豬圓環(huán)病毒2型和3型熒光PCR檢測方法

2Ct循環(huán)閱值(cyclethreshold)DNA脫氧核糖核酸(dcoxyribonuclcieacid)dPCR數(shù)字PCR(digitalPCR)EPC外源過程質(zhì)控(externalprocesscontrob)NC陰性對照(negativecontrol)PC陽性對照(positivecontrol)PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainrenction)qPCR實時熒光PCR(real-timePCR)4儀器和設(shè)備4.1Ⅱ級生物安全柜。4.2實時熒光PCR擴(kuò)增儀。4.3高速臺式冷凍離心機(jī)(角轉(zhuǎn)子：24×1.5mL,12×15mL;13.0007/min)。4.4微量核酸蛋白測定儀。4.5微量移液器(0.5μL~10pL,2μL~20pL,20gL~200pL100μL~1000pL)。4.6組織勻漿儀。4.7高壓滅菌器。4.8數(shù)字PCR系統(tǒng)：包括微反應(yīng)體系發(fā)生器和微反應(yīng)體系熒光檢測儀。5試劑和材料5.2滅菌生理鹽水：配制應(yīng)符合A.1的要求。5.33mol/L.NaOAe溶液：配制應(yīng)符合A.2的要求。5.4磷酸鹽緩沖液(PBS:配制應(yīng)符合A.3的要求。5.5無核酸酶水：配制應(yīng)符合A.4的要求。5.6DNA提取試劑：CTAB裂解液、蛋白酶下溶液(20mg/mL)、Tris飽和酚、三氯甲烷、異丙醉、無水乙醇。5.72×PCR預(yù)混反應(yīng)液(probeqPCR)。5.8質(zhì)控物質(zhì)：陽性質(zhì)控品用符合要求或具備一定資格單位提供的含PCV2和PCV3DNA的組織樣品或質(zhì)粒(序列參考信息見附錄B中B.2~B.5);陰性質(zhì)控品為不含PCV2和PCV?的組織或血液。5.9熒光PCR擴(kuò)增管或反應(yīng)板、數(shù)字PCR微反應(yīng)體系生成聯(lián)排管及覆膜或芯片5.10無核酸酶離心管。5.11數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液。5.12引物和探針：引物探針序列見表1,擴(kuò)增序列的信息見附錄B.GARACTAAAGGTGGAACTGPCV2-qRC下游引物)PCV2-qR2(下游引物)PCV2-qP(探針)PCV2-qP2(探針)HEX-TCACGCTTCTGCATTPCV3-qFC上游引物)PCV-qF2(上游引物)PCV3-qRC下游引物)PCV3-qR2(下游引物)PCV3-qP(探針)PCV3-qP2(探針)FAM-ATGCGGAAAGTTCCACTCCKFAM-TGATTTTTATGGGTGGGTTCCATTT內(nèi)參基因ICqF(上游引物)TGATGTTACCACAAA16TTGTIC-qR(下游引物)OCTCTACATCTACCTGCTCC-qP(探針)O5-AFTCTACCTTGGGTGTAGTCTCCATGTPCV2-P(探針)FAM-AGCSAAAGGAACAGATCAGCPCV3-dF(上面引物)PCY3-dRC下游引物)PCV3-P探針)HEX-ATAAATGCTCCAAAGCAGTGCTCC-BEPCF(上游引物)C5-ACCATCGAACATCTTTGCTGTCGC100pmol/L后分裝.-20℃避光保存?zhèn)溆?。熒光通道，過程質(zhì)控基因探針Cy5熒光報告基團(tuán)根據(jù)數(shù)字PCR儀器換用其他適配基注3,R為含A和G的兼并堿基，Y為含C和4血液樣品無需特殊處理。組織樣本稱重1g加5mL(質(zhì)量體積比為115)滅菌生理鹽水或1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS.pH7.2)勻漿，勻漿后的樣品反復(fù)凍融3次備用。每個待測樣本分三等份，分別作為檢樣、復(fù)檢樣和儲存樣，樣品的制備過程應(yīng)防止交叉污染和組分改變，標(biāo)記后備用或冷凍保存。若樣品不能當(dāng)天檢測，應(yīng)先置于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫柰羞\(yùn)時應(yīng)確保冷藏或冰凍狀態(tài)運(yùn)輸。6.3樣品檢測、保存和廢棄物處理涉及病原檢測應(yīng)在Ⅱ級生物安全實驗室進(jìn)行操作，樣品保存和廢棄物處理按照GB19489要求進(jìn)行。7實時熒光PCR方法7.1設(shè)立對照分別設(shè)置陽性對照、陰性對照、空白對照。用已知含PCV2和PCV3DNA的樣品作陽性對照，用不含PCV2和PCV3DNA的血液或組織樣品作陰性對照，用等體積的超純水代替模板作為空白對照。72核酸提取7.2.1裂解消化7.2.2去除雜質(zhì)12000r/min離心15m,將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，加人等體積的三氯甲烷-異戊醇(24:1),輕輕振蕩混勻，于4℃12boQ:/min離心5min。用移液器輕輕地吸取上清液到新離心管中，加1/10體積的3mol/L.NaOAe(pH5.2),加入等體積的異丙醇輕輕混勻，可見白色絮狀DNA.4℃12000r/min離心10min后，棄上清。用1mL75%乙醇洗滌1次，干燥后溶于50μLDEPC水中。在2h內(nèi)進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增或保存于-70℃冰箱。7.3實時熒光PCR擴(kuò)增7.3.1反應(yīng)體系實時熒光PCR反應(yīng)體系見表2?？梢圆捎玫刃У纳唐坊療晒舛縋CR試劑盒。0.156山各0.625LddH?O《無菌水)不變。8式中：物質(zhì)的數(shù)字PCR檢測值乘以數(shù)字PCR反應(yīng)體系的體積后，除以數(shù)字PCR反應(yīng)體系中?！砑拥綐悠分械腅PC物質(zhì)的原始濃度，單位為拷貝每微升(copies/pL):每個反應(yīng)孔的有效微小體系總數(shù)量不低于數(shù)字PCR系統(tǒng)理論數(shù)的60%:陽性對照或陽性樣品的陽性微小體系數(shù)量低于總體系數(shù)量的80%。陰性對照組和空白對照組內(nèi)均沒有任何擴(kuò)增現(xiàn)象；EPC對照的回收率>1%.本文件數(shù)字PCR法所能達(dá)到的檢測限：PCV2為500copies/mL(血液)和750copies/g(組織);本文件數(shù)字PCR法所能達(dá)到的定量限：PUV2為1000copiPCV3為1000copies/mL(血液):1400copies/g(組織)。PCV3,檢測結(jié)果表述為“未檢出豬圓環(huán)病毒X?,X?,x——分別為3個平行組的檢測值；3個平行檢測值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤25%時，其平均值乘以數(shù)字根據(jù)公式(3)計算樣品中的病毒拷貝濃度：9(規(guī)范性)NaCl溶解混勻后121℃高壓滅菌15min。稱取40.8gNaOAc·3H?O置于200mL燒杯中，加人蒸餾水40mL攪拌溶解.唐冰醋酸調(diào)劑pH至5.2,加蒸餾水定容至100mL,1.034×103Pa高壓滅菌30min,常溫保存?zhèn)溆?。A.30.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)NaClNa?HPO,·12H?O將上述試劑溶于800mL燕餾水中，pH講筑74,定容至1000mL,1.034×10°Pa高壓滅菌DEPC混合后室溫放置過夜.121℃高壓滅菌15min,或直接購買商品化的產(chǎn)品。(資料性)FAM-ATGCCGAAAGTTCCACTOGK-FAM-TGAITITTATGGGTGGGTTOCATTT-GARACTAAAGGTGGAACTGHEX-AGGAGTACCATTCCAACGGGG-BHEXTCACGCTTCTGCAITTTCOCGCBTGATGTTACACAAATGTTGTG5A7TCTACCTTGOGTGTAGTCTOCAFAM-AGCSAAACGAACAGATCAGHEX-ATAAATGCTCCAAAGCAGFAM-ACCATCGAACATCTTTG注：實時熒光PCR方法和數(shù)字PCR方法中上，下游引物及探針的工作液使用濃度均為20p GGTGAAGTAACGGCTGTGTTTTTTTTTAGAAGTCATAACTTTACGAGTGGAACTTTC- CCATAAGGGTCGTcTTGGAGCTATAATGGGGAGGGTGCTGTTATTTTGGATGATTTTTATGGGTGGGTTCCATTTB.3實時熒光PCR擴(kuò)增的PCV2基因序列(共118bp/87bp)GAGACTAAAGGTGGAACTGTACCTTTTTTGGCCCGCAGTATTCTGATTACCAGCAATCAGACCCCGTTGGAATGGTACTCCTCAACTGCTGTCCCAGCTCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATAATGTACACGTCATTGTGGGGCCACCTGGB.4實時熒光PCR擴(kuò)增的內(nèi)參基因序列(共88bp)TGATGTTACCACAAATGTTGTCTTCTTTGTAATTCTACCTTGGGTGTAGTTTAAACTGTCTGAGCAGGTAGB.5數(shù)字PCR擴(kuò)增的PCV2基因序列(共133bp)GAAGTGGTATCTGGGTGCCCGCTGCCACATCGAGAAAGCCAAAGGAACAGATCAGCAATAAAGAATATTGCAGTAAAGAAGGCAACTTACTGATTGAGTGTGGAGCTCCTAGATCTB.6數(shù)字PCR擴(kuò)增的PCV3基因序列(共133bp)GTGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCAGTTTTTTCCGGGACATAAATGCTCCAAAGCAGTGCTCCCCATTGAACGGTGGGGTCATATGTGTTGAGCCATGGGGTGGG