新陳代謝 酶2學(xué)習(xí)課件

第六節(jié)酶動力學(xué)一、有關(guān)的化學(xué)動力學(xué)概念（一）化學(xué)計量方程[式]和基元反應(yīng)基元反應(yīng)：反應(yīng)物分子在碰撞中一步直接轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物分子的反應(yīng)。實際上，多數(shù)反應(yīng)是非基元反應(yīng)，而是由多個基元反應(yīng)組成的多步反應(yīng)。酶動力學(xué)：研究酶促反應(yīng)速率及其影響因素的科學(xué)。（二）化學(xué)反應(yīng)的速率方程許多化學(xué)反應(yīng)是可逆反應(yīng)。一般說，對于一個給定的化學(xué)反應(yīng)，僅知道其化學(xué)計量方程并不能給出速率表達式，速率方程（或稱動力學(xué)方程式）必須由實驗來確定。

但對基元反應(yīng)，可根據(jù)其化學(xué)計量方程直接寫出速率方程[式]

。如：

aA+bB→cC+dD其速率方程為v=k[A]a[B]b

（三）反應(yīng)分子數(shù)和反應(yīng)級數(shù)反應(yīng)的分子數(shù)：在基元反應(yīng)中，同時參與相互碰撞并形成過渡態(tài)復(fù)合體的分子（原子、離子或自由基）數(shù)，其值是正整數(shù)。反應(yīng)級數(shù)：速率方程中反應(yīng)物濃度的指數(shù)或指數(shù)之和。級數(shù)通過實驗求得，可以是整數(shù)、分?jǐn)?shù)或負數(shù)。單分子反應(yīng)：一級雙分子反應(yīng)：二級（最常見）

三分子反應(yīng)：三級（很少有）

（四）一級、二級和零級反應(yīng)的特征

1.一級反應(yīng)

反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度的一次方成正比

如單底物和單產(chǎn)物反應(yīng)S→P，v=k[S]

2.二級反應(yīng)反應(yīng)速率與兩種反應(yīng)物濃度的乘積或一種反應(yīng)物濃度的二次方成正比如同種雙分子底物反應(yīng)2S→P，v=k[S]2

異種雙分子底物反應(yīng)A+B→P，v=k[A][B]3.零級反應(yīng)反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度無關(guān)二、影響酶促反應(yīng)速率的因素酶濃度[E]底物濃度[S]反應(yīng)溫度pH值激活劑抑制劑v0[E]o在有足夠底物和其他條件不變、無任何不利因素的情況下：

v0=k[E]（一）酶濃度對酶促反應(yīng)速率的影響1、底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響

v0Vm0.30.2Vm20.1012345678[S][S]與vo關(guān)系：當(dāng)[S]很低時，[S]

與vo

成比例--一級反應(yīng)當(dāng)[S]較高時，[S]

與vo

不成比例-混合級反應(yīng)當(dāng)[S]很高時，[S]

，vo不變--零級反應(yīng)（二）底物濃度對酶促反應(yīng)速率的影響用中間產(chǎn)物學(xué)說解釋底物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系曲線的二相現(xiàn)象：S+EESE+P當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r，有多余的酶沒與底物結(jié)合，隨著底物濃度的增加，有更多的中間絡(luò)合物生成，因而反應(yīng)速度也不斷增高。當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r，體系中的酶全部與底物結(jié)合成中間產(chǎn)物，雖增加底物濃度也不會有更多的中間產(chǎn)物生成，因而反應(yīng)速度幾乎不變。k1k2k32.米氏方程式（Michaelis-Mentenequation）

LeonorMichaelis

和MaudMenten（1913）根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說推導(dǎo)了能夠表示整個反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的公式，稱為米氏（米－曼氏）方程式：v0=Vmax[S]Km+[S]米氏方程的三個假設(shè)中間產(chǎn)物學(xué)說：

E

+

S

ES

E

+

P（1）反應(yīng)開始，[P]很低，由P+EES可忽略不計，即：

E

+

S

ES

E

+

P

k1k2k3k4k1k2k3（2）E+

SES為快速反應(yīng)(快速平衡假說)（3）ESE+P為慢速反應(yīng)(限速步驟),

反應(yīng)速率v0決定于最慢的一步即K3米氏方程推導(dǎo)過程:

E+

S

ES

E

+

P

[E][S][ES][E]

游離酶濃度[E]=[E]t

-

[ES]ES生成速度v1=k1[E][S]ES分解速度v2=k2[ES]+k3[ES]

當(dāng)穩(wěn)態(tài)時：ES生成速度=ES分解速度

v1=

v2

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]＝(k2+k3)[ES]k1k2k3∴[E][S]

k2+k3[ES]k1=

令

k2+k3

k1=Km,

則[E][S][ES]=Km（1）

用[E]t代表酶的總濃度，則[E]t

＝[E]＋[ES]

∴[E]＝[E]t

－[ES]

（2）

將（2）代入（1），得（[E]t

－[ES]）[S][ES]=Km整理得：因為酶促反應(yīng)速度v0

由有效的酶濃度（即[ES]

）決定，所以v0=k3[ES][ES]＝[E]t

[S]Km＋[S](3)v0∴[ES]=

k3(4)將（4）代入（3），得v0k3＝[E]t

[S]Km＋[S]∴v0=

k3[Et][S]Km＋[S](5)當(dāng)所有的酶被底物飽和時，所有的酶都以ES形式存在，即[Et]=[ES]，此時即達到最大反應(yīng)速度Vmax。所以

Vmax=k3[Et](6)

將（6）代入（5）即得：v0=Vmax

[S]Km

+

[S]（7）

或

Km=[S](———

－1)（8）Vmaxv0或v0=——————

（9）1＋——VmaxKm[S]Km=[S]3.米氏常數(shù)的意義當(dāng)v0

=?Vmax

時

?Vmax=Km+[S]Vmax[S]可見，Km的涵義（物理意義）是當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度。其單位是濃度單位，一般以mol/L或mmol/L表示。v0=Vmax

[S]Km

+

[S]米氏常數(shù)意義：（1）Km是酶的一個特征性常數(shù)。

Km大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。

Km值隨測定的底物、反應(yīng)的溫度、pH和離子強度而改變。

一個酶在一定條件下，對某一底物有一定的Km值，故通過測定Km的數(shù)值，可鑒別酶。

大多數(shù)酶的Km值介于10-6~10-1mol/L之間。（2）從Km可判斷酶的專一性和天然底物。當(dāng)酶可作用于幾種底物時，Km最小的底物通常就是該酶的最適底物，也就是天然底物。

Km

愈小，達到最大反應(yīng)速度一半所需要的底物濃度就愈小，即底物與酶的親和力愈大。

Km值隨不同底物而異的現(xiàn)象可以幫助判斷酶的專一性，并且有助于研究酶的活性部位?！逰m=（k2+k3)/k1Km≈k2/k1∴Km可以看作ES的解離常數(shù)ks

：Km=ks=————[S][E][ES]Km大，說明ES容易解離，酶與底物結(jié)合的親和力小；Km小，則說明酶與底物的親和力大。

（3）當(dāng)k2＞＞k3時，km的大小可以近似地表示酶與底物的親和力大小。S+EESE+Pk1k2k3（4）從Km的大小，可以知道正確測定酶活力時所需的底物濃度。v0[S]1000km0.999Vmax100km0.99Vmax10km0.91Vmax3km0.75Vmax1km0.50Vmax0.33km0.25Vmax0.10km0.091Vmax從米氏方程中求得：當(dāng)反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度的90%，則90%Vmax=100%Vmax[S]/(km+[S])v0=—————Vmax·[S]km+[S]即[S]=9km在進行酶活力測定時，通常用4km的底物濃度即可（v0=0.8Vmax）。（5）Km可以幫助推斷某一代謝物在體內(nèi)可能的代謝途徑。丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛乳酸脫氫酶（1.7×10-5）丙酮酸脫氫酶（1.3×10-3）丙酮酸脫羧酶（1.0×10-3）當(dāng)丙酮酸濃度較低時，代謝走哪條途徑?jīng)Q定于Km最小的酶。(∵只有Km

值小的酶反應(yīng)比較占優(yōu)勢)√4.解讀Vmax，kcat

和kcat/Km1）

Vmax

在一定酶濃度下，酶對特定底物的Vmax也是一個常數(shù)。但在現(xiàn)實條件下，一個酶促反應(yīng)很難達到或者根本達不到此值。隨著底物濃度的增加，v0

只能接近此值。2）kcat

——稱為酶的催化常數(shù)或轉(zhuǎn)化數(shù)

kcat，具體是指在單位時間內(nèi)，一個酶分子將底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的分子總數(shù),是酶的最大催化活力的量度。kcat的單位是時間-1

，如min-1

或s-1。

如果一個酶遵守米氏方程，則kcat＝k3＝Vmax/Et。3）kcat/Km——催化效率指數(shù)或?qū)Ｒ恍灾笖?shù)

kcat/Km通常被用來衡量酶的催化效率,可以表示一個酶的催化效率或者完美程度。大的kcat和（或）小的Km將給出大的kcat/Km值。米氏常數(shù)可根據(jù)實驗數(shù)據(jù)作圖法直接求得：先測定不同底物濃度的反應(yīng)初速度，從v與[S]的關(guān)系曲線求得Vmax

，然后再從1/2Vmax求得相應(yīng)的[S]即為Km。（只能得到Vmax和Km近似值）5、Km值與Vmax值測定通常用Lineweaver-Burk作(林-貝氏)作圖法（雙倒數(shù)作圖法）測定酶促反應(yīng)的Km和Vmax。（y=ax+b）

1v0斜率=km/Vmax1/[S]1/v01/Vmax-1/kmEadie-Hofstee作圖Eadie-Hofstee作圖（三）pH對酶促反應(yīng)速率的影響2.最適pH

1.pH穩(wěn)定性－－酶表現(xiàn)最大活力的pH值。在一定的pH范圍內(nèi)酶是穩(wěn)定的。一些酶的最適pH值

酶最適pH胃蛋白酶1.8過氧化氫酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.8酶的最適pH只在一定條件下才有意義－－

酶的最適pH不是固定的常數(shù),其數(shù)值受酶的純度、底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度等影響pH影響酶活力的原因：

1.環(huán)境過酸、過堿可使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶變性失活；

2.pH改變能影響酶分子活性部位上有關(guān)基團的解離，從而影響與底物的結(jié)合或催化；

3.pH影響底物有關(guān)基團的解離。（四）溫度對酶促反應(yīng)速率的影響兩種不同影響：

1.溫度升高，反應(yīng)速度加快；

2.溫度升高，熱變性速度加快。Tv0最適溫度

酶的最適溫度:在一定條件下，酶表現(xiàn)最大活力時的溫度。酶的最適溫度不是一個固定的常數(shù)，其數(shù)值受底物種類、作用時間等因素影響而改變。（五）激活劑對酶促反應(yīng)速率的影響——凡能提高酶活力的物質(zhì)都稱之為該酶的激活劑。如Cl-是唾液淀粉酶的激活劑。激活劑無機離子大多為金屬離子:如K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+等少數(shù)為陰離子:如Cl-,Br-,I-,CN-,PO43-等小分子有機物：如Vc,Cys,GSH,膽汁酸鹽等生物大分子：如蛋白激酶，激活酶原的蛋白酶等激活劑的作用特點—選擇性、拮抗性、可替代性、濃度依賴性、多機制性（六）抑制劑對酶促反應(yīng)速率的影響——使酶的必需基團或活性部位中的基團的化學(xué)性質(zhì)改變而降低酶活力甚至使酶喪失活性的物質(zhì)，稱為抑制劑（inhibitor,I）。

由抑制劑所引起的酶活力降低或喪失稱為抑制作用（inhibition）。凡可使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用稱為失活作用（inactivation）。不可逆抑制作用

(

irreversibleinhibition

）抑制劑與酶的結(jié)合（共價鍵）是不可逆的，不能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑使酶恢復(fù)活性。S+EESE+P

+I↓EIROO-ROO-ROXROO—EP+E—OHP+HX有機磷化合物羥基酶磷酰化酶(失活)例1：羥基酶的抑制

羥基酶:有絲氨酸側(cè)鏈上的羥基為必需基團的酶

有機磷(敵百蟲,敵敵畏,對硫磷)不可逆抑制羥基酶的活性

常見的這類羥基酶如：胰凝乳蛋白酶，乙酰膽堿酯酶二異丙基氟磷酸沙林，學(xué)名甲氟膦酸異丙酯，英文名稱SarinSHSE+Hg2+EHg+2H+SHS

SHClSE+As-CH=CHClEAs-CH=CHCl+2HClSHClS巰基酶路易士氣

(氯化雙氯乙烯基胂)例2：巰基酶的抑制E-SH+ICH2COOH→E-S-CH2COOH+HI碘乙酸、碘乙酰胺、對-氯汞苯甲酸(有機汞)、有機砷化合物是對巰基酶的不可逆抑制劑

SEHg+

SCOONaCHSHCHSHCOONa

SHE+Hg

SHCOONaCHSCHSCOONa二巰基丁二酸鈉

SCH2OHSHCH2OHEAs-CH=CHCl+CHSHE+CHS

SCH2SHSHCH2SAs-CH=CHCl二巰基丙醇解毒方法：例3：自殺性抑制劑（suicideinhibitor）

酶的自殺性抑制劑可以作為酶的底物與酶活性中心相結(jié)合，生成酶-底物復(fù)合物，并接受酶的催化作用，完成正常反應(yīng)的前幾步。然而，經(jīng)催化后的中間產(chǎn)物不游離出產(chǎn)物，而是轉(zhuǎn)化為酶的抑制劑，進一步與酶活性中心共價結(jié)合，對酶產(chǎn)生抑制作用。由于這類抑制劑“冒充”底物與酶結(jié)合并受到酶的激活而抑制酶活性，故又被稱為特洛伊木馬(trojanhorse)抑制劑。

青霉素屬于自殺性底物抑制劑。E+SES

E·IE-I

一些重要的不可逆抑制劑

?有機磷化合物

?有機汞、有機砷化合物

?重金屬鹽

Ag+

、Cu2+

、Hg2+

、Pb2+

、Fe3+

在高濃度時可使酶蛋白變性失活；低濃度時對酶活性產(chǎn)生抑制（—可通過加入EDTA、Cys等螯合劑解除）。

?烷化試劑

碘乙酸、碘乙酰胺、2,4-二硝基氟苯

?氰化物、硫化物和CO

與酶中金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物

?青霉素

抑制細菌糖肽轉(zhuǎn)肽酶Ser-OH活性,影響細胞壁合成2.可逆抑制作用(reversibleinhibition)

抑制劑與酶以非共價鍵結(jié)合引起酶活性的降低或喪失,結(jié)合是可逆的,能夠通過透析、超濾等物理方法使酶恢復(fù)活性。抑制程度由酶與抑制劑之間的親和力大小、抑制劑的濃度以及底物的濃度決定。

可采用動力學(xué)方法鑒別可逆抑制作用和不可逆抑制作用[E]v0abca.反應(yīng)體系中不加I。b.反應(yīng)體系中加入一定量的不可逆抑制劑。c.反應(yīng)體系中加入一定量的可逆抑制劑。圖可逆/不可逆抑制劑的區(qū)別(一)[E]v0不可逆抑制劑的作用(b)[E]v0可逆抑制劑的作用(a)[I]→[I]圖可逆/不可逆抑制劑的區(qū)別(二)(1)競爭性抑制(competitiveinhibition)

概念抑制劑（I）與底物（S）競爭酶的活性中心（結(jié)合部位）,從而影響底物與酶的正常結(jié)合，降低了酶的催化活力?？赡嬉种祁愋停焊偁幮砸种?competitiveinhibition)非競爭性抑制（non-competitiveinhibition）反競爭性抑制（uncompetitiveinhibition）SSEEIIEE+P無I

有I

競爭性抑制的底物濃度曲線（Michaelis-Menten

圖）v0競爭性抑制作用過程[S]不反應(yīng)競爭性抑制的動力學(xué)方程:v0=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]1v0=Km

Vmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax競爭性抑制的特征曲線：

[I]正常1v01[S]1Vmax-1Km(1+)[I]Ki-1Km競爭性抑制的特點：I與S分子結(jié)構(gòu)相似；Vmax不變，表觀Km增大；抑制程度取決于I與E的親和力，以及[I]和[S]的相對濃度比例，能用增大[S]的辦法克服。

COOHCH2CH2COOH琥珀酸脫氫酶+FAD+FADH2

COOHCHHCCOOH琥珀酸延胡索酸

對氨基苯甲酸二氫蝶呤FH2FH4

谷氨酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸還原酶對氨基苯磺酰胺(I)氨甲蝶呤(I)例：

COOHCH2COOH丙二酸（-）鳥氨酸或賴氨酸競爭性抑制精氨酸酶的作用。競爭性抑制舉例－－乙醇治療甲醇、乙二醇中毒利用乙醇治療甲醇中毒的原理，就是競爭性抑制作用。甲醇本身只有輕度毒性，但肝臟中的醇脫氫酶將它轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨拘缘募兹恍枭倭考兹┘纯蓪?dǎo)致失明和死亡。乙醇與甲醇競爭結(jié)合肝臟醇脫氫酶的活性中心，因而能減緩由甲醇產(chǎn)生甲醛（乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)楹苋菀状x掉的乙醛）。于是，通過靜脈注射一定量乙醇，大部分甲醇將在轉(zhuǎn)變成甲醛之前，就從尿中排出體外而不傷害人體。(乙二醇在體內(nèi)經(jīng)酶促途徑轉(zhuǎn)變成有毒的草酸(乙二酸)。)競爭性抑制作用的可能機制：?

－－－底物與抑制劑結(jié)合在酶分子的同一部位上

－－－底物或抑制劑中的一個與酶結(jié)合后，引起酶構(gòu)象的變化，而不利于與另一個結(jié)合（2）非競爭性抑制(non-competitiveinhibition)

概念

底物和抑制劑同時結(jié)合在酶的不同部位上,兩者沒有競爭作用，互不干擾，但形成的ESI不能進一步轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。傳統(tǒng)上稱作非競爭性抑制，也稱之為純非競爭性抑制。

非競爭性抑制作用過程：

SSEEEE

+PSESIIII[S]v0無I有I(′)km非競爭性抑制的底物濃度曲線V/2v0=———————Vmax1+[I]/ki·[S]km+[S]————非競爭性抑制的動力學(xué)方程:1v0=Km

Vmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax（1+）[I]Ki非競爭性抑制的特征曲線：1v0正常

[I]1[S]-1Km1Vmax(1+)[I]Kiv0=———————————Vmax1+[I]/ki·[S]km+[S]非競爭性抑制的特點：1、I與S分子結(jié)構(gòu)不同；2、Vmax

減小，表觀Km不變；3、抑制程度取決于[I]大小，不能用增大[S]的辦法克服。例：1、某些含Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+及F-、CN-、N3-

的化合物、EDTA等與酶活性中心以外的-SH等基團反應(yīng)，酶分子的空間構(gòu)象改變，引起的抑制2、質(zhì)子化的叔胺（R3NH+）對乙酰酯酶的抑制非競爭性抑制作用的可能機制：?

－－抑制劑作用于酶活性部位中的催化基團

－－抑制劑與維持酶分子構(gòu)象的必需基團作用，使酶的活性降低

純非競爭性抑制在實際中很少遇到，多數(shù)情況是Ｅ與Ｉ的結(jié)合與Ｅ和Ｓ的結(jié)合互有影響，被稱作混合型非競爭性抑制或混合型抑制(mixedinhibition)。

混合型抑制的動力學(xué)方程和雙倒數(shù)作圖均與（純）非競爭性抑制的情況不同：不可逆失活類似非競爭性抑制作用

如果一種抑制劑與酶不可逆結(jié)合，則該抑制劑被歸類為失活劑（inactivator）。

失活劑確實在所有[S]值上降低有效的[E]T水平，因而也降低Vmax，而不改變Km。所以,不可逆失活作用的雙倒數(shù)作圖與非競爭性抑制作用的作圖相似（直線在1/[S]軸上相交）。化學(xué)修飾酶特定氨基酸殘基的試劑可作為酶的失活劑。反競爭性抑制（uncompetitiveinhibition）

概念

抑制劑僅與酶和底物的中間復(fù)合物結(jié)合而抑制酶活性。

反競爭性抑制作用過程：

EEE+PEIISSS反競爭性抑制作用－－抑制劑必須在酶與底物結(jié)合后才能進一步形成ESI復(fù)合物。[S]v0km′kmVmax2′Vmax2反競爭性抑制的底物濃度曲線v0

=Vmax1+—[I]ki·[S]km1+——[I]ki+[S]反競爭性抑制的動力學(xué)方程:v0=Vmax

[S]Km+(1+[I]/Ki)[S]1v0

=Km

Vmax(1+)[I]Ki1[S]1Vmax反競爭性抑制的特征曲線：

[I]正常1v0

1[S]1Vmax-1Km[I]Ki+(1+)-1Km1Vmax(1+)[I]Ki反競爭性抑制的特點：1、I與S分子結(jié)構(gòu)不同,I只與ES結(jié)合2、Vmax

和表觀Km都減?。唬ù嬖贗時，不僅不排斥E和S的結(jié)合，反而增加二者的親和力，這與競爭性抑制作用恰恰相反）3、抑制程度取決于[I]和[ES]二者的濃度，不能用增大[S]的辦法克服。

例如：肼類化合物對胃蛋白酶、氰化物對芳香硫酸酯酶的抑制反競爭性抑制作用的可能機制：?

－－抑制劑（I）只與ES復(fù)合物結(jié)合的現(xiàn)象，可能是底物與酶的結(jié)合改變了酶的構(gòu)象，或抑制劑直接與和酶鍵合在一起的底物反應(yīng)

－－反競爭性抑制劑不影響酶與底物的結(jié)合，但它可能使活性中心變形，從而導(dǎo)致酶的催化失活競爭性抑制作用總結(jié)：3種可逆抑制作用圖示競爭性抑制劑只同自由（游離）酶結(jié)合非競爭性抑制作用非競爭性抑制劑既能同自由酶結(jié)合又能同ES結(jié)合反競爭性抑制作用反競爭性抑制劑只能同ES結(jié)合總結(jié)：不同類型可逆抑制作用的米氏方程和常數(shù)類型方程式Vmax

Km無抑制劑競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制v0=Vmax

·

[S]Km

+

[S]v0=Vmax

·

[S]Km(1+)

+

[S][I]Kiv0=Vmax

·[S](Km

+

[S])(1+)

v0=Vmax

·

[S]Km

+

[S][I]Ki(1+)

[I]KiVmaxKm不變不變增加減小減小減小雙底物雙產(chǎn)物反應(yīng)在酶促反應(yīng)中是占優(yōu)勢的反應(yīng)。A+B P+Q

雙底物雙產(chǎn)物的反應(yīng)按動力學(xué)機制可分為兩大類:雙底物雙產(chǎn)物的反應(yīng)序列反應(yīng)（sequentialreactions）乒乓反應(yīng)（pingpongreactions）有序反應(yīng)（orderdreactions）隨機反應(yīng)（randomreactions）三、多底物的酶促反應(yīng)※一個多底物酶的動力學(xué)機制僅僅是指底物與酶結(jié)合的次序和產(chǎn)物從酶釋放的次序1．序列隨機反應(yīng)（randomreactions，

寫作RandomBiBi）2．序列有序反應(yīng)（orderedreactions

寫作orderedBiBi）

3．乒乓反應(yīng)（pingpongreactions，寫作uni

uni

uni

unipingpongorPingPongBiBi）第七節(jié)酶的作用機制一、活性部位和必需基團必需基團：酶分子中直接或間接與酶催化活性相關(guān)的某些氨基酸殘基的功能基團。－－這些基團若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失?；钚圆课?activesite)：酶分子中直接與底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。－－它是酶行使催化功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。必需基團活性部位維持酶的空間構(gòu)象結(jié)合基團催化基團專一性催化性質(zhì)酶活性部位的特點1.活性部位在整個酶分子中只占很小的一部分2.活性部位是一個三維實體3.底物通過較弱的鍵結(jié)合到酶分子上形成酶和底物的復(fù)合物（ES）4.酶的活性部位是酶分子表面的一個裂隙或裂縫(－－在所有已知結(jié)構(gòu)的酶中都是位于酶分子的表面呈裂縫狀)5.活性部位有結(jié)合底物的專一性--主要是誘導(dǎo)契合6.酶活性部位具有柔性或可運動性Bindingofasubstratetoanenzymeatthe

activesite(胰凝乳蛋白酶)胰凝乳蛋白酶活性部位三維結(jié)構(gòu)圖酶的活性中心示意圖一些酶活性中心的氨基酸殘基酶殘基總數(shù)活性中心殘基牛胰核糖核酸酶124His12,His119,Lys41溶菌酶129Asp52,Glu35牛胰凝乳蛋白酶245His57,Asp102,Ser195牛胰蛋白酶238His46,Asp90,Ser183木瓜蛋白酶212Cys25,His159

彈性蛋白酶240His45,Asp93,Ser188枯草桿菌蛋白酶275His46,Ser221碳酸酐酶258His93-Zn-His95His117

酶活性部位的確定方法

共價修飾

親和標(biāo)記

Ｘ射線晶體分析二、酶促反應(yīng)機制（催化機理）（一）基元催化的分子機制基元催化是由某些基團或小分子催化反應(yīng)，包括酸堿催化、共價催化、金屬離子催化等。

在酶催化反應(yīng)中，常常是若干基元催化反應(yīng)配合共同起作用。閱讀：酶催化機理研究的主要方法

P.1511.廣義的酸堿催化

——通過暫時性地向底物提供質(zhì)子或從底物接納質(zhì)子以穩(wěn)定過渡態(tài)的一種催化機制。

酶（蛋白質(zhì)）分子中起酸或堿催化的功能基團有氨基、羧基、咪唑基、巰基和酚基。影響酸堿催化速度的2種因素:(1)酸或堿的強度(pK);(2)質(zhì)子傳遞速度。

His的咪唑基最活躍。

酶活性部位上的某些基團可以做為良好的質(zhì)子供體或受體對底物進行酸堿催化。酶活性中心廣義酸堿基團

氨基酸殘基廣義酸的形式（質(zhì)子供體）廣義堿的形式（質(zhì)子受體）2.共價催化酶可以和底物生成不穩(wěn)定的共價中間物，這種共價中間物進一步生成產(chǎn)物要比非催化反應(yīng)容易得多。

Lewis的酸堿電子理論:酸是可以接受電子對的物質(zhì)，是親電物質(zhì)；而堿則是可以提供電子對的物質(zhì)，是親核物質(zhì)。共價催化又稱親核或親電子催化，實際上也是酸堿催化。?

酶中參與共價催化的基團主要包括

His的咪唑基,Cys

的巰基,Asp的羧基,Ser的羥基等。?

某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用。

Ser-OH—CH2—S：H—CH2—O··：HCys-SH—CH2—C=CHHNNCH：His-咪唑基親核基團(堿)親電基團(酸)··3.金屬離子催化

金屬離子在金屬酶、金屬激活酶中的一個作用是作為親電催化劑穩(wěn)定反應(yīng)時形成的負電荷，以利于底物進入過渡態(tài)。金屬酶：含有緊密結(jié)合的金屬離子，多數(shù)為過渡金屬，如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+金屬激活酶：與溶液中的金屬離子松散地結(jié)合，通常是堿金屬或堿土金屬，例如Na+、K+、Mg2+或Ca2+底物與酶的活性中心相互誘導(dǎo)契合形成過渡態(tài)化合物，過渡態(tài)與酶的活性中心以次級鍵(氫鍵、離子鍵、疏水鍵)相結(jié)合，這一過程是釋能反應(yīng)，所釋放的能量稱為結(jié)合能(binding

energy)。結(jié)合能可以抵消一部分活化能，是酶反應(yīng)降低活化能的主要能量來源。

酶不能使底物形成過渡態(tài)，則沒有結(jié)合能的釋放，也就不能催化反應(yīng)的進行。（二）酶具有高催化能力的原因鄰近定向效應(yīng)酶與底物結(jié)合成中間產(chǎn)物過程中,底物分子密集到活性中心區(qū),并使活性中心的催化基團與底物的反應(yīng)基團之間正確定向排列所產(chǎn)生的效應(yīng)。

簡言之，鄰近與定向效應(yīng)增加了酶與底物的接觸機會和有效碰撞。在酶促反應(yīng)中，底物分子結(jié)合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，使分子間反應(yīng)近似于分子內(nèi)的反應(yīng)，有利于提高反應(yīng)速度；另一方面，由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，為分子軌道交叉提供了有利條件；使底物進入過渡態(tài)時的熵變負值減小，反應(yīng)活化能降低，從而大大地增加了酶－底物中間產(chǎn)物進入過渡態(tài)的幾率，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點。酶AB

鄰近與定向作用

誘導(dǎo)契合與底物形變底物與酶的結(jié)合，不僅誘導(dǎo)酶分子發(fā)生構(gòu)象變化,同樣底物分子也會發(fā)生扭曲變形,使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“張力”,甚至“形變”，某些鍵的鍵能減弱,從而促進酶-底物中間產(chǎn)物進入過渡態(tài)（降低了反應(yīng)活化能）。

（--底物形變是誘導(dǎo)契合產(chǎn)生的主要效應(yīng)）3.電荷極化和多元催化

電荷極化為基元催化提供了催化基團，包括廣義酸堿、親核劑、親電劑和金屬離子。（--靜電催化）

誘導(dǎo)契合為基元催化創(chuàng)造了空間條件：把催化基團定位于底物的敏感鍵。

在酶促反應(yīng)中，常常是若干基元催化反應(yīng)配合共同起作用。4.疏水微環(huán)境的影響活性中心的疏水區(qū)域?qū)λ肿拥呐懦?、排斥，有利于酶與底物的接觸。須注意：上述加速酶促反應(yīng)的諸因素，不是同時在一種酶中起作用。即：不同的酶，起作用的主要因素是不一樣的，每種酶都有自己的特點。舉例－－某些酶的活性中心及其作用機理（一）溶菌酶（lysozyme）1922年Fleming在鼻黏液中發(fā)現(xiàn)一種具有溶解細菌能力的酶，定名為溶菌酶。隨后又在雞蛋清中發(fā)現(xiàn)了這種酶，是自然界分布很廣的一種酶。酶分子特征：

1條肽鏈129AA,4個-S-S-作用：水解細菌胞壁多糖

N-乙酰基葡萄糖——NAG細菌胞壁多糖

N-乙?；谒帷狽AM主要催化因素:●Glu35提供一質(zhì)子對底物進行酸堿催化；

●

酶使底物分子的糖環(huán)發(fā)生形變（椅式→半椅式）溶菌酶和底物的復(fù)合物溶菌酶酸、堿催化反應(yīng)示意圖（二）羧肽酶A（carboxypeptidaseA）作用：催化肽鏈C端肽鍵水解主要催化因素：

●

“鄰近”、“定向效應(yīng)”；

●酶與底物的“誘導(dǎo)契合”；

●

Glu270、Zn2+對底物敏感肽鍵產(chǎn)生的電子張力。羧肽酶A非共價調(diào)節(jié)----酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)共價調(diào)節(jié)不可逆共價調(diào)節(jié)——酶原的激活可逆共價調(diào)節(jié)——酶的共價修飾酶活性的調(diào)節(jié)控制第八節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)

別構(gòu)酶(allostericenzyme):具有別構(gòu)效應(yīng)的酶。

別構(gòu)酶通常能對反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用，是調(diào)節(jié)酶的一種。酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)別構(gòu)效應(yīng)：底物或底物以外的物質(zhì)和別構(gòu)酶分子上的相應(yīng)部位可逆地非共價結(jié)合后，通過酶分子構(gòu)象的變化影響酶的催化活性，這種效應(yīng)稱為別構(gòu)效應(yīng)

別構(gòu)效應(yīng)劑：引起別構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)。

一、酶活性的別構(gòu)調(diào)節(jié)別構(gòu)激活劑：凡是和酶分子結(jié)合后使酶反應(yīng)速度加快的別構(gòu)效應(yīng)劑（亦稱正效應(yīng)劑）別構(gòu)抑制劑：（亦稱負效應(yīng)劑）★別構(gòu)酶的主要特點：

●1.一般是寡聚酶；

別構(gòu)酶的組成：兩個部位活性部位:與底物結(jié)合并完成催化作用調(diào)節(jié)部位:與別構(gòu)效應(yīng)劑結(jié)合,調(diào)節(jié)酶活性同促效應(yīng)：底物分子本身對別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)作用異促效應(yīng)：非底物分子的調(diào)節(jié)物對別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)作用●

2.具有別構(gòu)效應(yīng)；兩個部位的位置在不同亞基上（通常）在同一亞基的不同部位上正效應(yīng)劑通常是別構(gòu)酶的底物負效應(yīng)劑一般是代謝反應(yīng)序列的終產(chǎn)物協(xié)同效應(yīng)：指一個配體與酶蛋白結(jié)合后，可以影響另一配體與酶蛋白的結(jié)合正協(xié)同效應(yīng)：指一分子配體與酶結(jié)合后可促進下一分子配體的結(jié)合，使酶對配體的親和力增高，即酶愈飽和對配體的結(jié)合愈容易負協(xié)同效應(yīng)：指一分子配體與酶結(jié)合后可使酶對下一分子配體的親和力降低，即酶愈飽和對配體的結(jié)合愈困難。

負協(xié)同效應(yīng)可以使酶的反應(yīng)速率對外界環(huán)境中底物濃度的變化不敏感?！?/p>

3.v0對[S]作圖不服從米－曼氏關(guān)系式，不呈直角雙曲線，而是S形曲線（正協(xié)同）或表觀雙曲線（負協(xié)同）。典型的別構(gòu)酶催化的反應(yīng)速率與底物濃度的S型曲線別構(gòu)酶與非調(diào)節(jié)酶動力學(xué)曲線的比較Rs=[S]0.9[S]0.11、非調(diào)節(jié)酶(米氏酶)；2、正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶3、負協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶典型的米氏酶

Rs=81具有正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶

Rs<81具有負協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶

Rs>81n為Hill系數(shù)（又稱協(xié)同系數(shù)）符合米氏方程的酶(不具協(xié)同性)

n=1具有正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶

n>1具有負協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶

n<1協(xié)同指數(shù)（飽和比值）：Rs=位點被90%飽和時的底物濃度(S90%Vmax)位點被10%飽和時的底物濃度(S90%Vmax)=811/n由米氏方程有所以，符合米氏方程動力學(xué)的非別構(gòu)酶的Rs=81v0

=Vmax[S]Km+[S]所以有v0=0.9Vm

=Vm[S]0.9Km+[S]0.9即有[S]0.9=9km同理[S]0.1=19km別構(gòu)酶協(xié)同性配體結(jié)合的模型

(解釋酶協(xié)同效應(yīng)的假說)主要有兩個學(xué)說：

齊變模型(協(xié)調(diào)模型，MWC模型)

由J.Monod,J.Wyman和J.P.Chengeux

提出，所以以三人名字的首字母命名

序變模型(漸變模型，KNF模型)

由D.Koshland等三人提出，也是以三人名字的首字母命名齊變模型別構(gòu)酶的所有亞基或者全部呈堅固緊密的、不利于結(jié)合底物的“T”狀態(tài)；或者全部是松散的、有利于結(jié)合底物的“R”狀態(tài)。這兩種狀態(tài)間的轉(zhuǎn)變對于酶的每個亞基是同時、同步的。齊變模型能夠很好地說明同促正協(xié)同效應(yīng)和異促正、負協(xié)同效應(yīng)，但不能說明同促負協(xié)同效應(yīng)序變模型

1.別構(gòu)酶的每個亞基具有兩種構(gòu)象狀態(tài)(R和T);2.配體不存在時,別構(gòu)酶只有一種構(gòu)象狀態(tài)存在(T態(tài))。只有結(jié)合配體后才誘導(dǎo)T態(tài)向R態(tài)轉(zhuǎn)變;3.別構(gòu)酶的構(gòu)象以序變方式進行,而不是齊變;4.在一個亞基中結(jié)合底物所引起的構(gòu)象改變可以增加或減少同一分子中其他亞基的底物結(jié)合親和性,既可能是正協(xié)同效應(yīng),也可能是負協(xié)同效應(yīng)。非底物調(diào)節(jié)的效應(yīng),用序變模型說明較好。序變模型能夠解釋同促正、負協(xié)同效應(yīng)和異促正、負協(xié)同效應(yīng)，但難于象齊變模型那樣建立數(shù)學(xué)模型不論那一個模型都難解釋所有變構(gòu)酶這些模型都顯過于簡單，目前尚缺乏更好的學(xué)說。別構(gòu)酶舉例——大腸桿菌（E.coli）天冬氨酸

轉(zhuǎn)氨甲酰酶（簡稱ATCase）

ATCase有二個底物和CTP、ATP二個別構(gòu)效應(yīng)劑－－Asp、ATP是別構(gòu)激活劑，CTP是別構(gòu)抑制劑ATCase（天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶）ATCase的相對分子質(zhì)量是310000，由12條多肽鏈組成（雜多聚酶）每個調(diào)節(jié)亞基上有兩個別構(gòu)效應(yīng)劑（CTP、ATP）的結(jié)合部位完整有活性的酶催化亞基（三聚體）調(diào)節(jié)亞基（二聚體）ATCase中的亞基排列俯視垂直底物、CTP、ATP都可以使ATCase產(chǎn)生別構(gòu)效應(yīng)——ATP是激活劑、CTP是抑制劑[Asp]v

別構(gòu)激活劑會使曲線更接近雙曲線，但是只降低K0.5

而不改變Vmax，這樣就導(dǎo)致固定底物濃度下反應(yīng)速度的升高；

別構(gòu)抑制劑會增加K0.5，使底物飽和曲線更接近S形。中間的曲線為無調(diào)節(jié)物時的底物與酶活性的關(guān)系圖別構(gòu)酶的意義底物、CTP、ATP都是ATCase的別構(gòu)效應(yīng)劑，對于ATCase來說，即意味著它們可以通過別構(gòu)效應(yīng)影響它的催化能力（活性）

負協(xié)同效應(yīng)：對于保證體內(nèi)一些重要反應(yīng)穩(wěn)定連續(xù)地進行很有意義正協(xié)同效應(yīng)：對增強底物靈敏地調(diào)節(jié)酶活性很有意義別構(gòu)酶S形動力學(xué)曲線在細胞代謝中的意義－－可在一個狹窄的底物或調(diào)節(jié)物濃度范圍內(nèi)嚴(yán)格地控制酶的活力：（1）減少底物原料消耗（2）避免終末產(chǎn)物堆積（3）使底物濃度在曲線陡段最敏感總之，別構(gòu)酶是代謝過程中的關(guān)鍵酶，在代謝中起重要的調(diào)節(jié)作用；在生物體內(nèi)，它們一般是催化多酶體系反應(yīng)序列中的第一步反應(yīng)或是位于代謝途徑的分叉處。圖ATP和CTP對ATCase活性的調(diào)節(jié)

ATP和CTP作為別構(gòu)效應(yīng)物對ATCase活性調(diào)節(jié)的生理意義在于有利于平衡胞內(nèi)的嘌呤核苷酸庫和嘧啶核苷酸庫。別構(gòu)酶的脫敏作用受到任何一種變性因素的溫和作用，別構(gòu)酶通常能夠保持催化活性，但失去別構(gòu)性質(zhì)，稱為脫敏作用。脫敏后的酶表現(xiàn)為米氏酶的動力學(xué)。小結(jié)：別構(gòu)酶的性質(zhì)通常是寡聚酶具有別構(gòu)效應(yīng)物反應(yīng)速率-底物濃度曲線一般為S形溫和變性可導(dǎo)致別構(gòu)效應(yīng)的喪失--可脫敏與非別構(gòu)酶相比，別構(gòu)酶占少數(shù)二、酶活性的共價調(diào)節(jié)（一）酶的可逆共價修飾

可逆共價修飾：酶分子中的某些基團可在其他酶的催化下，共價結(jié)合某些化學(xué)基團；同時又可在另一種酶的催化下，將此結(jié)合上的化學(xué)基團去掉，從而影響酶的活性。酶的可逆共價修飾種類：

1.磷酸化（phosphorylation）

和去磷酸化（dephosphorylation）

2.甲基化（methylation）

和去甲基化（demethylation）

3.腺苷酰化（adenylation）

和去腺苷?；╠eadenylation）

4.尿苷?；?uridylation)

和去尿苷?；╠euridylation）

磷酸化和去磷酸化修飾是最常見的共價修飾

5.ADP-核糖基化(ADP-ribosylation)

和去ADP-核糖基化（ADP-deribosylation）

酶的磷酸化與去磷酸化

-OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi蛋白質(zhì)磷酸酶ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白磷酸化酶激活的級聯(lián)反應(yīng)共價修飾可引起級聯(lián)放大效應(yīng)

在一個連鎖反應(yīng)中，一個酶被磷酸化或去磷酸化激活后，后續(xù)的其他酶可同樣地依次被其上游的酶共價修飾而激活，引起原始信號的催化放大，這種多重共價修飾的連鎖反應(yīng)稱為級聯(lián)反應(yīng)（cascadereaction），所產(chǎn)生的效應(yīng)即所謂級聯(lián)放大（cascade

amplication）效應(yīng)。

級聯(lián)反應(yīng)的主要作用是產(chǎn)生快速、高效的放大效應(yīng)。

小結(jié)：酶的共價修飾和別構(gòu)調(diào)節(jié)的區(qū)別小結(jié)：酶的共價修飾和別構(gòu)調(diào)節(jié)的區(qū)別共價修飾調(diào)節(jié)：共價修飾系統(tǒng)能把調(diào)節(jié)物的效應(yīng)放大；有較大的生物學(xué)整合能力，能把胞內(nèi)的代謝和胞外的控制信號（包括電刺激）聯(lián)系起來。別構(gòu)調(diào)節(jié)：用于胞內(nèi)；在數(shù)秒或更短時間內(nèi)起作用（--最快的一種調(diào)節(jié)方式）（二）酶原的激活——不可逆共價調(diào)節(jié)沒有活性的酶的前體稱為酶原。酶原轉(zhuǎn)變成有活性的酶的過程稱為酶原的激活.該過程實質(zhì)上是酶活性部位形成和暴露的過程。舉例1.胰蛋白酶原的激活

胰蛋白酶是一個關(guān)鍵酶,胰臟中酶原(胰凝乳蛋白酶原,彈性蛋白酶原,羧肽酶原等)的激活都要通過胰蛋白酶的作用。在胰臟中存在著較豐富的胰蛋白酶抑制劑,抑制胰蛋白酶的活性。

酶原在胰臟中提早活化是胰腺炎的特征，嚴(yán)重的可以致命。

-S-S-X纈天天天天賴異甘纈組46絲183靜電吸引力或氫鍵腸肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶原-S-S-甘纈天天天天賴異纈絲胰蛋白酶SSSS組活性中心游離的六肽胰蛋白酶原的激活過程幾種蛋白酶的水解激活（胰凝乳蛋白酶）吸煙對α1-抗胰蛋白酶（應(yīng)稱為抗彈性蛋白酶）的損傷（甲硫氨酸亞砜）某些凝血因子的水解激活◆◆酶原與酶原激活的生理意義：

1.保護組織器官本身免受酶的水解破壞；

2.保證酶在特定時空發(fā)揮催化作用；

3.酶原可視作酶的儲存形式。

如：凝血和纖維蛋白溶解酶類以酶原的形式在血液循環(huán)中運行，一旦需要便不失時機地轉(zhuǎn)化為有活性的酶，發(fā)揮其對機體的保護作用。三、同工酶(isoenzyme)——能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但在蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶，稱為同工酶。酶蛋白差異源于：（1）編碼基因不同；（2）加工過程不同，導(dǎo)致相同基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA或翻譯產(chǎn)物不同。

1959年Markert首次用電泳分離法發(fā)現(xiàn)動物的乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)具有多種分子形式，并提出同工酶的概念。乳酸脫氫酶（LDH）同工酶:

LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5(H4)(H3M)(H2M2)(HM3)(M4)M

H乳酸脫氫酶（LDH）

由于不同分子形式同工酶的活性部位在結(jié)構(gòu)上相同或至少非常相似，使它們能夠催化相同的化學(xué)反應(yīng)。人體心肝和骨骼肌LDH同工酶譜組織器官

LDH1LDH2LDH3LDH4LDH5

（占總LDH活性的百分比）

心35~7028~452~160~60~5

肝0~82~103~336~2730~8

骨骼肌1~104~188~389~3640~97正常血清27.1±2.834.7±4.320.9±2.411.7±3.357±2.9

同工酶不僅存在于同一個體的不同組織中，甚至同一組織、同一細胞的不同亞細胞結(jié)構(gòu)中。???同工酶研究的意義：

1.是研究代謝調(diào)節(jié)、分子