生物化學(xué) 第六節(jié) 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)

第六節(jié)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的大小、形狀和分子量測(cè)定二、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性三、兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)四、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)五、蛋白質(zhì)的沉淀六、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)七、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)八、蛋白質(zhì)的紫外吸收特性蛋白質(zhì)的大小、形狀和分子量測(cè)定形狀：不對(duì)稱(chēng)常數(shù)分子量測(cè)定方法（1）分子篩層析法

Ve=k1-k2logM

（2）SDSlogM=k-aD

（3）生物質(zhì)譜

P89蛋白質(zhì)變性

與復(fù)性

●當(dāng)天然蛋白質(zhì)受到某些物理因素和化學(xué)因素的影響，使其分子內(nèi)部原有的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能都隨之改變或喪失，但并未導(dǎo)致其一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這種現(xiàn)象稱(chēng)為變性作用（denaturation）。

本質(zhì)：破壞了形成和穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的次級(jí)鍵導(dǎo)致空間構(gòu)象的改變和破壞。

表征：生物活性喪失；物理性質(zhì)（溶解度、粘度、擴(kuò)散系數(shù)、光譜特性等）和化學(xué)性質(zhì)（化學(xué)反應(yīng)，被酶解性）改變

應(yīng)用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老……

可逆變性：除去變性因素后，蛋白質(zhì)構(gòu)象可以恢復(fù)的

不可逆變性：構(gòu)象不能恢復(fù)的蛋白質(zhì)的復(fù)性●

蛋白質(zhì)的變性作用如果不過(guò)于劇烈，則是一種可逆過(guò)程，變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來(lái)的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象成為復(fù)性（renaturation）。

蛋白質(zhì)兩性解離性質(zhì)和等電點(diǎn)

pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+

同一分子中可帶有正、負(fù)兩種電荷，羧基帶負(fù)電而氨基帶正電，這種分子稱(chēng)兩性離子。蛋白質(zhì)和氨基酸一樣，在純水溶液和結(jié)晶狀態(tài)中都以?xún)尚噪x子形式存在。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定pH值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，凈電荷為0，在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI）。溶液pH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電；溶液pH<pI時(shí)，蛋白質(zhì)分子帶正電生理?xiàng)l件下

蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)

由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征?？扇苄缘鞍踪|(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對(duì)水有很高的親和性，通過(guò)水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水化層，同時(shí)這些顆粒帶有同種電荷，因而蛋白質(zhì)溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的親水膠體。蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用

透析法:利用蛋白質(zhì)不能透過(guò)半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達(dá)到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱(chēng)為透析（dialysis）。鹽析法:在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的硫酸銨、氯化鈉等中性鹽，可有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層。同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)表面的電荷，從而使蛋白質(zhì)顆粒集聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析（saltingout）。

鹽溶：加入少量中性鹽可增大蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)的沉淀

蛋白質(zhì)分子聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的沉淀。沉淀方法類(lèi)別:1、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶、分級(jí)沉淀）

2、酸鹼（等電點(diǎn)沉淀）

3、有機(jī)溶劑沉淀

4、加熱變性沉淀

5、重金屬鹽類(lèi)沉淀

6、生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀五．蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)

precipitationreaction

由于蛋白質(zhì)表面水化膜和蛋白質(zhì)表面同性電荷發(fā)生變化，蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀有以下幾種方法：

1）中性鹽沉淀、2）有機(jī)溶劑的沉淀、

3）加熱沉淀、4）重金屬鹽沉淀、

5）等電點(diǎn)沉淀、6）生物堿試劑的沉淀。要強(qiáng)調(diào)的是denaturation與precipitation是兩個(gè)不同的概念，p91中性鹽沉淀反應(yīng)鹽溶作用：蛋白質(zhì)在低鹽濃度下溶解度增加的現(xiàn)象。鹽析：高鹽濃度時(shí)，因?yàn)槠茐牡鞍踪|(zhì)水化膜并中和電荷，促使蛋白質(zhì)顆粒相互聚集而沉淀，稱(chēng)為鹽析作用。最常用的中性鹽為(NH4)2SO4。鹽析沉淀出的蛋白質(zhì)不變性，所以多用于酶，激素等具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的分離制備。有機(jī)溶劑沉淀

可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對(duì)水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，使蛋白質(zhì)沉淀。 在常溫下，有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性，例如酒精消毒滅菌就是如此。但若在低溫條件下，則變性進(jìn)行較緩慢，可用于分離制備各種血漿蛋白質(zhì)。

加熱沉淀反應(yīng)

加熱可以使蛋白質(zhì)變性沉淀，但偏酸或偏堿（需遠(yuǎn)離pI）加熱雖然仍能使蛋白質(zhì)變性，但不容易產(chǎn)生沉淀。

重金屬鹽沉淀反應(yīng)堿性環(huán)境

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在pH>pI溶液中時(shí)，帶負(fù)電荷，可與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結(jié)合成不溶性的蛋白鹽而沉淀。臨床上搶救重金屬鹽中毒的病人時(shí)，給予大量蛋白質(zhì)（生蛋清或牛奶）以生成蛋白鹽以減少重金屬離子的吸收。在重金屬鹽類(lèi)沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重金屬鹽不可過(guò)多，過(guò)多就會(huì)使沉淀消失，如過(guò)量CuSO4和AgNO3。注意區(qū)分變性和沉淀的概念蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng)p92茚三酮反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)→蛋白質(zhì)定量、定性

酚試劑反應(yīng)測(cè)定常用方法

還有不同氨基酸的特異成色反應(yīng)

e.g.坂口反應(yīng)，黃色反應(yīng)等課本P93表4-11茚三酮反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)

蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物紅紫色絡(luò)合物(鹼性溶液)Cu2+蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜

蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260測(cè)定范圍：0.1～0.5mg/