（高清版）DB37∕T 2841-2016 鴨坦布蘇病毒半套式R∕T -PCR檢測(cè)方法

DB37DB37/T2841—2016鴨坦布蘇病毒半套式RT-PCR檢測(cè)方法2016-092016-09-2016-10-IDB37/T2841—2016本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：刁有祥、唐熠、陳浩、馮強(qiáng)、提金鳳。1DB37/T2841—2016鴨坦布蘇病毒半套式RT-PCR檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨坦布蘇病毒半套式RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測(cè)方法的樣品采集和保存、樣品處理、試劑及儀器、檢測(cè)步驟、結(jié)果判定等。囊液中坦布蘇病毒的核酸，也適用于鵝和其他動(dòng)物坦布蘇病毒核酸的檢測(cè)。生物安全柜、PCR儀、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、冰箱、紫外凝膠成像儀、微量移液不得倒流；電泳區(qū)與其他操作區(qū)域相互隔離。操作者應(yīng)接受過實(shí)驗(yàn)室生物安全培訓(xùn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)。熟悉防止RNA降解、核酸3.1.1商品化的RNA提取試劑盒。3.1.2rTaqDNA聚合酶(5U/μL);3.1.310×PCRBuffe3.1.55×M-MLVB3.1.6dNTPs(2.5mmol/L,10mmol/L);3.1.81.5%瓊脂糖凝膠，見A.1;3.1.10溴化乙錠(10μg/μL),見A.3;3.1.11核酸電泳加樣緩沖液，見A.4;3.1.12商品化的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，要求在100bp~2000bp之間，有5條以上的指示條帶；2DB37/T2841—20163.1.13已知的坦布蘇病毒鴨胚尿囊液制作的陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品；3.1.14用高壓滅菌的蒸餾水作為陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。反轉(zhuǎn)錄所需隨機(jī)引物檢測(cè)所需引物下游內(nèi)側(cè)引物5371R:5'-CCAAAGTTGGCYCCCATCTC-3’;下游外側(cè)引物5861R:5'-AGCACACGGCAATCTCAT-3’,擴(kuò)增片段長度為277bp。4操作程序4.1樣品的采集和處理4.1.1樣品的采集死亡鴨采集卵泡膜、脾和腦等組織樣品，進(jìn)行分別處理或同時(shí)處理；活鴨采集咽喉或泄殖腔拭子。樣品應(yīng)放在含有抗生素的pH值7.0~7.4的等滲磷酸鹽緩沖液(PBS,附錄B.1)內(nèi)(無PBS可用25%~50%甘油鹽水，見附錄B.2)?？股氐倪x擇視當(dāng)?shù)厍闆r而定，組織和咽喉拭子懸液中應(yīng)含有青霉素(2000IU/mL),鏈霉素(2mg/mL)、慶大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL),加入抗生素后pH值應(yīng)調(diào)至7.0~7.4。在室溫放置1h~2h內(nèi)樣品應(yīng)盡快處理，不能處理的可在4℃存放24h,也可于低溫條件下保存(-70℃貯存最好)。4.1.3病料的處理樣品處理在生物安全柜中進(jìn)行，咽喉或泄殖腔拭子，置于200μL含有抗生素的pH值7.0~7.4等滲磷酸鹽緩沖液中；研碎的組織用含抗生素pH值7.0~7.4的等滲PBS溶液配成10%～20%(g/mL)的懸液。樣每次檢測(cè)，用相應(yīng)的陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，至少設(shè)置一個(gè)或一個(gè)以上的陰性對(duì)照和陽按照RNA提取試劑盒說明書，提取樣品和對(duì)照的RNA。提取的RNA應(yīng)隨時(shí)檢測(cè)，否則應(yīng)于-70℃凍存。4.4反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系μL,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μL,共10μL。4.5反轉(zhuǎn)錄條件3DB37/T2841—20164.6PCR反應(yīng)10×PCRBuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,引物5455F(100μmol/L)和5861R(100μmol/L)4.6.1.2PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min;94℃30s,50℃30s,72℃30s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。4.6.2套式PCR反應(yīng)4.6.2.1套式PCR反應(yīng)體系10×PCRbuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,引物5455F(100μmol/L)和5731R(100μmol/L)94℃預(yù)變性5min,94℃30s,50℃30s,72℃30s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。。套式PCR反應(yīng)結(jié)束后，取9μL樣品與1μL核酸電泳加樣緩沖液混勻后，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，在位于凝膠中央的孔加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。加樣后，按照5V/cm電壓，電泳20min~40min(每次電泳時(shí)，每隔10min觀察一次。當(dāng)加樣緩沖液中溴酚藍(lán)電泳過半至凝膠下2/5處時(shí)，可停止電泳)。電泳后，4.8結(jié)果判定陽性對(duì)照出現(xiàn)相應(yīng)大小的擴(kuò)增條帶，且陰性對(duì)照無此擴(kuò)增條帶時(shí)，判定檢測(cè)有效；否則判定檢測(cè)結(jié)坦布蘇病毒半套式PCR產(chǎn)物的大小為277bp。如果在陽性對(duì)照出現(xiàn)277bp擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)(引物二聚體除外)時(shí)試驗(yàn)成立。被檢樣品出現(xiàn)277bp條帶為坦布蘇病毒陽性，否則為陰性(附4(規(guī)范性附錄)相關(guān)試劑的配制A.11.5%瓊脂糖凝膠的配制瓊脂糖1.5g0.5×TAE電泳緩沖液加至100mL微波爐中完全融化，待冷至50℃~60℃時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液5μL,搖勻。倒入電泳板上，凝固后，取下梳子，備用。A.21×TAE電泳緩沖液的配制A.2.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?)溶液(pH8.0)mL乙二胺四乙酸二鈉mL滅菌雙蒸水氫氧化鈉調(diào)pH至羥基甲基氨基甲烷(Tris)冰醋酸0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?)溶液(pH8.0)滅菌雙蒸水加至滅菌雙蒸水加至A.3溴化乙錠的配制溴化乙錠滅菌雙蒸水加至20mgA.4核酸電泳加樣緩沖液(10×)聚蔗糖滅菌雙蒸水242gmLmLmL5DB37/T2841—2016溴酚藍(lán)6DB37/T2841—2016附錄B(規(guī)范性附錄)試劑的配制B.1PBS溶液的配制NaC1Na?HPO?·