生物工藝學(xué)考題

生物工藝學(xué)試題庫(kù)

試題庫(kù)

思考題

1、舉出幾例微生物大規(guī)模表達(dá)的產(chǎn)品，及其產(chǎn)生菌的特點(diǎn)，

2、工業(yè)化菌種的要求，

工業(yè)化菌種的要求：1、菌的營(yíng)養(yǎng)特征。在發(fā)酵過(guò)程中，要求使用廉價(jià)或來(lái)源豐

富的培養(yǎng)基。2、菌的生長(zhǎng)溫度應(yīng)選擇溫度高于40度的菌種。

3、菌對(duì)所采用的設(shè)備和生產(chǎn)過(guò)程的適應(yīng)性

4、菌種的穩(wěn)定性

5、菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)液的濃度

6、容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物

3、討論:生產(chǎn)抗生素的微生物能不能生產(chǎn)氨基酸，

4、討論:微生物（包括動(dòng)、植物）可以生產(chǎn)我們所需的一切產(chǎn)品，但是涉及到

工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)于某一種特定的產(chǎn)品，為何只有特定的微生物才具有大量表達(dá)的潛

力，5、自然界分離微生物的一般操作步驟，

6、從環(huán)境中分離目的微生物時(shí)，為何一定要進(jìn)行富集富集，

答:富集是一種施加選擇壓力的微生物分離方法，能增加混合菌群中所需菌株的

數(shù)量,其原理是給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利其他菌株生長(zhǎng)的條

件.例如供給特殊的基質(zhì)或加入某些抑制劑，但應(yīng)注意的是,所需類(lèi)型的菌種生長(zhǎng)的

結(jié)果有時(shí)會(huì)改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而改變選擇壓力，使其他微生物也能生長(zhǎng),通過(guò)把

富集培養(yǎng)物接種到新鮮的同一培養(yǎng)基可以重新建立選擇壓力.重復(fù)移植幾次后,接種

少量已富集的培養(yǎng)物到固體培養(yǎng)基上,可將占優(yōu)勢(shì)的微生物分離出來(lái).

7、菌種選育分子改造的目的,

8、以目前的研究水平，土壤中能夠培養(yǎng)的微生物大概占總數(shù)的多少,什么是

16sRNA同源性分析，

答：1)以目前的研究水平，土壤中能夠培養(yǎng)的微生物大概占總數(shù)7O~8O96.

2)rRNA寡核甘酸編目分析：

一種通過(guò)分析原核或真核細(xì)胞中最穩(wěn)定的rRNA寡核甘酸序列同源性程度，以確

定不同生物間的親緣關(guān)系和進(jìn)化譜系的方法.

在眾多的生物大分子中，最適合于揭示各類(lèi)生物親緣關(guān)系的是rRNA,尤其是

16SrRNA,不但分子量大小適中，而且信息量大、易于分析。

16S或18SrRNA同源性分析所依據(jù)的基本原理是:用一種RNA防水

解rRNA后，可產(chǎn)生一系列寡核甘酸片斷,如果兩種或兩株微生物的親緣關(guān)系越

近,則其所產(chǎn)生的寡核甘酸片斷的序列也越近,反之亦然.

9、什么叫自然選育，自然選育在工藝生產(chǎn)中的意義，

10、什么是正突變，什么是負(fù)突變,什么是結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，

答:當(dāng)突變株的生產(chǎn)性狀優(yōu)于原菌株的突變叫正突變.

當(dāng)突變株的生產(chǎn)性狀沒(méi)有圓菌株優(yōu)良的突變叫負(fù)變.結(jié)構(gòu)與功能相類(lèi)似的大分

子物子叫結(jié)構(gòu)類(lèi)似物.

11、什么是誘變育種，常用的誘變劑有哪些，

答:誘變育種是用物理，化學(xué)，生物因素人工誘發(fā)使菌種發(fā)生較高頻率基因突

變從而獲得優(yōu)良性狀變異菌株的過(guò)程。

[1]物理誘變劑:紫外線，快中子，X射線，激光，

[2]化學(xué)誘變劑

(1)堿基類(lèi)似物：2,氨基口票吟，5,漠尿喀咤，8,氮鳥(niǎo)口票吟，8,AGO(2)與堿基反

應(yīng)的物質(zhì)：硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，亞硝基胭，亞硝基甲基胭，亞硝基乙基

胭，亞硝酸，氮芥，4,硝基瞳琳1,氧化物，乙烯亞胺，羥胺(3)在DNA分子中插

入或缺失一個(gè)或幾個(gè)堿基物質(zhì)：口丫咤類(lèi)物質(zhì)，ICR類(lèi)物質(zhì)。［3］生物誘變劑:噬菌

體。

12、什么是基因的重組，什么是基因的直接進(jìn)化,二者有何區(qū)別，13、什么是

培養(yǎng)基?發(fā)酵培養(yǎng)基的特點(diǎn)和要求，

14、用的碳源有哪些,常用的糖類(lèi)有哪些，各自有何特點(diǎn)，

常用的碳源有哪些？

糖類(lèi)油脂有機(jī)酸底碳醇還有蛋白質(zhì)水解物或氨基酸等也可被微生物作為碳

源使用.

常用的糖類(lèi)有哪些？

葡萄糖糖蜜淀粉糊精等.

各有什么特點(diǎn)？

葡萄糖是最容易利用的碳源，過(guò)多時(shí)回導(dǎo)致PH下降,影響酶的活性.

糖蜜是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基價(jià)廉物美的碳源，富含糖氮類(lèi)化合物無(wú)機(jī)鹽和維生

素等.淀粉糊精被水解成單糖后再利用，被普遍使用，價(jià)格低廉,克服葡萄糖代謝過(guò)

快缺點(diǎn).

15、什么是生理性酸性物質(zhì)，什么是生理性堿性物質(zhì)，

16、常用的無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源有哪些,有機(jī)氮源在發(fā)酵培養(yǎng)基中的作用，

17、什么是前體，前體添加的方式，

18、什么是生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子的來(lái)源，

19、什么是產(chǎn)物促進(jìn)劑，產(chǎn)物促進(jìn)劑舉例，

20、什么是理論轉(zhuǎn)化率,什么是實(shí)際轉(zhuǎn)化率，

21、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的一般步驟，

22、培養(yǎng)基成分選擇考慮的問(wèn)題，

讀書(shū)報(bào)告:舉例說(shuō)明培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的方法與步驟，23、

培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的一般原則為選擇適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適，物

理化學(xué)條件適宜包括PH值、水活度以及氧化還原電位等條件，還要考慮到經(jīng)濟(jì)節(jié)

約。賴(lài)氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，在產(chǎn)生最大經(jīng)濟(jì)效益的前提下，利用廉價(jià)的玉米漿作為碳

源，玉米淀粉水解后產(chǎn)生大量的葡萄糖能夠支持發(fā)酵對(duì)碳元素的需求；同樣，利用

豆餅水解液作為氮源也能取得理想效果，并且符合經(jīng)濟(jì)效益;加入硫酸鏤作為氮元

素補(bǔ)充并調(diào)節(jié)PH值。確定培養(yǎng)基成分之后通過(guò)影響面分析法確定培養(yǎng)基的最佳成

分配比，并確定對(duì)結(jié)果有顯著影響的因子，完成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

24、討論:培養(yǎng)基優(yōu)化在發(fā)酵優(yōu)化控制中的作用與地位，

25、么是種子的擴(kuò)大培養(yǎng)，

種子的擴(kuò)大培養(yǎng)：將保存在沙土管，冷凍管中的休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管

斜面活化以后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的

純種過(guò)程。26、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求，

27、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的一般步驟，

28、在大規(guī)模發(fā)酵的種子制備過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室階段和生產(chǎn)車(chē)間階段在培養(yǎng)基

和培養(yǎng)物選擇上各有何特點(diǎn)，

答:在種子制備的實(shí)驗(yàn)室階段,保存在沙土管或冷凍干燥管中的菌種經(jīng)無(wú)菌手續(xù)

接入合適的抱子發(fā)芽或菌絲生長(zhǎng)的斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)成熟后挑選菌落正常的抱

子再一次接入試管斜面！

1對(duì)于產(chǎn)抱子能力強(qiáng)的及胞子發(fā)芽,生長(zhǎng)繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培

養(yǎng)抱子

2對(duì)于產(chǎn)抱子能力不強(qiáng)或抱子發(fā)育慢的菌種接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中與搖床

上恒溫震蕩培養(yǎng)

3對(duì)于不產(chǎn)抱子的細(xì)菌采用斜面營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞保存法

生產(chǎn)車(chē)間種子制備

實(shí)驗(yàn)室制備的泡子或搖瓶菌絲體種子移至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖

因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分，同時(shí)還需供給足夠的無(wú)菌空氣

并不斷攪拌使菌絲體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件.

謝謝老師！！！辛苦啦

29、什么是接種量，對(duì)于細(xì)菌、放線菌及霉菌常用的接種量是多少，30、什

么時(shí)發(fā)酵級(jí)數(shù)，發(fā)酵級(jí)數(shù)對(duì)發(fā)酵有何影響，影響發(fā)酵級(jí)數(shù)的因素有哪些，31、什么

是種齡，事宜種齡確定的依據(jù)，

接種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)

間。通常，接種齡以菌絲體處于生命力極其旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且培養(yǎng)液中菌體

量還未達(dá)到最高峰時(shí)，較為合適。不同品種或同一品種的工藝條件不同，其接種齡

是不一樣的，一般要經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，考察其在發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)能力來(lái)確定最適的接

種齡。

32、讀書(shū)報(bào)告:結(jié)合具體的產(chǎn)品理解種子質(zhì)量控制的方法，以及認(rèn)識(shí)種子質(zhì)量

對(duì)發(fā)酵的影響，

33、接種、倒種、雙種，

34、么是菌體的生長(zhǎng)比速，產(chǎn)物的形成比速，基質(zhì)的消耗比速，維持消耗，答；

將菌體濃度的自然對(duì)數(shù)與時(shí)間作圖可得一直線,其斜率為群體的生長(zhǎng)比速.

產(chǎn)物的生成比速;第一種情況是產(chǎn)物的生成與細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān),則Qp=au

第二種情況是產(chǎn)物的生成與細(xì)胞的生長(zhǎng)部分有關(guān),則Qp=au+b

第三種情況是產(chǎn)物的生成與細(xì)胞的生長(zhǎng)不相關(guān),則dP/dt=Qp(u)X

基質(zhì)的生長(zhǎng)比速;無(wú)產(chǎn)物生成是,Qs=m+u/YG

隨著細(xì)胞生長(zhǎng)有產(chǎn)物生成,則Qs=m+u/Y'G

當(dāng)有產(chǎn)物生成，則Qs-Qp/Yp=m+u/Y'G

?Sm是用于產(chǎn)生能量供維持代謝所消耗的碳源部分。？Sg是用于產(chǎn)生能量供細(xì)

胞生長(zhǎng)所需的部分。？Sa是用于同化作用構(gòu)成細(xì)胞成分的部分。？Sp是用于形成產(chǎn)

物的部分。

35、什么是Monod方程其使用條件如何,各參數(shù)的意義與求解，

36、什么是初級(jí)代謝產(chǎn)物，什么是次級(jí)代謝產(chǎn)物，

初級(jí)代謝產(chǎn)物：自然界中各種生物常能通過(guò)一些相同的代謝過(guò)程,合成（合成代

謝）或利用（分解代謝）細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖所必需的化合物.這一過(guò)程稱(chēng)為初級(jí)代謝,這

一過(guò)程所產(chǎn)生的化合物稱(chēng)為初級(jí)代謝產(chǎn)物.如糖,氨基酸，脂肪酸,核甘酸以及由這些

化合物聚合而成的高分子化合物（如多糖,蛋白質(zhì)，脂類(lèi)和核酸等）.次級(jí)代謝產(chǎn)物：

是指某些微生物生長(zhǎng)到穩(wěn)定期前后，以結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，代謝途徑明確,產(chǎn)量較大的初級(jí)代

謝產(chǎn)物作前體,通過(guò)復(fù)雜的次生代謝途徑所合成的各種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物.

38、什么是連續(xù)培養(yǎng),什么是連續(xù)培養(yǎng)的稀釋率，

39、解釋連續(xù)培養(yǎng)富集微生物的原理，

40、何氧容易成為好氧發(fā)酵的限制性因素，

41、比耗氧速度和呼吸強(qiáng)度的感念，

42、臨界飽和溶氧濃度、臨界溶氧濃度、氧飽和度的概念，

43、微生物的臨界溶氧濃度一般多少，發(fā)酵過(guò)程中的氧容易不容易滿(mǎn)足，臨

界氧是指不影響呼吸所允許的最低溶氧濃度.用空氣飽和度百分?jǐn)?shù)表示.細(xì)菌和酵母

為放線菌為5%-30%;霉菌為10%-15%.

發(fā)酵過(guò)程中氧容易滿(mǎn)足.對(duì)于需氧型微生物,應(yīng)適當(dāng)增加溶氧水平,可從以下幾

方面考慮：（1）減小加糖或補(bǔ)料速率；（2）降低發(fā)酵溫度；（3）液化培養(yǎng)基；（4）中間補(bǔ)

水；（5）添加表面活性劑；（6）在通氣中摻入純氧或富氧.對(duì)于掩氧型微生物則應(yīng)從反

方面考慮適當(dāng)降低溶氧水平.

44、影響微生物需氧的因素有哪些,

45、發(fā)酵液中的體積氧傳遞方程,其中Kia的物理意義是什么，

答：(1)dc/dt=Ka(c*-c)LL

式中dc/dt為單位時(shí)間內(nèi)發(fā)酵液溶氧濃度變化，mmolO/(L?h);2

23K為氧傳質(zhì)系數(shù)，m/h;a為比界面面積，m/m;c為氧在水LL

中的飽和濃度，mmol/L;c*為發(fā)酵液中的溶氧濃度，mmol/L。

de(2)因?yàn)镵a=L(c*,c)dtL

所以Ka的物理意義是:在單位濃度下，單位時(shí)間，單位體L

積發(fā)酵液中吸收的氧氣量。

46、如何調(diào)節(jié)搖瓶發(fā)酵的供氧水平，

47、如何調(diào)節(jié)通氣攪拌發(fā)酵罐的供氧水平，

48、如何測(cè)定發(fā)酵液中的溶氧濃度，以及發(fā)酵罐的Kia?

49、氧的供需研究與反應(yīng)器設(shè)計(jì)與放大的關(guān)系，

50、發(fā)酵過(guò)程中溶氧濃度監(jiān)控的意義，

答:溶氧(D0)是需氧微生物生長(zhǎng)所必須的.在發(fā)酵過(guò)程中有多方面的限定因素，

而溶氧往往是最易成為控制因素.在工業(yè)發(fā)酵中,產(chǎn)率是否受氧的限制,單憑通氣量

的大小是難以確定的.因溶氧的高低不僅取決于供氧,通氣攪拌等,還取決于需氧狀

況.故了解溶氧是否夠的最簡(jiǎn)便又有效的辦法是就地檢測(cè)發(fā)酵液中的溶氧濃度.從溶

氧變化的情況可以了解氧的供需規(guī)律及其對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的影響〉

51、微生物生長(zhǎng)可分為幾個(gè)階段,次級(jí)代謝產(chǎn)物在什么階段開(kāi)始合成，

微生物生長(zhǎng)可分為延遲期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，穩(wěn)定期，衰亡期；次級(jí)代謝產(chǎn)物是從

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期開(kāi)始

52、發(fā)酵過(guò)程的參數(shù)檢測(cè)有什么意義，生產(chǎn)中主要檢測(cè)到參數(shù)有哪些，53、

發(fā)酵過(guò)程糖代謝、氮代謝有什么規(guī)律，為什么,

54、測(cè)定菌的生長(zhǎng)采取哪些方法，不同種的微生物各采取什么方法合適，55、

抗生素、觸的單位的定義

56、抗生素效價(jià)的測(cè)定可采用哪幾種方法，

57、生物法測(cè)定抗生素效價(jià)有什么優(yōu)點(diǎn)，

58、高濃度磷抑制刺激代謝產(chǎn)物合成的機(jī)理是什么，

答:磷在代謝途徑的調(diào)節(jié)方面起著很重要的作用，磷有利于糖代謝進(jìn)行，能促

進(jìn)微生物生長(zhǎng)。磷過(guò)量時(shí)，許多產(chǎn)物的合成受到抑制。例如在谷氨酸的合成中，磷

濃度過(guò)高就會(huì)抑制6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，使菌體生長(zhǎng)旺盛，而谷氨酸的產(chǎn)

量卻很低，代謝向繳氨酸方向轉(zhuǎn)化。但也有一些產(chǎn)物要求磷酸鹽濃度高些。如黑曲

霉NRRL330菌種生產(chǎn)a-淀粉醐時(shí)若加入0.2%磷酸二氫鉀則活力可比低磷酸鹽提

高3倍。還有報(bào)道用地衣桿菌生產(chǎn)a-淀粉醵時(shí)，添加超過(guò)菌體生長(zhǎng)所需要的磷酸

鹽濃度則能顯著增加a-淀粉酶的產(chǎn)量。

59、發(fā)酵過(guò)程為什么要補(bǔ)料，補(bǔ)些什么，

答:補(bǔ)料的作用是及時(shí)供給菌合成產(chǎn)物的需要，以克服由于養(yǎng)分的不足，導(dǎo)致

發(fā)酵過(guò)早的結(jié)束，提高菌體產(chǎn)量。

補(bǔ)料主要補(bǔ)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水分。

60、補(bǔ)料過(guò)多或過(guò)少對(duì)發(fā)酵有什么影響，

61、準(zhǔn)確判斷發(fā)酵終點(diǎn)有什么好處,依據(jù)哪些參數(shù)來(lái)判斷，

62、發(fā)酵過(guò)程中pH會(huì)不會(huì)發(fā)生變化為什么，

+答:在發(fā)酵過(guò)程中，pH是會(huì)發(fā)生變化的。這與微生物的活動(dòng)有關(guān)。NH在溶液

中以NH的形式存在。在34

++++++被利用成為R,NH后在培養(yǎng)基內(nèi)生成H;如以N0為氮源，H被消耗，N0還

原為R,NH;如以氨基3333

+酸作為氮源，被利用后產(chǎn)生的H,使pH下降。Ph改變的另一個(gè)原因是有機(jī)

酸，如乳酸、丙酮酸或乙酸的積累。

63、pH對(duì)發(fā)酵的影響表現(xiàn)在哪些方面，

64、為了確定發(fā)酵的最佳pH,我們?cè)撊绾螌?shí)驗(yàn)，

65、發(fā)酵過(guò)程的pH控制可以采取哪些措施，

66、根據(jù)微生物對(duì)溫度的依賴(lài)可分類(lèi)成哪兒類(lèi)微生物，

67、微生物對(duì)溫度要求不同的原理是什么，

68、發(fā)酵過(guò)程的溫度會(huì)不會(huì)變化，為什么

69、發(fā)酵熱的定義

70、生物熱的大小與哪些因素有關(guān)，

71、溫度對(duì)發(fā)酵有哪些影響，

溫度是保證酶活性的重要條件，故在發(fā)酵過(guò)程中必須保證最適宜的溫度環(huán)境

一、溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，、不同的微生物，其最適生長(zhǎng)溫度和耐受溫度范圍

各異超過(guò)最適的生長(zhǎng)溫度.溫度也影響碳,能源基質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的得率（其細(xì)胞得率

隨溫度升高而降低，主要原因是維持生命活動(dòng)的能量需求增加（最大轉(zhuǎn)化率所處的

溫度一般略低與最適生長(zhǎng)溫度（溫度也影響細(xì)胞的各種代謝過(guò)程，生物大分子的組

分，如比生長(zhǎng)速率隨溫度的上升而增大，細(xì)胞中的RNA和蛋白質(zhì)的比例也隨著增長(zhǎng)

（幾乎所有的微生物的脂質(zhì)成分均隨生長(zhǎng)溫度變化（溫度降低時(shí)細(xì)胞脂質(zhì)的不飽和脂

肪酸含量增加（二、溫度對(duì)發(fā)酵的影響，一般發(fā)酵溫度升高酶反應(yīng)速率增大生長(zhǎng)代

謝加快，生產(chǎn)期提前。但酶本身很易因過(guò)熱而失去活性，表現(xiàn)在菌體容易衰老，發(fā)

酵周期縮短，最終影響產(chǎn)量。溫度除了直接影響過(guò)程的各種反應(yīng)速率外，還通過(guò)改

變發(fā)酵液的物理性質(zhì)間接影響產(chǎn)物的合成。，、溫度還會(huì)影響生物合成的方向。例

如四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉素菌同時(shí)能產(chǎn)生金霉素，再低于,，？,下，合成金霉素的能

力較強(qiáng)。合成四環(huán)素的比例隨溫度的升高而增大，在,，？，下只產(chǎn)生四環(huán)素。，、溫

度對(duì)代謝有調(diào)節(jié)作用。三、最適溫度的選擇整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)僅選用一個(gè)最適溫度不

一定好，因適合菌生長(zhǎng)的溫度不一定適合產(chǎn)物的合成。溫度的選擇還應(yīng)參考其他發(fā)

酵條件。

72、發(fā)酵過(guò)程溫度的選擇有什么依據(jù)，

73、染菌對(duì)發(fā)酵有什么危害，對(duì)提煉有什么危害，

74、有哪些原因會(huì)引起染菌，

75、染菌以后應(yīng)采取什么措施，

76、為什么會(huì)感染噬菌體,感染了噬菌體后應(yīng)采取哪些措施，

答:從技術(shù)上分析，雜菌的途徑有以下幾方面:種子包括進(jìn)罐前菌種室階段出問(wèn)

題;培養(yǎng)基的配制和滅菌不徹底;設(shè)備上特別是空氣除菌不徹底和過(guò)程控制操作上的

疏忽。

遇到早期染菌，原則上可適當(dāng)改變生長(zhǎng)參數(shù)，是有利于生產(chǎn)菌而不利于雜菌的

生長(zhǎng);加入某些抑制雜菌的化合物也不失為一種應(yīng)急辦法;中后期染菌除非是噬菌體

通常后果不會(huì)那么嚴(yán)重。

答、感染噬菌體的原因：

1(生產(chǎn)菌株本身可能就是帶有前噬菌體的污染菌，在發(fā)酵過(guò)程，如遇到某

些條件個(gè)別菌體就會(huì)自發(fā)的進(jìn)入裂解性生活周期，而產(chǎn)生噬菌體。

2(發(fā)酵液中存在噬菌體，究其來(lái)源有：

(1)含有噬菌體的發(fā)酵罐會(huì)通過(guò)排氣、測(cè)樣廢液、洗罐污水或偶爾的“跑

液”等大量散布噬菌體，污染發(fā)酵環(huán)境和生產(chǎn)系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)。

(2)濾過(guò)裝置不良、失效或處理不確實(shí)，并在環(huán)境中有噬菌體的情況下造

成污染。

(3)操作人員導(dǎo)致的污染。通過(guò)工作人員沾有噬菌體的手、工作服及所用

器具導(dǎo)致噬菌體污染。

（4）有時(shí)因噬菌體變異，使原本抗噬菌體的菌株變成敏感菌株，導(dǎo)致新的

污染。

如已感染噬菌體可采用以下措施：

1）選育抗性菌株，及時(shí)改用抗噬菌體的生產(chǎn)菌株。

2）輪換使用專(zhuān)一性不同的菌株。

3）加化學(xué)藥物（如谷氨酸發(fā)酵可加2-4ppm氯霉素，0.1%三聚磷酸鈉，0.6%檸檬

酸鈉或鏤等）。

4）將培養(yǎng)液重新滅菌再接種（噬菌體不耐熱，70-80?經(jīng)5分鐘即可殺死）（,

5）盡快提取成品

6）其他方法。如谷氨酸發(fā)酵在初期感染噬茵體，可以利用噬菌體只能在生長(zhǎng)階

段的細(xì)胞（即幼齡細(xì)胞）中繁殖的特點(diǎn)，將發(fā)酵正常并已培養(yǎng)了16~18小時(shí)（此時(shí)菌

體己生長(zhǎng)好并肯定不染菌）的發(fā)酵液加入感染噬菌體的發(fā)酵液中，以等體積混合后

再分開(kāi)發(fā)酵。實(shí)踐證明，在谷氨酸發(fā)酵中，采用這個(gè)方法可獲得較好的效果。

77、泡沫對(duì)發(fā)酵有哪些有益之處，哪些有害之處，

78、發(fā)酵中泡沫形成的原因是什么，

79、沒(méi)有外界作用力泡沫是否穩(wěn)定,在什么條件下泡沫會(huì)穩(wěn)定，

80、羅氏假說(shuō)對(duì)泡沫穩(wěn)定的條件作了如何假釋?zhuān)?/p>

81、植物油的消泡機(jī)理是什么，

消泡劑作用機(jī)理有a、消泡劑可使泡沫液局部表面張力降低，因而導(dǎo)致泡沫破

滅b、消泡劑能破壞膜彈性而導(dǎo)致氣泡破滅

C、消泡劑能促使液膜排液，因而導(dǎo)致氣泡破滅d羅氏假說(shuō)

消泡劑根據(jù)其作用機(jī)理的不同可以分為破泡劑和抑泡劑

植物油屬于天然油脂是一種破泡劑.天然油脂它來(lái)源容易，價(jià)格低，使用簡(jiǎn)

單，一般來(lái)說(shuō)沒(méi)有明顯副作用，如豆油、菜油、魚(yú)油等。油脂主要成分是高級(jí)脂肪

酸酯和高級(jí)一元醇酯，還有高級(jí)醇、高級(jí)煌等。

其破消泡機(jī)理大致有二種。第一，吸附助泡劑，加入電解質(zhì)，瓦解雙電層，及

使助泡物被增溶等機(jī)理，這樣就破壞助泡物的穩(wěn)泡作用。在這些過(guò)程中消泡劑發(fā)揮

一次消泡作用就被消耗。同時(shí)消耗掉相應(yīng)的助泡物。第二，低級(jí)醇等溶解性較大的

消泡劑，加到氣泡液中局部降低表面張力，發(fā)揮破泡作用，同時(shí)本身不斷破為碎

塊，陸續(xù)溶解而失去破泡作用。破泡過(guò)程中，破泡劑不斷失效、消耗，而助泡劑卻

不受影響

82、對(duì)消泡劑有哪些要求，

83、常用的消泡劑有哪幾類(lèi)，

84、對(duì)于黏稠的發(fā)酵液應(yīng)選怎樣的消泡劑，對(duì)于較稀的發(fā)酵液應(yīng)選怎樣的消

泡劑，85、用于在線檢測(cè)的傳感器必須符合哪些要求，

答:一些在線生物傳感器和基于酶的傳感器所具有的高度專(zhuān)一性和敏感性有可

能滿(mǎn)足在線檢測(cè)這些基質(zhì)的要求另外還有滅菌、穩(wěn)定性和可靠性問(wèn)題.

有些可以用于測(cè)量值和控制的狀態(tài)變量并且現(xiàn)在可以用計(jì)算機(jī)監(jiān)控系統(tǒng)。

86、pH電極的指示電極能測(cè)定pH值的原理是什么，

87、pH電極的測(cè)量范圍有沒(méi)有限制，使用時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題，

88、溶氧電極能夠測(cè)定液體中溶氧濃度的原理是什么，

答：溶氧電極可分為極譜型和原電池型。

現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外測(cè)定溶液中的溶解氧基本上用極譜型的復(fù)膜氧電極。

陰極由伯、銀、金等貴金屬組成，陽(yáng)極由鉛、錫、鋁等組成。當(dāng)給電極施加

極譜電壓（0.6~0.8V負(fù)電壓）時(shí)，溶液中的氧就在陰極被還原。當(dāng)產(chǎn)生的電流與溶

液中氧含量成正比時(shí)，此時(shí)的電極電流為飽和電流，此時(shí)的電壓為極譜電壓。氧濃

度與飽和電流成正比關(guān)系。

89、影響溶氧電極測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確性的因素有哪些，

答：1.壓力和溫度的影響:溶氧電極必須經(jīng)得起高壓蒸汽滅菌，如能耐130攝氏

度，1小時(shí)滅菌和具有長(zhǎng)期的穩(wěn)定性，其漂移不大于1%/d,其精確度和準(zhǔn)確度在

+3%。

2.原電池型電極電流輸出受電極表面液流的影響。

3.用溶氧電極測(cè)定呼吸臨界氧值時(shí)，過(guò)程中先加強(qiáng)通氣攪拌，使溶氧上升到最

高值，然后中止通氣，繼續(xù)攪拌，在灌頂部空間充氮。這時(shí)溶氧會(huì)迅速直線下降，

直到其直線斜率開(kāi)始減少時(shí)所處的溶氧值便是呼吸臨界氧值。

90、哪些儀器可以測(cè)定尾氣氧和尾氣二氧化碳,測(cè)定原理是什么，

答：

尾氣CO的測(cè)量2

常用的尾氣測(cè)定儀是不分光紅外線二氧化碳測(cè)定儀（簡(jiǎn)稱(chēng)IR）,其精度高，可

達(dá)?0.5%,量程的線性范圍大，雖然儀器價(jià)格高，但在生物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常被采用。

不分光紅外線C02氣體分析原理是:除了單原子氣體（如嵐、氮等）和無(wú)極性的雙原

子氣體（如氧、氫、氮等）外，幾乎所有氣體都在紅外波段（即微米級(jí)）具有不同的紅

外吸收光譜，CO的紅外吸收2峰在2.6~2.911m和4.r4.5um之間有兩個(gè)吸收

峰，根據(jù)吸收峰值可以求出CO的所含濃2度。

尾氣氧氣測(cè)定

原理是氧具有高順磁性。在磁場(chǎng)中，氧氣的磁化率比其采用熱磁氧分析儀測(cè)定

它氣體高幾百倍，故混合氣體的磁化率幾乎完全取決于含氧氣的多少。將排氣通入

熱磁氧分析儀，就可測(cè)出排氣氧的含量。

91、利用基因工程菌生產(chǎn)，有什么優(yōu)勢(shì)，常用的宿主菌有哪些,

92、利用基因工程菌生產(chǎn)有哪些特點(diǎn)，

93、重組菌基因不穩(wěn)定性的原因有哪些，

94、在基因工程菌培養(yǎng)過(guò)程中為什么質(zhì)粒會(huì)丟失，

95、基因工程菌高表達(dá)的障礙是什么，

96、常規(guī)的高密度培養(yǎng)的措施有哪些，

答案：為了提高細(xì)胞量和代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，可以采用draw-fill式，補(bǔ)料式，半連

續(xù)式和連續(xù)式培養(yǎng)等。作為工藝過(guò)程，一般

可以分為三個(gè)階段。

第一個(gè)階段是準(zhǔn)備階段，包括設(shè)備的準(zhǔn)備，清洗，消毒，培養(yǎng)基的制備和除

菌，細(xì)胞種子的復(fù)蘇，檢定和擴(kuò)增。細(xì)胞

培養(yǎng)過(guò)程要求高，準(zhǔn)備工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，必須仔細(xì)認(rèn)真，保證高標(biāo)準(zhǔn)，提高成功

率。

第二個(gè)階段是細(xì)胞培養(yǎng)階段。包括細(xì)胞的接種，培養(yǎng)工藝參數(shù)的調(diào)整，取樣分

析，培養(yǎng)基更換等。配有先進(jìn)控制功能

的生物反應(yīng)器是大規(guī)模高密度培養(yǎng)的有效手段。

第三個(gè)階段是產(chǎn)物產(chǎn)生階段。包括培養(yǎng)基的更換，病毒的準(zhǔn)備，接種或產(chǎn)物表

達(dá)誘導(dǎo)劑的加入，培養(yǎng)上清液的收獲，

取樣分析等。

具體的高密度培養(yǎng)一般方法有如下五種：

1.分批培養(yǎng)。是將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次形狀如反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷形

成，產(chǎn)物不斷積累，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后將整個(gè)

反映系取出。操作簡(jiǎn)便但是不能使細(xì)胞從始至終在最優(yōu)條件下生長(zhǎng)。

2.流加培養(yǎng)。將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜條件下接種培養(yǎng)。新?tīng)I(yíng)養(yǎng)

成分隨消耗不斷加入，到反應(yīng)終止后將整

個(gè)反映系取出。能夠做到按照培養(yǎng)物的央求培養(yǎng)細(xì)胞。

3.半連續(xù)培養(yǎng)。又稱(chēng)反復(fù)分批培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上不全部取

出反應(yīng)系剩余部分重新補(bǔ)充新的營(yíng)養(yǎng)成分。

再按分批培養(yǎng)的方式進(jìn)行操作?？梢苑磸?fù)收獲培養(yǎng)液?？刹捎萌〕霾糠钟眠^(guò)的

培養(yǎng)基和加入新鮮培養(yǎng)基的方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞足夠

營(yíng)養(yǎng)及代謝廢物的排除。

4.連續(xù)培養(yǎng)。將培養(yǎng)物與培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。一方面新鮮培養(yǎng)

液不斷加入其中，使細(xì)胞維持在優(yōu)化狀態(tài)

下，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成。

5.灌注培養(yǎng)。是細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)。新鮮培養(yǎng)基加入反應(yīng)器同時(shí)將反應(yīng)液源

源不斷地去處，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞出于一種不斷營(yíng)養(yǎng)的狀態(tài)。

97、重組菌與傳統(tǒng)微生物在產(chǎn)物表達(dá)上有什么區(qū)別，

98、與大腸桿菌相比酵母作為宿主菌有什么優(yōu)點(diǎn)，

答:釀酒酵母是迄今為止研究最深入的真核生物，它具有比大腸桿菌更完畚的

基因表達(dá)調(diào)空機(jī)制，和更強(qiáng)的對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力，因此，釀酒酵母

作為基因工程的表達(dá)系統(tǒng)日益得到廣泛的應(yīng)用，并已成功表達(dá)了多種外源基因。

99、重組菌與傳統(tǒng)菌在發(fā)酵過(guò)程控制中有哪些相同之處，

100、重組大腸桿菌的誘導(dǎo)因子有哪些，重組酵母的誘導(dǎo)因子有哪些，利用某

些微生物能夠不對(duì)稱(chēng)還原4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl4-chloroacetoacetate,COBE)

得到1(+)-4-氯-3羥基丁酸乙酯的特性,從赭色擲抱酵母(Sporobolomyces

salmonicolorZJU0307)中克隆出醛基還原酶(NADP-dependenlAldehyde

reductase)基因，成功地構(gòu)建了重組大腸桿菌E.coliM15(pQE30-alr0307)。用重

組菌作為催化劑,解決了用常規(guī)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化COBE,產(chǎn)物是部分外消旋的R,S-(+)-

4-氯-3羥基丁酸乙酯,e.e.值較低的問(wèn)題。利用微生物產(chǎn)酶催化還原COBE獲得

CHBE的過(guò)程需要輔酶NADPH參與提供氫原子。由于工程菌E.coli本身與酵母菌不

同,沒(méi)有完善的輔酶再生系統(tǒng)，因此往往需要額外添加NADPH和葡萄糖脫氫酣。為

了避免使用這兩種價(jià)格昂貴的物質(zhì)，我們從巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium

ZJU0310)中克隆出6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase)

基因，構(gòu)建了重組大腸桿菌E.coliM15(pQE30-gdh0310),能夠表達(dá)葡萄糖脫氫酶,

將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，同時(shí)將輔酶NADP+轉(zhuǎn)化為NAPDHo

101、溫度對(duì)微生物影響的原理

微生物生長(zhǎng)速率與溫度的相關(guān)性

人們常以最適生長(zhǎng)溫度、最高生長(zhǎng)溫度及最低生長(zhǎng)溫度來(lái)描述微生物的生長(zhǎng)溫

度特性。依微生物的生長(zhǎng)溫度，可將微生物分為低溫菌(psychrophiles),中溫菌

(mesophiles)和高溫菌(thermophiles)。低溫菌類(lèi)的微生物，其最低生長(zhǎng)溫度可低

于5oC,中溫菌表示其最適生長(zhǎng)溫度為37oC,高溫菌則是指這類(lèi)微生物的最高生長(zhǎng)

溫度可高于50oC。微生物的生長(zhǎng)速率會(huì)受到外界環(huán)境溫度的影響，當(dāng)微生物處于

不適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)溫度時(shí)，其因應(yīng)方法有若此微生物具有移動(dòng)性，它可以利用本身所具

有的溫度向性(thermotaxis)能力離開(kāi)不是溫度的生長(zhǎng)環(huán)境;或微生物可忍受此環(huán)

境的溫度，且能在此溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響所容許的程度下，持續(xù)進(jìn)行菌體

的分裂生長(zhǎng);或若此微生物能進(jìn)行產(chǎn)抱等類(lèi)似分化的過(guò)程，則可藉此一對(duì)外界不

利生長(zhǎng)因子具有較高耐受性的狀態(tài)度過(guò)環(huán)境溫度不適生長(zhǎng)的時(shí)期，唯微生物分

裂生長(zhǎng)的速率將暫時(shí)停止或大為降低。在自然界中的確有些微生物能在高于100

oC的水中，或低于冰點(diǎn)的環(huán)境中生長(zhǎng)。環(huán)境中的養(yǎng)分與微生物生長(zhǎng)的相關(guān)性

微生物生長(zhǎng)速率受溫度的影響可以利用Arrhenius法則(v=Se-E*/RT)來(lái)推

算，當(dāng)v等于生長(zhǎng)速率，S為常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，且E*為活化能時(shí)，lnv=S+(-

E*/RT)=S+(-E*/R)(1/T)0但是在一般生長(zhǎng)溫度下，微生物的培養(yǎng)環(huán)境如實(shí)驗(yàn)室中

所用的各式培養(yǎng)基亦具有影響微生物生長(zhǎng)速率的能力。雖然培養(yǎng)環(huán)境的條件并不會(huì)

改變對(duì)微生物的最適生長(zhǎng)溫度，但對(duì)于不同微生物之最高生長(zhǎng)溫度及最低生長(zhǎng)溫度

的范圍，則依不同菌種而產(chǎn)生不同的影響。例如當(dāng)在養(yǎng)分充裕的培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草

桿菌時(shí)，枯草桿菌的最低生長(zhǎng)溫度會(huì)有下降的現(xiàn)象，即枯草桿菌可生長(zhǎng)在比一般環(huán)

境條件培養(yǎng)所能生長(zhǎng)的最低生長(zhǎng)溫度更低的溫度下，此外若在培養(yǎng)基中外加如

methionine氨基酸等養(yǎng)分時(shí)，則發(fā)現(xiàn)大腸桿菌可生長(zhǎng)在較一般環(huán)境條件培養(yǎng)所能

觀察到的最高生長(zhǎng)溫度還高的溫度，亦即可以提高大腸桿菌的最高生長(zhǎng)溫度。培養(yǎng)

基的組成成份對(duì)最低及最高生長(zhǎng)溫度的影響原因之一，可能是因微生物體內(nèi)的代謝

途徑，特別是某些生合成的途徑，在高溫或低溫時(shí)，常有失去功能的情形出現(xiàn)，使

得微生物無(wú)法再充分供應(yīng)自身生理所需的養(yǎng)分，因而無(wú)法正成生長(zhǎng)或甚至有喪失生

命力的情形。在此時(shí)外界環(huán)境如培養(yǎng)基等若能補(bǔ)充并提供微生物所缺乏的養(yǎng)分，將

可提高微生物在此溫度下的生存能力。

溫度對(duì)微生物組成份及生理的影響

微生物的生長(zhǎng)速率包含細(xì)胞質(zhì)量(cellmass)及微生物生長(zhǎng)產(chǎn)量(growthyield)

二因子隨時(shí)間的變化量，且此二因子皆會(huì)隨生長(zhǎng)溫度的不同而改變。一般認(rèn)為決定

微生物最高生長(zhǎng)溫度的決定因子為細(xì)胞中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，且外界環(huán)境溫度對(duì)細(xì)胞

內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的脂肪酸成份亦具有影響力。環(huán)境溫度對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的影響包

含細(xì)胞中酵素的活性和酵素的表現(xiàn)量，并會(huì)引起微生物的熱休克反應(yīng)(heatshock

response)o在正常溫度范圍內(nèi)，中溫菌細(xì)胞內(nèi)酵素的活性會(huì)隨著溫度的改變而改

變，但在酵素量上的變化較少;若是溫度較高時(shí)，如高于42oC時(shí)，細(xì)胞中蛋白質(zhì)

的量則會(huì)有相當(dāng)大的變化，這是因?yàn)榇蟛糠值鞍踪|(zhì)的生合成量隨著溫度的升高而產(chǎn)

生的變化，多為降低細(xì)胞中蛋白質(zhì)的生合成量。

當(dāng)環(huán)境的溫度增高時(shí)，微生物會(huì)產(chǎn)生熱休克反應(yīng)，如在大腸桿菌中，已被發(fā)現(xiàn)

至少有24種蛋白質(zhì)會(huì)因溫度的升高而大量表現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)被稱(chēng)為熱休克蛋白

質(zhì)。在這24種熱休克蛋白質(zhì)中，則其中至少有20種熱休克蛋白質(zhì)是受控于一種

sigmafactor,稱(chēng)為htpR。一般認(rèn)為微生物的熱休克反應(yīng)與htpR調(diào)控?zé)嵝菘说?/p>

白質(zhì)表現(xiàn)的能力有直接的相關(guān)性，而微生物熱休克反應(yīng)的效率則與微生物是否能于

環(huán)境溫度提高時(shí)存活有著密切的相關(guān)性。研究結(jié)果中顯示突然升高培養(yǎng)環(huán)境的溫度

時(shí)，野生型(wildtype)微生物的存活率，遠(yuǎn)較htpR突變菌株(即在htpR基因有

缺陷的微生物)為高，此種熱休克反應(yīng)被發(fā)現(xiàn)廣泛的存在于多種微生物中，且在許

多高等生物中亦相當(dāng)常見(jiàn)。多種熱休克蛋白質(zhì)具有特殊的生物活性，能協(xié)助其它蛋

白質(zhì)維持其正確的折迭(folding)形態(tài)，而使其它蛋白質(zhì)具有適當(dāng)?shù)牧Ⅲw結(jié)構(gòu)，繼

而得以執(zhí)行正常的功能，所以推測(cè)這些熱休克蛋白質(zhì)可能藉由穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)其它蛋白

質(zhì)因溫度升高而松垮的立體結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)保有部份或全部的生理功能，

因而讓微生物得以在較高的外界環(huán)境溫度下存活。

微生物外在環(huán)境溫度對(duì)微生物細(xì)胞膜的磷脂中飽和性脂肪酸(saturatedfatty

acids)及非飽和性脂肪酸(unsaturatedfattyacids)的比例亦有影響。當(dāng)外界環(huán)

境溫度下降時(shí)，非飽和性脂肪酸的比例會(huì)隨之增高，而飽和性脂肪酸的比列則會(huì)下

降。因?yàn)榉秋柡托灾舅岷休^飽和性脂肪酸為多的雙鍵，熔點(diǎn)(meltingpoints)

較低，所以在外界環(huán)境溫度降低時(shí)，細(xì)胞膜中非飽和性脂肪酸比例的增加，可能具

有使細(xì)胞膜流動(dòng)性增加;細(xì)胞膜正常生理功能得以部份維持的作用。當(dāng)環(huán)境溫度上

升時(shí)，細(xì)胞膜中非飽和性脂肪酸比例則

有降低的現(xiàn)象，而飽和性脂肪酸比例會(huì)增加，相對(duì)于環(huán)境溫度下降時(shí)非飽和性

脂肪酸比列增高的原因，此現(xiàn)象可能與拮抗因環(huán)境溫度上升而增加之細(xì)胞膜流動(dòng)性

有關(guān)。

當(dāng)外界環(huán)境溫度降低時(shí)，對(duì)微生物的影響主要還是在細(xì)胞中的蛋白質(zhì)上，因蛋

白質(zhì)的斥水鍵強(qiáng)度在低溫時(shí)有減弱的情形，細(xì)胞中蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)會(huì)因之改變，

使得蛋白質(zhì)酵素與其它分子如一些反應(yīng)物(effectors)間的作用方式或親和力發(fā)生

變化，造成蛋白質(zhì)的功能及其調(diào)控方式與正常環(huán)境溫度時(shí)不相同，因而影響微生物

在低溫時(shí)生理代謝無(wú)法正常運(yùn)作。此外，在低溫時(shí)，核醮體蛋白質(zhì)(ribosomal

proteins)

或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯啟始蛋白質(zhì)因子(initiationfactorsoftranslation)無(wú)法形

成適當(dāng)?shù)牧Ⅲw結(jié)構(gòu)，使得裝配核醺體(ribosomes)時(shí)效率不佳，而核醵體為微生物

體內(nèi)轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)的部位，當(dāng)核醵體裝配情形不良時(shí)，氨基酸聚合情形自然不理想，

微生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯生合成的量降低，微生物正常的生理狀況因而無(wú)法維持。

微生物的致死溫度

將微生物給與高溫處理或突然間將微生物置于低溫或冷凍狀況下時(shí).，微生物可

能喪失其生長(zhǎng)的能力而死亡。微生物因高溫處理而喪失分裂能力的程度與微生物體

內(nèi)的含水度相關(guān)，其因溫度處理而死亡的速率常可以指數(shù)動(dòng)力型的模式進(jìn)行推測(cè)和

評(píng)估。一般而言，特定的一些數(shù)值常用來(lái)描述這些高溫?zé)崽幚淼挠行?，如TDP

(thermaldeathpoint),指的是將微生物以熱處理一特定時(shí)間后，使微生物喪失

分裂能力所需的最低溫度;TDT(thermaldeathtime)或是F值，所代表的是在特

定的培養(yǎng)基中，以特定溫度將一特定密度之微生物進(jìn)行滅菌所需之時(shí)間;此外，D

值則指以熱處理將微生物數(shù)量減少90%所需的時(shí)間。

當(dāng)微生物處于冷凍低溫的環(huán)境時(shí)，微生物可能因冷凍而立即死亡，或因儲(chǔ)存效

應(yīng)而在冷凍低溫儲(chǔ)存期間緩慢失去分裂能力，這和冷凍時(shí)細(xì)胞的密度和冷凍儲(chǔ)存的

溫度皆有相關(guān)性。欲進(jìn)行菌種保存時(shí)，尤其是工業(yè)界或?qū)W術(shù)界須長(zhǎng)期保存有價(jià)值的

微生物，并維持其存活率、使能多次重復(fù)利用時(shí)?，一些化學(xué)物質(zhì)如甘油(glycerol)

和dimethylsulfoxide等抗凍劑，常被加入培養(yǎng)基中，這些物質(zhì)可以保護(hù)微生物，

降低微生物因低溫冷凍所受到的傷害。

分離技術(shù)習(xí)題庫(kù)

(-)緒論

1生物產(chǎn)品與普通化工產(chǎn)品分離過(guò)程有何不同,

首先，生物產(chǎn)品存在于發(fā)酵液中，它是復(fù)雜的多相系統(tǒng)，含有產(chǎn)生生物產(chǎn)品的

細(xì)胞本身、代謝產(chǎn)物和未用完的培養(yǎng)基等，分散在其中的固體和膠狀物質(zhì)具有可壓

縮性且其密度與發(fā)酵液接近，黏度很大，屬非牛頓性液，所以使得從培養(yǎng)劑中分離

這些固體很難，因此在分離前一般要將發(fā)酵液酸化、加熱或加入絮凝劑而進(jìn)行預(yù)處

理，。而普通的生化制品與其周?chē)镔|(zhì)的質(zhì)地相差很大，因此更易于分離。

其次，生物物質(zhì)在培養(yǎng)液中的濃度很低，雜質(zhì)含量高，因此要從低濃度的混合

液中分離出需要的組分需很大的能量且最后成品需要達(dá)到的純度又很高，這又要求

對(duì)生物產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行多步的純化操作一般分初步純化（提?。?；高度純化（精制）和最后

純化。

再次，欲提取的生物物質(zhì)都不太穩(wěn)定，遇熱、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、去污

劑、高離子強(qiáng)度等條件都會(huì)使其降解或活性降低。因此在生物產(chǎn)品的分離較其他化

工產(chǎn)品的分離比需要更溫和的條件，溫度、PH等各個(gè)參數(shù)都應(yīng)在分離前進(jìn)行優(yōu)

化，使生物產(chǎn)品在穩(wěn)定的條件下進(jìn)行分離。

2傳統(tǒng)生化產(chǎn)品與基因工程產(chǎn)品分離方法的比較，

答案:傳統(tǒng)生化產(chǎn)品與基因工程產(chǎn)品在提取和精制上的差異，主要表現(xiàn)在下列

三個(gè)方面：

1）傳統(tǒng)生化產(chǎn)品都是小分子（工業(yè)用醵除外，但它們對(duì)純度要求不高、提取方

法比較簡(jiǎn)單），其理化性能（如平衡關(guān)系等）數(shù)據(jù)都為已知，因此放大比較有根據(jù);相

反基因工程產(chǎn)品大多為大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗(yàn)。

2）由于第一代基因工程產(chǎn)品都是以大腸桿菌作為宿主，無(wú)生物傳遞系統(tǒng)、故產(chǎn)

品處于胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎，胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)給提取增加了很多困難而發(fā)

酵液中的產(chǎn)物，濃度較低，雜質(zhì)又多，且一般大分子較小分子不穩(wěn)定（易失活，如

對(duì)剪切力），故提取較困難。

3)大分子的分離主要困難在于雜蛋白的分離，由于蛋白質(zhì)都由氨基酸構(gòu)成，所

以性質(zhì)相似，分離主要依靠高分辨力的精制方法，如色層分離等。小分子的分離通

常容易些，但是當(dāng)雜質(zhì)和目標(biāo)物質(zhì)性質(zhì)相近時(shí)，也需要應(yīng)用色層分離，例如西索米

星的分離。

2設(shè)計(jì)生物產(chǎn)品的分離工藝應(yīng)考慮哪些因素，

答：1)充分利用目標(biāo)蛋白質(zhì)和雜蛋白在物理，化學(xué)和生物等方面性質(zhì)的差異，

尤其重要的是表面性質(zhì)的差異。如表面電荷密度，表面疏水性等。

2)當(dāng)兒種方法連用時(shí):最好以不同的分離機(jī)制為基礎(chǔ)，而且經(jīng)前一種方法處理

的液體應(yīng)能適合于作為后一種方法的料液，不必經(jīng)過(guò)脫鹽，濃縮等處理。

3)離子交換層析系根據(jù)蛋白質(zhì)表面所帶電荷不同而分離。分離時(shí)應(yīng)選擇在電荷

相差最大的pH下進(jìn)行操作。

4)親和層析選擇性最強(qiáng)，但不能放在第一步，以延長(zhǎng)介質(zhì)壽命，降低成本。5)

注意非蛋白類(lèi)雜質(zhì)的去除。如DNA,熱原質(zhì)和病毒。

另一答案:設(shè)計(jì)生物產(chǎn)品分離工藝是應(yīng)考慮收率，目標(biāo)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，溫度、

PH對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物活性的影響，成本和生物安全問(wèn)題等。

(1)收率:生物產(chǎn)品所在的發(fā)酵液或培養(yǎng)液的特點(diǎn)之一是含欲提取的生物物質(zhì)濃

度很低，但雜質(zhì)含量卻很高。由于雜質(zhì)較多且成品要求達(dá)到的純度較高，常需多步

純化操作，因此應(yīng)盡可能提高收率，減少提取步驟，不僅能節(jié)省時(shí)間，還能降低成

本。

(2)目標(biāo)產(chǎn)物的穩(wěn)定性:欲提取的生物物質(zhì)通常很不穩(wěn)定，遇熱、極端PH、有機(jī)

溶劑會(huì)引

起失活或分解，特別是Pr的生物活性與一些輔因子、金屬離子的存在和分子

的空間構(gòu)型有關(guān)。設(shè)計(jì)分離工藝時(shí)，應(yīng)考慮目標(biāo)產(chǎn)物的物理、化學(xué)和生物學(xué)活性,

防止其變性失活以至無(wú)法利用。

(3)溫度、PH對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物活性的影響:溫度過(guò)高或過(guò)低，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件會(huì)破壞

目標(biāo)產(chǎn)物尤其是Pr的空間構(gòu)型和結(jié)合鍵，造成目標(biāo)產(chǎn)物的活性降低甚至失活，故

應(yīng)充分考慮溫度、PH的作用，盡可能采取最佳方案。

(4)成本:在保證有較高的收率的條件下，較低的成本就成為我們追求的目標(biāo)。

要求所需原料價(jià)格低廉、容易獲取、適用范圍廣、再生能力強(qiáng)、能夠重復(fù)利用等。

(5)生物安全問(wèn)題：即要防止菌體擴(kuò)散，一般要求在密封的環(huán)境下操作。

、除去溶液中的非蛋白雜質(zhì)。回答：1

2、考慮目的蛋白和雜質(zhì)蛋白在物理，化學(xué)，生物等方面的差異，尤其重要的

是表面

性質(zhì)的差異。

3、離子交換層析根據(jù)蛋白質(zhì)表面所帶的電荷不同而分離的。分離時(shí)應(yīng)該選擇

在電荷

相差最大的pH下進(jìn)行操作。

4、親和層析選擇性最強(qiáng)，但不能放在第一步，以提高其使用壽命。

5、幾種方法一起使用時(shí)，最好以不同的分離機(jī)制為基礎(chǔ)，而且經(jīng)前一種方法

處理的

液體應(yīng)能適合于作為后一種方法的料液，且不用經(jīng)過(guò)脫鹽，濃縮等處理。

6、溫度和pH會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白的活性產(chǎn)生影響。設(shè)計(jì)方案時(shí)應(yīng)充分考慮溫度，pH

的作

用。

7、通常提取的目標(biāo)蛋白很不穩(wěn)定，熱、極端pH、有機(jī)溶劑都會(huì)使其失活。設(shè)

計(jì)方案

時(shí)，應(yīng)考慮產(chǎn)物的物理、化學(xué)、生物學(xué)活性，防止其變性失活。

8、提取物一般在發(fā)酵液中含量很低，但雜質(zhì)含量卻很高。由于雜質(zhì)較多且成

品要求

達(dá)到的純度高，需要多步純化操作，因此，應(yīng)盡可能的提高收率，減少提取步

驟。

9、原料的價(jià)格便宜、容易收獲、適用范圍廣、再生能力強(qiáng)、能夠重復(fù)利用，

以便降

低成本。

10、操作時(shí)要在密閉的環(huán)境下進(jìn)行，防止菌體擴(kuò)散，造成生物污染。

3初步純化與高度純化分離效果有何不同，

答：（D一般說(shuō)來(lái),下游加工過(guò)程可分為四個(gè)階段:培養(yǎng)液（發(fā)酵液）的預(yù)處理和

固液分離;初步純化（提取）；高度純化（精制）；最后純化.

（2）初步純化（提?。?/p>

經(jīng)固液分離或細(xì)胞破碎及碎片分離后,活性物質(zhì)存在于濾液中，濾液體積很大，

濃度很低，

下游加工過(guò)程就是濃縮和純化的過(guò)程,常需好幾步操作.其中第一步操作最為重

要,稱(chēng)為初步純化或提取，主要目的在于濃縮,也有一些純化作用，而以后的幾步操作

所處理的體積小,合成為高度純化或精制.

初步純化的主要方法有吸附法,離子交換法,沉淀法,溶劑萃取法,兩水相萃取法,

超臨界流體萃取法,膜過(guò)濾法等.

（3）高度純化（精制）

經(jīng)初步純化后,體積已大大縮小.但純度提高不多，需要進(jìn)一步進(jìn)行精制.大分子

（蛋白質(zhì)）和小分子物質(zhì)的精制方法有類(lèi)似之處,但側(cè)重點(diǎn)有所不同，大分子物質(zhì)的精

制依賴(lài)于色層分離,，而小分子物質(zhì)的精制常常利用結(jié)晶操作.

（4）綜上所述,初步純化使濾液濃縮,也有一些純化作用.高度純化使?jié)饪s了的濾

液提高濃度.

（王天佐03120381）

4如何除去蛋白質(zhì)溶液中的熱原質(zhì)，

答:熱原是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖），從細(xì)菌細(xì)胞壁產(chǎn)生，注入體

內(nèi)會(huì)使體溫升高，去除困難。傳統(tǒng)的去熱原方法是活性炭吸附或石棉板過(guò)濾，但前

者會(huì)造成產(chǎn)品損失，后者對(duì)勞動(dòng)保護(hù)和產(chǎn)品質(zhì)量都存在一定問(wèn)題。當(dāng)產(chǎn)品分子量在

1000以下，用MWCO為10000的超濾膜除去熱原是很有效的。注射用水和藥劑也可

按此法去熱原。脂多糖是陰離子的可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用

疏水層析法。

答：熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，是脂多糖類(lèi)物質(zhì)，從細(xì)菌的細(xì)胞壁

產(chǎn)生，注入體內(nèi)會(huì)使體溫升高，其去除困難。傳統(tǒng)的去熱原方法是活性炭吸附或石

棉板過(guò)濾，但全這會(huì)造成產(chǎn)品損失，后者對(duì)勞動(dòng)保護(hù)和產(chǎn)品質(zhì)量都存在一定問(wèn)題。

當(dāng)產(chǎn)品分子量在1000以下，用MWC0為10000的超濾膜除去熱原是很有效的。注射

用水和藥劑也可按此法去熱原。脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖

是疏水性的可用疏水層析法。答:熱原質(zhì)：熱原質(zhì)即細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖，主要是腸

桿菌科所產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素。大多由革蘭陰性菌產(chǎn)生.注入人體或動(dòng)物體內(nèi)可引起

發(fā)熱反應(yīng)，故名熱原質(zhì)，熱原質(zhì)耐高溫，高壓蒸氣滅菌不能破壞.

1.從蛋白質(zhì)中除去熱原質(zhì)比較困難，最好的辦法是防止產(chǎn)生熱原質(zhì)，整個(gè)過(guò)

程在無(wú)菌條件下進(jìn)行。所有的層析介質(zhì)在使用前先除去熱原質(zhì)，操作在2到8攝氏

度下進(jìn)行，洗脫液需先經(jīng)無(wú)菌處理，流出的蛋白質(zhì)也需無(wú)菌處理，即通過(guò)0.2納米

的微濾膜，并在2到8攝氏度下保存。

2.對(duì)于小分子量的多肽或蛋白質(zhì)可以用超濾或反滲透進(jìn)行除去。此方法不適用

于大分子蛋白質(zhì)溶液。

3.對(duì)于大分子的蛋白溶液可以用以下方法：

1).用陰離子交換層析法去除，因?yàn)橹嗵鞘顷庪x子。此時(shí)應(yīng)注意調(diào)節(jié)PH使蛋

白不被吸附。

2).用疏水交換層析法去除，因?yàn)橹嗵侵械闹?lèi)是疏水性的。

3).還可根據(jù)蛋白質(zhì)和熱原質(zhì)的親和性的不同用親和層析法去除。配基可用多

黏菌素B,或光譜的抗體等。

在應(yīng)用上除去熱原質(zhì)最好辦法是蒸儲(chǔ)

5生物分離為何主張采用集成化技術(shù)，

答：因?yàn)樯锂a(chǎn)品在分離和純化過(guò)程中需要多個(gè)操作步驟,且分離過(guò)程中易發(fā)生

變化,也需要許多檢查和分析方法.為此一種操作分離技術(shù)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，需要多種

分離技術(shù)同時(shí)結(jié)合應(yīng)用。

所以,在實(shí)際中，為減少操作步驟,提高產(chǎn)品收率,要把幾個(gè)步驟合并，使分離效

果更好，特別是集成化技術(shù)的出現(xiàn)為產(chǎn)品分離和高效產(chǎn)率有很大貢獻(xiàn)，例如，擴(kuò)張

床吸附技術(shù)，能取代固液分離濃縮和初步純化三步操作，以使過(guò)程大大簡(jiǎn)化，且產(chǎn)

品收率得到提高。集成化技術(shù)包括操作集成化和方法集成化。集成化的使用禰補(bǔ)丁

單一方法的不足，減少操作步驟，提高產(chǎn)品收率,使生物分離更加快速高效的完

成。所以集成化技術(shù)在生物分離上得到廣泛應(yīng)用。另一答案:隨著生物分離技術(shù)的

不斷改進(jìn)和變化，隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，新的蛋白質(zhì)和新的分離方法也不斷出

現(xiàn)，采用繼承化技術(shù)是一種必然。

首先，生物分離的步驟比較復(fù)雜，大致講主要包括以下幾步：

第一部分為固-液分離，第二部分為初步純化，第三部分為高度純化，第四部

分為成品加工。具體內(nèi)容有生物產(chǎn)品的細(xì)胞破碎，沉淀，過(guò)濾，離心，萃取，膜分

離，吸附與離子交換，層析，親和純化，電泳，結(jié)晶及干燥等。大家都知道，操作

步驟越復(fù)雜，生物產(chǎn)品的收率越低，因此在操作上采用集成化，不僅能提高產(chǎn)品收

率，而且還降低了生產(chǎn)的成本，這無(wú)疑是非常具有吸引力的。

其次，生物產(chǎn)品分離需要的條件復(fù)雜，人工控制難以達(dá)到理想的效果或者工作

兩非常巨大，所以采用繼承化技術(shù)便于自動(dòng)化控制，效果非常明顯。

再次，許多生物產(chǎn)品在單個(gè)細(xì)胞中含量很底，小規(guī)模的培養(yǎng)收效過(guò)低，采用集

成化技術(shù)，便于生物產(chǎn)品的分離純化。同樣，由于其生物制劑的特殊性，單一的分

離純化手段很難達(dá)到目的，因此在分離純化方法上也需要集成化。例如將親和作用

力與膜分離結(jié)合起來(lái)，利用前者的高選擇性和后者的高處理能力優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了親和

層析的處理量小和膜分離選擇性差的缺點(diǎn)，折中方法稱(chēng)為親和膜分離。現(xiàn)在這方面

發(fā)展很多，也在不斷的發(fā)展著。另一答案：

鑒于過(guò)程集成化技術(shù)在化學(xué)工業(yè)中取得的成功，發(fā)展生物過(guò)程的集成化技術(shù)將

成為解決生物產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化技術(shù)的重要途徑之一。

過(guò)程集成是指將兩個(gè)或兩個(gè)以上的生產(chǎn)技術(shù)或工藝步驟有機(jī)地結(jié)合在一起，在

一個(gè)生產(chǎn)過(guò)程或設(shè)備中同時(shí)完成的先進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)。過(guò)程集成的目的是簡(jiǎn)化工藝流

程、提高生產(chǎn)效率及降低投資和生產(chǎn)成本。無(wú)論是化學(xué)工程還是生物工程的發(fā)展，

都離不開(kāi)過(guò)程集成技術(shù)。

生物體系是一個(gè)多種反應(yīng)的集成體系，即使在最簡(jiǎn)單的大腸桿菌中也同時(shí)發(fā)生

著數(shù)以千計(jì)的反應(yīng)用于細(xì)胞合成和代謝產(chǎn)物的生成;生物體系也是一個(gè)反應(yīng)與傳質(zhì)

分離的集成體系，各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要通過(guò)細(xì)胞壁傳遞到細(xì)胞內(nèi)，一些代謝產(chǎn)物則需要

釋放到胞外以防止在胞內(nèi)的積累。

在傳統(tǒng)的工業(yè)發(fā)酵中，產(chǎn)品的制取需要經(jīng)過(guò)酶生產(chǎn),醵分離,生物大分子的酶水

解，細(xì)胞培養(yǎng)，目標(biāo)產(chǎn)物分離等五個(gè)基本步驟:而在基因工程蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中，一般

又包括了酶生產(chǎn),酶分離,生物大分子的酶水解,基因工程細(xì)胞培養(yǎng),產(chǎn)物的誘導(dǎo)表達(dá),

細(xì)胞破碎，產(chǎn)物分離、復(fù)性與純化等基本步驟。在工藝流程長(zhǎng)、生產(chǎn)效率代的同

時(shí)，還可能存在如下的問(wèn)題:酶生產(chǎn)中的產(chǎn)物或底物抑制:產(chǎn)物或酶分離過(guò)程中的失

活;酶水解或細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的產(chǎn)物或底物抑制;細(xì)胞破碎中目標(biāo)產(chǎn)物的損失;各種

分離提純與復(fù)性方法的條件匹配和相互

制約等。

生物過(guò)程集成化技術(shù)就是要將上述反應(yīng)或分離步驟中幾種不同的方法集成在一

個(gè)反應(yīng)器或一個(gè)工藝步驟中進(jìn)行，這樣既能夠簡(jiǎn)化工藝流程、提高生產(chǎn)效率，又可

以解決產(chǎn)物抑制、失活及操作條件的匹配和制約等問(wèn)題。

生物過(guò)程集成化技術(shù)是生物產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化技術(shù)發(fā)展的一個(gè)方向，加強(qiáng)這一領(lǐng)域的

研究將大大促進(jìn)生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。我國(guó)已把發(fā)展生物技術(shù)作為本世紀(jì)的一個(gè)

重要任務(wù)，而生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化是實(shí)現(xiàn)生物技術(shù)高速發(fā)展的最終目的，高速和高效

地將實(shí)驗(yàn)室成果轉(zhuǎn)化為商品，增強(qiáng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化中的技術(shù)含量勢(shì)在必行。

6純化生物產(chǎn)品的得率是如何計(jì)算的，若每一步純化產(chǎn)物得率為90%,共6步純

化得到符合要求產(chǎn)品，其總收率是多少，

答:?純化后得到的生物物質(zhì)？欲提取的生物物質(zhì)總量X100%=得率

?總收率等于每步純化產(chǎn)物的得率的乘積再乘以100樂(lè)

6若每一步純化產(chǎn)物得率為90%則總收率：0.9X100%=53%

（二）發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離

1發(fā)酵液為何需要預(yù)處理,處理方法有哪些，

答：以發(fā)酵液為出發(fā)點(diǎn),要設(shè)法將細(xì)胞（菌體）富集或去除,使所需目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移

到液相中，同時(shí)還希望除去其他懸浮顆粒（如培養(yǎng)基殘?jiān)w或絮凝體等）以及改善

濾液的形狀，以利后續(xù)各步操作,所以發(fā)酵液要進(jìn)行預(yù)處理.

方法：

（1）過(guò)濾和離心

無(wú)論胞內(nèi)還是胞外產(chǎn)物,都要涉及細(xì)胞的富集或固體懸浮物的分離除去,常用的

固液分離方法主要是過(guò)濾和離心方法.

(2)凝聚和絮凝技術(shù)

凝聚和絮凝技術(shù)能有效的改變細(xì)胞菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使其

聚集起來(lái)，增大面積，以便于固液分離,常用于菌體細(xì)小而且黏度大的發(fā)酵液的預(yù)處

理中.

(3)雜蛋白質(zhì)的其他去除方法

＜1＞等電點(diǎn)沉淀法;＜2＞加熱變性＜3＞利用吸附作用也可以除去蛋白質(zhì)＜4＞加蛋白

質(zhì)沉淀劑,使形成復(fù)合物沉淀.

(4)高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法

＜1＞去除鈣離子,用草酸或草酸鈉.＜2＞去除鎂離子,加入三聚磷酸.〈3＞用磷酸鹽

處理,也能大大地降低鈣離子和鎂離子的濃度.＜4＞要去除鎂離子,可加入黃血鹽，使

形成普魯士藍(lán)沉淀.

另一答案:答：

發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理的原因是:發(fā)酵液是復(fù)雜的多相系統(tǒng)，含有細(xì)胞、代謝產(chǎn)物

和未用完的培養(yǎng)基等，分散在其中的固體和膠狀物質(zhì)，具有可壓縮性，其密度又和

液體相近，加上黏度又大，使得從發(fā)酵液中提取固體很困難。預(yù)處理的目的就是以

細(xì)胞培養(yǎng)液或是發(fā)酵液為出發(fā)點(diǎn)，設(shè)法將細(xì)胞(菌體)富集或去除，使所需要的目的

產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相中，同時(shí)還希望除去其他的懸浮顆粒，以及改善濾液的性狀，以利

后續(xù)各步操作。

預(yù)處理的方法有：

1凝集和絮凝技術(shù)

凝集:在中性鹽的作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定

的現(xiàn)象。

凝集的原理:與膠粒帶相反電荷的離子，由于能降低6電位和脫除膠粒表面的

水化膜，能導(dǎo)致膠粒間的凝聚作用。常用的凝聚劑電解質(zhì)有A12604)3?181120

(明磯);A1C13?6H20;FeC13;ZnS04;MgC03等。

絮凝:在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使細(xì)胞聚集形成不穩(wěn)定的

現(xiàn)象。絮凝的原理:高分子絮凝劑上含有相當(dāng)多的活性基團(tuán)，它們通過(guò)靜電力、范

德華引力或者氫鍵的作用，強(qiáng)烈的吸附在膠粒的表面，一個(gè)高分子聚合物的許多鏈

節(jié)分別吸附在不同的顆粒上，產(chǎn)生了架橋連接，生成粗大的絮團(tuán)。常用的絮凝劑是

人工合成的高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類(lèi)和聚乙烯亞胺衍生物。

2雜蛋白的其他去除方法

(D等電點(diǎn)沉淀法:在某一PH處，蛋白質(zhì)的靜電荷為零，溶解度最小，可使其

沉淀而除去。

(2)變性沉淀法:蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列到變成無(wú)規(guī)則的排列結(jié)構(gòu)稱(chēng)之為變性，

變性蛋白質(zhì)的溶解度最小。如熱變性法、大幅度改變PH法，加入有機(jī)溶劑及表面

活性劑等。(3)吸附作用

(4)加入蛋白質(zhì)沉淀劑:使之形成復(fù)合物沉淀。

3高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法

Ca2+:加入草酸或其可溶性鹽(如草酸鈉)。反應(yīng)生成的草酸鈣還能促進(jìn)蛋白質(zhì)

凝固，提高濾液的質(zhì)量。應(yīng)注意草酸的回收問(wèn)題。

Mg2+:加入三聚磷酸鈉Na5P3010,它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物。用磷酸鹽處

理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。

Fe3+:加入黃血鹽，使之形成普魯士藍(lán)沉淀。

2如何使用助濾劑？

(1)將助濾劑中加至濾漿中，攪拌均勻后過(guò)濾，使助濾劑在過(guò)濾介質(zhì)上形成

多孔、疏松的濾餅，反復(fù)過(guò)濾以得到澄明溶液。這種方法適合濾漿中固體含量少,

特別是含有粘性或膠凝性物質(zhì)，助濾劑用量為0.1-0.5%o由于濾渣與助濾劑不容

易分開(kāi)，若過(guò)濾的目的是回收濾渣，就不能把助濾劑與懸浮液混合在一起。

（2）將助濾劑用適量的濾漿制成糊狀物，加至過(guò)濾介質(zhì)上，抽濾使成1-5mm

厚的助濾劑沉積層，然后過(guò)濾。這種過(guò)濾方法可防止過(guò)濾介質(zhì)孔道被細(xì)顆?；蛘持?/p>

物堵塞，過(guò)濾初期就可得到澄明溶液。也可將（1）、（2）方法聯(lián)用。

（03級(jí)生物技術(shù)4班程志遠(yuǎn)03120311）

3凝集與絮凝過(guò)程有何區(qū)別,如何將兩者結(jié)合使用，

4錯(cuò)流微濾與傳統(tǒng)過(guò)濾相比有何優(yōu)點(diǎn)

錯(cuò)流微濾可在過(guò)濾介質(zhì)孔徑小于0.4um的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)一步過(guò)濾。錯(cuò)流微濾的優(yōu)

點(diǎn)是:減少濃差極化，使用壽命延長(zhǎng),可對(duì)固體有近100,的截留率，分離效率高，過(guò)

濾效果穩(wěn)定，有良好的生物物質(zhì)截留效果，組件設(shè)計(jì)與操作靈活。能在高濃度溶解

凈化和極端環(huán)境（酸、堿、有機(jī)溶劑、高

溫、高壓）下的應(yīng)用。

（三）微生物細(xì)胞的破碎

1肽聚糖在細(xì)菌細(xì)胞壁中起何種作用，革蘭氏陽(yáng)性菌與陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖含

量有何差別，

答:肽聚糖是真細(xì)菌細(xì)胞壁的特有成分。肽聚糖分子由肽和聚糖兩部分組成，

其中的肽包括四肽尾和肽橋兩種，而聚糖則是由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸兩

種單糖相互間隔連接成的長(zhǎng)鏈。這種肽聚糖網(wǎng)格狀分子交織成一個(gè)致密的網(wǎng)套覆蓋

在整個(gè)細(xì)胞上，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。

雖然幾乎所有的細(xì)菌都含有肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但是革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）

的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性菌（如金黃色葡萄球菌）有很大不同。革蘭氏陰性菌比陽(yáng)

性菌復(fù)雜，在電子顯微鏡超薄切片觀察，可見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁較厚，具有

20~80nm的肽聚糖層，約占細(xì)胞壁成分的40%~90%,此外細(xì)胞壁還含有大量磷壁

酸。而革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄，僅2~3nm,占細(xì)胞壁成分的10%左右，由于

肽聚糖之間僅由四肽側(cè)鏈直接連接，缺乏五肽橋，故層較疏松，而且肽聚糖位于細(xì)

胞壁最內(nèi)層，緊貼在細(xì)胞膜上;在肽聚糖層外面還有一較厚的外壁層（約8~10

nm）,主要成分為脂蛋白、脂多糖和其他脂類(lèi)，因此革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中脂類(lèi)含

量較高。

2溶菌酶溶解細(xì)胞壁的機(jī)理是什么，

答案:溶菌酶溶解細(xì)胞壁是酶解法溶解細(xì)胞壁的一種。酶解法是利用酶反應(yīng)，

分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而達(dá)到破碎目的。

酶解法的特點(diǎn)是專(zhuān)一性強(qiáng)，因此在選擇酶系統(tǒng)時(shí)，必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)

組成來(lái)選擇。溶菌酶能專(zhuān)一地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分子的B-1,4糖昔鍵，因此主

要用于細(xì)菌類(lèi)細(xì)胞壁的裂解。例如在巨大芽抱桿菌、枯草桿菌、微球菌等革蘭氏陽(yáng)

性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對(duì)于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)采用

溶菌酶無(wú)效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。這主要是因?yàn)楦锾m氏陰性菌結(jié)構(gòu)中

肽聚糖的含量少，并處于細(xì)胞壁內(nèi)層，外表面含有大量脂類(lèi)（脂蛋白、脂多糖），而

脂多糖層需鈣鎂離子才能維持穩(wěn)定性，故需利用EDTA除去鈣鎂離子，使脂多糖分

子脫落，外層膜出現(xiàn)洞穴，溶菌的才能發(fā)揮作用。放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類(lèi)似于革蘭

氏陽(yáng)性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶，對(duì)于某些種類(lèi)放線菌，有

時(shí)為了增強(qiáng)被酶作用的敏感性，在菌絲體培養(yǎng)過(guò)程中，添加適量抑制劑，如甘氨酸

和蔗糖等，使細(xì)胞壁容易溶解。酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分和結(jié)構(gòu)與細(xì)菌明顯不

同，主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，因此不能用溶菌醮裂解，常用蝸牛酶、纖

維素酶、多糖酶等，有時(shí)采用幾種酶的混合物會(huì)產(chǎn)生更好的效果。植物細(xì)胞壁的主

要成分是纖維素，常采用纖維素醐和半纖維素醐裂解。

（03級(jí)生物技術(shù)1班鄧新林03120219）

3如何測(cè)定細(xì)胞破碎程度，

答案：

為了檢測(cè)細(xì)胞破碎的程度，獲得定量的結(jié)果，需要進(jìn)行分析。常用的方法是測(cè)

定目的產(chǎn)物的釋放量，也可檢測(cè)細(xì)胞的破碎情況。

（一）、直接測(cè)定

檢測(cè)破碎前后完整細(xì)胞數(shù)量之差。利用顯微鏡或電子計(jì)數(shù)器可直接計(jì)數(shù)完整細(xì)

胞的量，所以可用于破碎前的細(xì)胞計(jì)量。破碎過(guò)程中所釋放的物質(zhì)如DNA和其他聚

合物組分會(huì)干擾計(jì)數(shù)，故可用染色法把破碎的細(xì)胞從為損害的完整細(xì)胞中區(qū)別開(kāi)

來(lái)，以便于計(jì)數(shù)破碎后的完

整細(xì)胞。例如:破碎的革蘭氏陽(yáng)性菌常可染成革蘭氏陰性菌的顏色，利用革蘭

氏染色法未受損害的酵母細(xì)胞呈現(xiàn)紫色，而受損害的酵母細(xì)胞呈現(xiàn)亮紅色。

（二）、測(cè)定釋放的蛋白質(zhì)量或酶的活力

測(cè)定細(xì)胞破碎后懸浮液中細(xì)胞內(nèi)含物的增量。通常將破碎后的細(xì)胞懸浮液離

心，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量或酶的活力，并與100%破碎所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比

較。（三）、測(cè)定導(dǎo)電率

利用破碎前后導(dǎo)電率的變化來(lái)測(cè)定破碎程度是一種快速方法。導(dǎo)電率的變化是

由于細(xì)胞內(nèi)含物被釋放到水相中而引起的。導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線性增

加。因?yàn)閷?dǎo)電率的讀數(shù)取決于微生物的種類(lèi)、處理?xiàng)l件、細(xì)胞濃度、溫度和懸浮液

中電解質(zhì)的含量，應(yīng)預(yù)先采用其他方法來(lái)進(jìn)行標(biāo)化。

（四）沉淀法

1理解概念:硫酸錢(qián)飽和度，鹽溶，鹽析

硫酸鉉飽和度鹽溶鹽析

硫酸鐵飽和度:不飽和溶液的濃度和飽和用液濃度的比.

鹽溶：向蛋白質(zhì)溶液中逐漸加入電解質(zhì)，由于蛋白質(zhì)的活度系數(shù)降低，剛起

始時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度增大，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽溶.

鹽析：繼續(xù)加入電解質(zhì)，由于電解質(zhì)的離子在水中發(fā)生水化，蛋白質(zhì)的溶解

度減小，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析

2沉淀與結(jié)晶有何不同，

沉淀法:濃縮作用，主要用于初步分離，主要適用于蛋白質(zhì)等大分子，需要加

入沉淀劑，促進(jìn)凝聚和沉淀。

結(jié)晶法:用于制備純物質(zhì)，是精制的手段;主要用于抗生素氨基酸有機(jī)酸等小分

子，與沉淀法相比，其選擇性好，析出的晶體純度高。形成需要的晶體，且以過(guò)飽

和為動(dòng)力，緩和的條件利于晶體的形成。

3有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理什么，用乙醇沉淀蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)，答：

有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理是：

加入有機(jī)溶劑有利與蛋白質(zhì)溶液中產(chǎn)生多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來(lái)使蛋白質(zhì)

沉淀，其中主要效應(yīng)是水的活度降低，當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時(shí)，水對(duì)蛋白質(zhì)分子表

面上帶電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，或者說(shuō)溶劑介電常數(shù)降低，因而靜電吸

力增大，在憎水區(qū)域附近有序排列的水分子可以為有機(jī)溶劑所取代，是有些區(qū)域的

溶解性增大，但除了憎水性特別強(qiáng)的蛋白質(zhì)如膜蛋白外，對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，后者

影響較小，所以總的效果是導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的聚集而沉淀。

用乙醇沉淀蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)注意：

?降低溫度能增加收率和減少蛋白質(zhì)變性，如用乙醇沉淀血漿蛋白，在TO?下

進(jìn)行。？所選溶劑須和水互溶，和蛋白質(zhì)不起作用，因而常用乙醇丙酮。

?蛋白質(zhì)分子量越大，產(chǎn)生沉淀所需加入有機(jī)溶劑量越少。

?將1L濃度為C1(體積分?jǐn)?shù))的溶液加入熔劑，使其濃度達(dá)到C2所需加入溶劑

的ML數(shù)為1000(Cl-C2)/100-C2o

?一種蛋白質(zhì)的溶解度通常會(huì)由于另一種蛋白質(zhì)的存在而降低。

?沉淀的蛋白質(zhì)如不能在溶解，就可能已變性。

?接近等電點(diǎn)時(shí)，以引起沉淀所需加入有機(jī)溶劑量較少。

?當(dāng)溶劑梁達(dá)50%時(shí)，通常只有分子量小于1500的蛋白質(zhì)仍留在溶液中。

?少量中性鹽的存在（0.1,0.2moi/L以上）能產(chǎn)生鹽溶作用，增加蛋白質(zhì)在有機(jī)

溶劑水溶液中的溶解度，這就使沉淀蛋白質(zhì)所需的有機(jī)溶劑量增大。