;

一抗通常能與幾個(gè)二抗分子結(jié)合，從而起了信號(hào)放大的作用。Western印跡法檢測(cè)蛋白的敏感性為1-5ng。缺點(diǎn)：是一抗可能會(huì)與二抗發(fā)生交叉反應(yīng)，產(chǎn)生非特異性條帶；檢測(cè)過程增加了額外的溫育步驟。實(shí)驗(yàn)二電泳二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出IgG重鏈的分子量檢測(cè)人體患病狀態(tài)下IgG蛋白含量的差異實(shí)驗(yàn)二電泳兩個(gè)膠條分別處理寬膠條考馬斯亮藍(lán)R250染色窄膠條轉(zhuǎn)印后免疫染色人血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白人血清

三、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)二電泳染色、脫色

將寬膠條放到培養(yǎng)皿中，用蒸餾水清洗后，加入約10ml考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色1小時(shí)左右，然后換成脫色液脫色，不時(shí)搖動(dòng)。更換幾次脫色液，至背景無色透明，條帶清晰為止。實(shí)驗(yàn)二電泳

制備“轉(zhuǎn)移三明治”1.切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素膜，用轉(zhuǎn)移緩沖液或水浸泡5min使之濕潤(rùn)。2.準(zhǔn)備2張濾紙和海綿一起浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。3.打開轉(zhuǎn)移槽的膠板，依次放入：

a.一張浸濕的海綿。

b.一張浸濕的濾紙。

c.用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗過的膠，并小心地趕走濾紙和膠之間的氣泡。

d.硝酸纖維素膜，在膜的右下角剪一小角，以標(biāo)明電泳方向。

e.一張浸濕的濾紙。

f.一張浸濕的海綿。實(shí)驗(yàn)二電泳轉(zhuǎn)移電泳槽的夾板實(shí)驗(yàn)二電泳轉(zhuǎn)移.

小心地合上膠板，按膠側(cè)為負(fù)極，膜側(cè)為正極的方向放入轉(zhuǎn)移電泳槽中，加轉(zhuǎn)移緩沖液至滿。實(shí)驗(yàn)二電泳轉(zhuǎn)移電泳裝置

插好電極，打開電泳儀開關(guān)調(diào)至穩(wěn)壓60V，電泳1h，轉(zhuǎn)移結(jié)束后打開膠板取出硝酸纖維素薄膜。目標(biāo)蛋白質(zhì)越大，時(shí)間越長(zhǎng)

實(shí)驗(yàn)二電泳膜的酶聯(lián)免疫染色1、封閉：用TBS緩沖液洗膜1min后，將膜封入塑料薄膜袋內(nèi)，留一開口。加封閉液1ml(0.2ml/cm2)后封閉開口，37℃搖床上搖動(dòng)30-50min。實(shí)驗(yàn)二電泳封口機(jī)的操作加熱指示燈加熱時(shí)間調(diào)節(jié)旋鈕實(shí)驗(yàn)二電泳加封閉液及抗體2、與第一抗體結(jié)合(1)棄封閉液，加入適當(dāng)稀釋的1ml第一抗體溶液(兔抗人IgG)，封口后37℃搖床上輕輕搖動(dòng)50min。(2)取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。再封入一新的塑料薄膜袋內(nèi)。實(shí)驗(yàn)二電泳加入封閉液后的塑料袋實(shí)驗(yàn)二電泳一抗反應(yīng)二抗反應(yīng)3、與酶標(biāo)第二抗體結(jié)合(1)加入適當(dāng)稀釋的1ml辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃搖床上輕輕搖動(dòng)50min。(2)取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。實(shí)驗(yàn)二電泳

4、加底物溶液顯色

將膜浸入10ml底物溶液中，至顯色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。轉(zhuǎn)入水中保存。實(shí)驗(yàn)二電泳

四、結(jié)果分析

在凝膠成像分析系統(tǒng)上照相，并分析結(jié)果。測(cè)量分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移距離，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測(cè)出硝酸纖維素膜上的人IgG條帶的遷移距離，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出人IgG重鏈的分子量。實(shí)驗(yàn)二電泳凝膠成像分析系統(tǒng)

實(shí)驗(yàn)二電泳四、需配制的試劑1、TBS（Tris-HCl,NaCl）緩沖液：20mmol/LTris-HCl,500mmol/LNaCl，pH7.5，每組配200ml。2、TTBS：取100mlTBS，加250μl20%Tween-20。3、封閉液及抗體稀釋液：1％脫脂奶粉-TBS，每組配10ml。4、底物溶液：2.5mg二氨基聯(lián)苯胺（DAB）+10mlTBS+

10μlH2O2，臨用前配制。 (由一組同學(xué)統(tǒng)一配制)6、脫色液：終濃度：乙醇30%，冰乙酸10%，余為水，配70ml5、考馬斯亮藍(lán)R250染色液：考馬斯亮藍(lán)R2500.01g，溶于20ml脫色液中。實(shí)驗(yàn)二電泳思考題1、請(qǐng)用自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出IgG重鏈的分子量。2、12%的分離