高三生物一輪復(fù)習(xí)課件第54講基因工程的基本工具和基本操作程序

第54講

基因工程的基本工具和基本操作程序2025屆生物一輪復(fù)習(xí)第九單元考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具1.基因工程概述

生物類型生物產(chǎn)品人們的愿望轉(zhuǎn)基因遺傳性狀2.重組DNA技術(shù)的基本工具 (1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)

脫氧核苷酸序列磷酸二酯鍵黏性末端(2)DNA連接酶黏性末端限制酶(3)載體噬菌體受體DNA上限制酶酶切位點(diǎn)標(biāo)記考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具一、基因工程的概念指按照人們的愿望,通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。別名：操作環(huán)境：操作對象：操作水平：工程原理：最終目的：

生物體外基因DNA分子水平基因重組【歸納定義】重組DNA技術(shù)定向改造生物性狀考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具二、基因工程的誕生和發(fā)展歷程(1)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不僅證明DNA是遺傳物質(zhì)，還證明了DNA可在同種生物不同個(gè)體之間

。(2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和

的證明。(3)中心法則的確立。(4)

的破譯。(5)基因轉(zhuǎn)移載體和

的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。轉(zhuǎn)移半保留復(fù)制遺傳密碼限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶→DNA的空間結(jié)構(gòu)和基本組成單位相同→都遵循堿基互補(bǔ)配對原則→所有生物共用一套密碼子考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具二、基因工程的誕生和發(fā)展歷程(6)

體外重組的實(shí)現(xiàn)。(7)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功。(8)DNA測序和合成技術(shù)的發(fā)明。(9)

技術(shù)的發(fā)明。(10)

技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。DNAPCR基因組編輯考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車”限制性內(nèi)切核酸酶載體DNA連接酶考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具1、限制性內(nèi)切核酸酶（也稱“限制酶”——”分子手術(shù)刀“）

主要從原核生物中分離純化而來①來源：選擇性必修3P71“旁欄思考”：原核生物中存在限制酶的意義是什么？提示切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。教材隱性知識考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具1、限制性核酸內(nèi)切酶（也稱“限制酶”——”分子手術(shù)刀“）

主要從原核生物中分離純化而來①來源：數(shù)千種②種類：③特點(diǎn)：識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開專一性選擇性必修3P71“旁欄思考”：限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？提示原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾教材隱性知識考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……限制酶所識別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列?？键c(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具1、限制性核酸內(nèi)切酶（也稱“限制酶”——”分子手術(shù)刀“）④作用：斷開兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵EcoRⅠ(識別GAATTC序列,在G與A之間切割)考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具1、限制性核酸內(nèi)切酶（也稱“限制酶”——”分子手術(shù)刀“）⑤作用結(jié)果：SmaⅠ(識別GGGCCC序列,在G與C之間切割)5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端中心軸線兩側(cè)中心軸線處切割一次，形成一個(gè)切口，兩個(gè)黏性末端5'5'3'3'考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具GAATTCCTTAA

GG

AATTCCTTAAGGCTTAAAAT

TCGGCTTA

AAAT

TCG用同種限制酶切割(EcoRⅠ)把兩種來源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？思考：考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具GCTTAAAAT

TCGGCTTAAAATTCG考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具AGATCTTCTAG

AG

GATCCCCTAGGATCTAGGAT

CTAGCCTA

GGAT

CCG用兩種不同限制酶切割同種限制酶產(chǎn)生的黏性末端相同，不同的限制酶可能會形成相同的黏性末端，黏性末端相同的片段可以進(jìn)行連接考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具BglⅡ酶切后的質(zhì)粒X與BamHⅠ酶切后的目的基因Y能夠連接的原因是

。酶切后產(chǎn)生相同的黏性末端，并遵循堿基互補(bǔ)配對原則【典例】考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具

缺口怎么辦？ATCTAGGAT

CTAGCCTAGGATCCG考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具2、DNA連接酶（——”分子縫合針“）①作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。②類型：a、E·coliDNA連接酶：b、T4DNA連接酶：來源于大腸桿菌，只能“縫合”黏性末端來源于T4噬菌體，“縫合”黏性末端和平末端效率較低考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具選擇性必修3P72“旁欄思考”：DNA連接酶和DNA聚合酶

(填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA連接酶連接的是

，而DNA聚合酶是把單個(gè)的

連接到已有的DNA片段上。②

起作用時(shí)需要以一條DNA鏈為模板，而

不需要模板。不是兩個(gè)DNA片段脫氧核苷酸DNA聚合酶DNA連接酶教材隱性知識考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具與DNA有關(guān)的幾種酶的比較考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具3、載體（——”分子運(yùn)輸車“）作為運(yùn)載工具，攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞。①作用：質(zhì)粒（最常用）、噬菌體、動(dòng)植物病毒②種類：

質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。a、來源：真核或原核細(xì)胞b、結(jié)構(gòu)：環(huán)狀雙鏈DNAC、特點(diǎn)：能自我復(fù)制考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具三、重組DNA技術(shù)的基本工具3、載體（——”分子運(yùn)輸車“）③載體應(yīng)具備的條件（特點(diǎn)）：c、有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選a、有一或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)b、能在受體細(xì)胞中自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制通常是抗性基因，也可以是熒光蛋白基因）考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具標(biāo)記基因的篩選原理考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具模擬重組DNA過程目的基因質(zhì)粒重組DNA考點(diǎn)一

重組DNA技術(shù)的基本工具…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG模擬重組DNA過程通常用兩種不同限制酶同時(shí)切割目的基因和載體（雙酶切法）：防止載體自身連接、目的基因自身環(huán)化和確保目的基因插入的方向(1)請用圖示法寫出限制性內(nèi)切核酸酶Ⅰ和限制性內(nèi)切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的過程。提示限制性內(nèi)切核酸酶Ⅰ：限制性內(nèi)切核酸酶Ⅱ：(2)切割圖示中的目的基因和質(zhì)粒應(yīng)選用哪類限制酶？請說明理由。提示用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒。限制酶Ⅰ的識別序列包含限制酶Ⅱ的識別序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位點(diǎn)，故使用限制酶Ⅱ時(shí)，可在目的基因兩端同時(shí)作切割，從而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒，會同時(shí)破壞質(zhì)粒中的兩個(gè)“標(biāo)記基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒?？枷?/p>

結(jié)合基因工程的基本工具，考查科學(xué)探究1.(2023·新課標(biāo)卷，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。C下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(

)A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接B2.(2024·廣東珠海調(diào)研)大腸桿菌pUC118質(zhì)粒是基因工程中常用的一種載體，具有氨芐青霉素抗性基因，該質(zhì)粒中某限制酶的唯一切點(diǎn)位于lacZ基因中。在特定的選擇培養(yǎng)基中，若lacZ基因沒有被破壞，則大腸桿菌菌落呈藍(lán)色；若lacZ基因被破壞，則菌落呈白色。關(guān)于圖中操作的敘述正確的是(

)A.試管1中應(yīng)加入限制酶和DNA連接酶B.試管2中將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，需用Ca2＋處理大腸桿菌C.能在氨芐青霉素培養(yǎng)基中存在的菌落均呈現(xiàn)白色D.試管3應(yīng)選擇藍(lán)色菌落內(nèi)的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)3.(2021·全國乙卷，38)用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中_______________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中_________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。EcoRⅠ、Pst

ⅠEcoRⅠ、Sma

Ⅰ、Pst

Ⅰ、EcoRⅤ(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是

。(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能

；質(zhì)粒DNA分子上有

，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是____________________________________________________________________。(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指______________________________________________________________________________________________________。磷酸二酯鍵自我復(fù)制限制酶切割位點(diǎn)用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞 RNA聚合酶識別、結(jié)合和驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序(2)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因引物脫氧核苷酸耐高溫溫度1.目的基因的篩選與獲取人工合成目的基因基因文庫兩種引物(2)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

耐高溫的DNA聚合酶指數(shù)形式瓊脂糖凝膠電泳2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心受體細(xì)胞RNA聚合酶受體細(xì)胞中是否含有目的基因2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心標(biāo)記基因限制酶3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞只有該步驟沒涉及堿基互補(bǔ)配對原則目的基因子房T－DNA染色體DNA顯微注射受精卵4.目的基因的檢測與鑒定PCR抗原—抗體雜交考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測與鑒定考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲取在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀的或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。1.目的基因：編碼蛋白質(zhì)的基因，或具有調(diào)控作用的因子2、篩選合適的目的基因①從相關(guān)的已知

的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用

和序列比對工具進(jìn)行篩選。結(jié)構(gòu)和功能清晰序列數(shù)據(jù)庫考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲取3、目的基因的獲?、偃斯ず铣赡康幕颍?/p>

（化學(xué)合成法、逆轉(zhuǎn)錄法）當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時(shí)，可采用此種方法。②PCR

和擴(kuò)增目的基因獲取a、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)?？键c(diǎn)二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲?、赑CR

和擴(kuò)增目的基因獲取b、PCR反應(yīng)的條件：一定的緩沖溶液（一般添加Mg2+激活DNA聚合酶）DNA模板（需含有目的基因）四種脫氧核苷酸(或dNTP）耐高溫的DNA聚合酶（不需要解旋酶，DNA在高溫下解旋）2種引物能嚴(yán)格調(diào)控溫度的溫控設(shè)備PCR是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。在該過程中，引物非常關(guān)鍵，回答下列有關(guān)引物的問題：考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序(1)什么是引物？(2)PCR技術(shù)為什么需要引物？ATCGAATCGGTT

TAGCTTAGCCAADNA聚合酶母鏈DNA子鏈DNA引物3′5′5′DNA聚合酶不能從頭合成子鏈，只能從3’端延伸DNA鏈引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸。3′引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3’端連接脫氧核苷酸考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序(3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)需要兩種引物，原因是什么？提示目的基因的兩條反向平行的鏈都作為模板，其堿基序列不同。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2(4)在PCR擴(kuò)增目的基因之前，需先設(shè)計(jì)引物，對設(shè)計(jì)的兩種引物之間的堿基序列的要求是什么？提示兩種引物之間不能互補(bǔ)配對?？键c(diǎn)二

基因工程的基本操作程序(5)為檢測胚乳細(xì)胞中Wx基因是否表達(dá)，科研人員提取胚乳中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程獲得總cDNA，通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是什么？提示引物是依據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)?？键c(diǎn)二

基因工程的基本操作程序(6)若一個(gè)DNA分子在PCR中經(jīng)過n輪循環(huán)，理論上需要消耗多少個(gè)引物？第n輪循環(huán)需要消耗多少個(gè)引物數(shù)？提示經(jīng)過n輪循環(huán)需要消耗引物數(shù)為(2n＋1－2)個(gè)，第n輪循環(huán)需要消耗的引物數(shù)為2n個(gè)?？键c(diǎn)二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲?、赑CR

和擴(kuò)增目的基因獲取c、PCR反應(yīng)的過程：90單鏈50引物72d、PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳法來鑒定?？键c(diǎn)二

基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲?、偃斯ず铣赡康幕颍孩赑CR

和擴(kuò)增目的基因獲?、弁ㄟ^構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因3、目的基因的獲取考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1、目的：使目的基因

，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代啟動(dòng)子標(biāo)記基因2、基因表達(dá)載體的組成及作用：考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序提醒啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(不編碼氨基酸)考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）同種限制酶處

理或產(chǎn)生相同黏性末端的不同

種限制酶處理帶有黏性末端切口帶有相同黏性末端的目的基因片段重組DNA分子（重組質(zhì)粒）3、基因表達(dá)載體構(gòu)建過程（課本P80）種類項(xiàng)目植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA中→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細(xì)胞（感受態(tài)）→基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞能發(fā)育成完整個(gè)體繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植物將目的基因插入染色體DNA中T-DNA植物組織培養(yǎng)注意：1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程可轉(zhuǎn)移的DNA將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序辨析：①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法小結(jié)：Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細(xì)胞染色體DNA中表達(dá)新性狀

該過程經(jīng)過____次拼接、____次導(dǎo)入？(1)第一次拼接___________________________(2)第二次拼接___________________________(3)第一次導(dǎo)入___________________________(4)第二次導(dǎo)入___________________________將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（非人工操作）優(yōu)先選擇受傷的葉片與重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌培養(yǎng)，葉片傷口處的細(xì)胞可釋放大量的酚類物質(zhì)，可吸引農(nóng)桿菌考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序辨析：②轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化：指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組?？键c(diǎn)二

基因工程的基本操作程序四、目的基因的檢測與鑒定(如分子雜交技術(shù))原理：抗原抗體特異性結(jié)合考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序△DNA分子雜交技術(shù)——檢測目的基因是否插入15N15N變性變性探針（PCR擴(kuò)增）轉(zhuǎn)基因生物的DNA雜交DNA分子（PCR擴(kuò)增）出現(xiàn)雜交帶考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序△分子雜交技術(shù)——檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄探針（PCR擴(kuò)增）出現(xiàn)雜交帶轉(zhuǎn)基因生物的mRNA15N15N變性DNA-RNA雜交分子1.設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如圖)，請分別說明理由。①第1組：_______________________________________________________；②第2組：_______________________________________________________。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對而失效引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對而失效2.若一個(gè)DNA分子在PCR中經(jīng)過n輪循環(huán)，理論上需要消耗多少個(gè)引物？第n輪循環(huán)需要消耗多少個(gè)引物數(shù)？

提示

經(jīng)過n輪循環(huán)需要消耗引物數(shù)為(2n＋1－2)個(gè)，第n輪循環(huán)需要消耗的引物數(shù)為2n個(gè)。D考向

圍繞基因工程的操作程序，考查科學(xué)探究1.(2023·湖北卷，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落2.(2023·全國乙卷，38)GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以GFP基因?yàn)椴牧?，利用基因工程技術(shù)獲得了其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類?；卮鹣铝袉栴}。 (1)構(gòu)建突變基因文庫，科研人員將GFP基因的不同突變基因分別插入載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌制備出GFP基因的突變基因文庫。通常，基因文庫是指___________________________________________________________________ ______________________________________。將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因(2)構(gòu)建目的基因表達(dá)載體?？蒲腥藛T從構(gòu)建的GFP突變基因文庫中提取目的基因(均為突變基因)構(gòu)建表達(dá)載體，其模式圖如圖所示(箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向)。圖中①為

；②為

，其作用是___________________________________________________________________；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標(biāo)記基因，其作用是_______________________________。終止子啟動(dòng)子提供RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)GFP突變基因轉(zhuǎn)錄出mRNA將含有表達(dá)載體的細(xì)胞篩選出來(3)目的基因的表達(dá)?？蒲腥藛T將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光，有的發(fā)黃色熒光，有的不發(fā)熒光。請從密碼子特點(diǎn)的角度分析，發(fā)綠色熒光的可能原因是____________________________________________________________________________________________________________(答出1點(diǎn)即可)。(4)新蛋白與突變基因的關(guān)聯(lián)性分析。將上述發(fā)黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對其所含的GFP突變基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其堿基序列與GFP基因的不同，將該GFP突變基因命名為YFP基因(黃色熒光蛋白基因)。若要通過基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)思路是____________________________________________________________________________________________________________。 GFP基因雖然發(fā)生了突變，但由于存在密碼的簡并現(xiàn)象(密碼子的簡并)，突變基因所編碼的氨基酸序列并未改變

將YFP基因插入表達(dá)載體，再將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體導(dǎo)入不能發(fā)黃色熒光的真核細(xì)胞中，觀察黃色熒光是否出現(xiàn)3.(2023·全國甲卷，38)接種疫苗是預(yù)防傳染病的一項(xiàng)重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發(fā)病率。乙肝病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術(shù)獲得的乙肝病毒表面抗原(一種病毒蛋白)。回答下列問題。 (1)接種上述重組乙肝疫苗不會在人體中產(chǎn)生乙肝病毒，原因是__________________________。 (2)制備重組乙肝疫苗時(shí)，需要利用重組表達(dá)載體將乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)導(dǎo)入酵母細(xì)胞中表達(dá)。重組表達(dá)載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是

。能識別載體中的啟動(dòng)子并驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄的酶是

。疫苗中不含乙肝病毒DNA用于篩選含有重組表達(dá)載體的細(xì)胞RNA聚合酶(3)目的基因?qū)虢湍讣?xì)胞后，若要檢測目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細(xì)胞中提取

進(jìn)行DNA分子雜交，DNA分子雜交時(shí)應(yīng)使用的探針是____________________________________________________________________________。(4)若要通過實(shí)驗(yàn)檢測目的基因在酵母細(xì)胞中是否表達(dá)出目的蛋白，請簡要寫出實(shí)驗(yàn)思路。___________________________________________________________________________________。染色體DNA(基因組DNA)

與目的基因特異性互補(bǔ)且?guī)в袠?biāo)記的DNA片段(帶標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段)從酵母細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，再用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交，檢測是否出現(xiàn)雜交帶考點(diǎn)三

DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定1.DNA的粗提取與鑒定不溶于2mol/L二苯胺(2)方法步驟研磨上清液95%一個(gè)方向2mol/L二苯胺5min藍(lán)色2.DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定 (1)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)可解離相反瓊脂糖凝膠電泳大小和構(gòu)象(2)PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟微量移液器離心管底部PCR儀(3)電泳鑒定：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為______________的紫外燈下被檢測出來。①成功擴(kuò)增出DNA片段的判斷依據(jù)是____________________________________。②進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是____條條帶。如圖所示，該片段大小約為________

bp。300nm可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶一750考點(diǎn)三

DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定一、DNA的粗提取與鑒定1、基本原理：不溶于2mol/L二苯胺沸水浴考點(diǎn)三

DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定2、實(shí)驗(yàn)材料：新鮮洋蔥（香菜、菠菜、菜花或豬肝等）不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞（如豬血細(xì)胞），因?yàn)闊o細(xì)胞核和各種細(xì)胞器可以用雞血細(xì)胞，需加入檸檬酸鈉，防止血液凝固一、DNA的粗提取與鑒定考點(diǎn)三

DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定一、DNA的粗提取與鑒定95%沸水注意加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。3、操作流程：a、抑制DNA水解酶的活性，防止DNA降解；b、低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少斷裂；c、降低分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出破碎細(xì)胞考點(diǎn)三

DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定二、DNA片段的擴(kuò)增和電泳鑒定1、實(shí)驗(yàn)原理：①PCR原理：利用了

原理。DNA的熱變性②電泳：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷

的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。③PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的

等有關(guān)。相反大小和構(gòu)象考點(diǎn)三

DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定二、DNA片段的擴(kuò)增和電泳鑒定瓊脂糖凝膠電泳(1)DNA鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色。(2023·廣東卷，11D)(

)(2)粗提取DNA時(shí)的過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解。(2022·山東卷，13A)(

)(3)動(dòng)、植物細(xì)胞DNA的提取必須在無菌條件下進(jìn)行。(2022·湖北卷，5)(

)×√×(4)PCR技術(shù)中的DNA延伸過程無需引物參與即可完成半保留復(fù)制。(2022·遼寧卷，12C)(

)(5)用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近。(2019·江蘇卷，10A)(

)××D考向1

結(jié)合DNA的粗提取與鑒定，考查科學(xué)探究能力1.(2023·廣東卷，11)“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯(cuò)誤的是(

) A.裂解：使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì) B.分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等 C.沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度 D.鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色A2.(2021·山東卷，13)粗提取DNA時(shí)，向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進(jìn)行下列處理后再進(jìn)行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是(

) A.加入適量的木瓜蛋白酶 B.37～40℃的水浴箱中保溫10～15分鐘 C.加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精 D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2mol/L→過濾→加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至0.14mol/LD考向2結(jié)合DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定，考查科學(xué)探究3.(2024·廣東肇慶調(diào)研)在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因載體，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖所示。以下相關(guān)敘述中，錯(cuò)誤的是(

)A.該載體最可能為環(huán)形DNA分子B.兩種限制酶在載體上各有一個(gè)酶切位點(diǎn)C.限制酶R1與R2的切割位點(diǎn)最短相距200bpD.限制酶作用位點(diǎn)會導(dǎo)致氫鍵和肽鍵斷裂4.(2024·山東煙臺模擬)PCR是以模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式在體外選擇性地將DNA某個(gè)特殊區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。DNA擴(kuò)增過程的產(chǎn)物有長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩種，其形成過程如圖1所示。請回答下列問題：(1)DNA復(fù)制時(shí)子鏈延伸的方向是

(填“5′→3′”或“3′→5′”)。由于DNA聚合酶不能直接催化兩個(gè)單核苷酸之間的反應(yīng)，因此DNA復(fù)制需要一段單鏈DNA或RNA作為

。圖15′→3′引物(2)如果擴(kuò)增序列為圖2所示的兩段序列之間的DNA片段，請從表中列出的引物中選出一對合適的引物

。5′—GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG—3′3′—CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC—5′圖2引物Ⅰ引物Ⅱ甲5′—GACCTGTGGAAGCA5′—CATACGGGATTG乙5′—CTGGACACCTTCGB5′—GTATGCCCTAAC丙5′—CGAAGGTGTCCAGC5′—GTTAGGGCTTAC丁5′—GCTTCCACAGGTCD5′—CAATCCCGTATG甲和D(3)下面為某同學(xué)利用PCR儀進(jìn)行PCR的操作步驟，請完善相關(guān)步驟內(nèi)容。a.按配方準(zhǔn)備好各組分。b.用微量移液器向微量離心管中依次加入各組分：模板DNA、4種脫氧核糖核苷三磷酸、

、引物、緩沖液等。c.

使反應(yīng)液聚集在微量離心管底部。d.將微量離心管放入PCR儀，設(shè)定好PCR儀的循環(huán)程序。e.進(jìn)行PCR。(4)PCR的產(chǎn)物片段中，只有

才是符合要求的目標(biāo)產(chǎn)物。耐高溫的DNA聚合酶離心雙鏈短產(chǎn)物片段1.(2023·重慶卷，12)某小組通過PCR(假設(shè)引物長度為8個(gè)堿基，短于實(shí)際長度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(如下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)BA.實(shí)驗(yàn)所用引物，其中一個(gè)序列為5′－TGCGCAGT－3′B.步驟①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步驟①的酶對載體進(jìn)行酶切至少獲得了2個(gè)片段D.酶切片段和載體連接時(shí)可使用E.coli連接酶或