《光果甘草根提取物中主要有效成分含量的測定 高效液相色譜法》（征求意見稿）

1T/GDFCA104—2025光果甘草根提取物中主要有效成分含量的測定高效液相色譜法警示——使用本文件的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧⒈ＷC符合國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。本文件描述了高效液相色譜法測定光果甘草根提取物中主要有效成分含量的方法，包括方法的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、試樣的制備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算、精密度等要求。本文件適用于光果甘草根提取物中黃酮類標(biāo)志物（光甘草定和芒柄花黃素）和三萜類標(biāo)志物（光甘草醇和甘草內(nèi)酯）含量的測定，其他固體、半固體植物提取物可參照執(zhí)行。本文件不適用于光甘草定≥50%的光果甘草根提取物。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理試樣經(jīng)甲醇超聲提取，過濾，續(xù)濾液中各物質(zhì)經(jīng)液相色譜柱分離后，用紫外檢測器進(jìn)行檢測，用保留時(shí)間進(jìn)行定性，外標(biāo)法定量。5試劑和材料5.1甲醇（CH3OH，CAS號(hào)：67-56-1）：色譜純。5.2乙腈（C2H3N，CAS號(hào)：75-05-8）：色譜純。5.3磷酸（H3PO4，CAS號(hào)：7664-38-2）：分析純。5.40.05%磷酸水溶液：取500μL磷酸（見5.3），加一級(jí)水定容至1L。5.5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具體包括：——光甘草定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Glabridin，C20H20O4，CAS號(hào)：59870-68-7），純度≥98%；——芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Formononetin，C16H12O4，CAS號(hào)：485-72-3），純度≥98%；——光甘草醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Glabrol，C25H28O4，CAS號(hào)：59870-65-4），純度≥98%；——甘草內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Glabrolide，C30H44O4，CAS號(hào)：10401-33-9），純度≥98%。5.6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的類別及制備步驟具體包括：——甘草內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2000mg/L）：準(zhǔn)確稱取20mg（精確至0.1mg）甘草內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（見5.5），用甲醇（見5.1）溶解并定容到10mL，混合均勻。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液避光于0℃~4℃下儲(chǔ)存，有效期2個(gè)月；2T/GDFCA104—2025——芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000mg/L）：準(zhǔn)確稱取10mg（精確至0.1mg）芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（5.5），用甲醇（見5.1）溶解并定容到10mL，混合均勻。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液避光于0℃~4℃下儲(chǔ)存，有效期2個(gè)月；——光甘草定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000mg/L）：準(zhǔn)確稱取10mg（精確至0.1mg）光甘草定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（見5.5），用甲醇（見5.1）溶解并定容到10mL，混合均勻。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液避光于0℃~4℃下儲(chǔ)存，有效期2個(gè)月；——光甘草醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000mg/L）：準(zhǔn)確稱取10mg（精確至0.1mg）光甘草醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（見5.5），用甲醇（見5.1）溶解并定容到10mL，混合均勻。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液避光于0℃-4℃下儲(chǔ)存，有效期2個(gè)月。5.7標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的類別及制備步驟包括：——芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取適量的芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（見5.6）至5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（可根據(jù)樣品含量適當(dāng)調(diào)節(jié)溶液的濃度），臨用現(xiàn)配?！飧什荻?biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取適量的光甘草定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（見5.6）至5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（可根據(jù)樣品含量適當(dāng)調(diào)節(jié)溶液的濃度），臨用現(xiàn)配；——光甘草醇標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取適量的光甘草醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（見5.6）至5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（可根據(jù)樣品含量適當(dāng)調(diào)節(jié)溶液的濃度），臨用現(xiàn)配；——甘草內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取適量的甘草內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（見5.6）至5mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（可根據(jù)樣品含量適當(dāng)調(diào)節(jié)溶液的濃度），臨用現(xiàn)配。5.8實(shí)驗(yàn)材料：離心管、燒杯、量筒、移液槍、注射器、微孔濾膜（孔徑0.22μm，有機(jī)系）。注：除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。6儀器和設(shè)備6.1高效液相色譜儀：配有紫外檢測器（或二極管陣列檢測器）。6.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。6.3超聲波清洗器：功率不低于480W、頻率支持40kHz。6.4高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于8000r/min。7測定步驟7.1樣品預(yù)處理精密稱取0.5g（精確至0.0001g）甘草提取物粉末于50mL離心管中，加入25mL甲醇充分溶解，稱量。在超聲水浴溫度25℃條件下超聲提取30min，冷卻至室溫后稱量，用甲醇補(bǔ)足余量，避光儲(chǔ)存，以4000r/min離心5min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液用稀釋一定倍數(shù)為供試品溶液(建議檢測甘草內(nèi)酯不稀釋，檢測光甘草醇、芒柄花黃素稀釋10倍、檢測光甘草定稀釋20倍)。7.2液相色譜參考條件7.2.1色譜柱：C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），或性能相當(dāng)者。7.2.2柱溫：35℃。7.2.3流動(dòng)相：乙腈、0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫。梯度洗脫條件見表1和表2。表1光甘草定、芒柄花黃素檢測的洗脫條件053T/GDFCA104—20255表1光甘草定、芒柄花黃素檢測的洗脫條件（續(xù)）表2甘草內(nèi)酯、光甘草醇檢測的洗脫條件min0557.2.4檢測波長：280nm。7.2.5進(jìn)樣量：20μL。7.2.6流速：1.0mL/min。7.3液相色譜測定按照7.2色譜條件分別對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品試液進(jìn)行檢測，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品試液中光甘草定、芒柄花黃素、光甘草醇、甘草內(nèi)酯的色譜峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以保留時(shí)間對樣品進(jìn)行定性，保留時(shí)間允許誤差范圍為1%，標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法對樣品定量。當(dāng)檢測樣品基質(zhì)復(fù)雜，雜質(zhì)干擾后續(xù)檢測時(shí)，可適當(dāng)調(diào)整色譜條件。典型色譜圖參見附錄A。7.4空白試驗(yàn)除不加試樣外，采用與試樣完全相同的分析步驟進(jìn)行。8結(jié)果計(jì)算和表述8.1試樣中物質(zhì)含量按式(1)計(jì)算：式中：?——試樣中標(biāo)志物含量，單位為毫克每克（mg/g）；?——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得樣品溶液各標(biāo)志物質(zhì)量濃度，單位為毫克每升（mg/L）；0——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得空白溶液各標(biāo)志物質(zhì)量濃度，單位為毫克每升（mg/L?——樣品定容體積，單位為升（Lf——樣品溶液稀釋倍數(shù)；?——稱取樣品粉末的質(zhì)量，單位為克（g）。8.2計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值，計(jì)算結(jié)果用平行測定的算數(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。9檢出限、定量限本方法對芒柄花黃素、光甘草定、光甘草醇和甘草內(nèi)酯的檢測限和定量限見表3。表3芒柄花黃素、光甘草定、光甘草醇和甘草內(nèi)酯的檢測限和定量限4T/GDFCA104—2025mg/g表3芒柄花黃素、光甘草定、光甘草醇和甘草內(nèi)酯的檢測限和定量限（續(xù)）mg/g2510精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算數(shù)平均值的10%。本方法檢測芒柄花黃素的線性范圍為10mg/L~100mg/L，檢測光甘草定芒、柄花黃素、光甘草醇的線性范圍為100mg/L~1000mg/L，甘草內(nèi)酯的線性范圍為200mg/L~1200mg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)≥0.99，標(biāo)準(zhǔn)品添加量在待測樣品濃度0.5~1.5倍濃度范圍內(nèi)，回收率范圍為80%～120%。5T/GDFCA104—2025高效液相色譜法測定光果甘草根提取物主要有效成分的典型色譜圖A.1光甘草定物質(zhì)色譜圖，見圖A.1。圖A.1光甘草定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖（1000mg/L）A.2芒柄花黃素物質(zhì)色譜圖，見圖A.2。圖A.2芒柄花黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖（100mg/L）T/GDFCA104—2025A.3光甘草醇物質(zhì)色譜圖，見圖A.4。圖A.3光甘草醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖（800mg/L）A.4甘草內(nèi)酯物質(zhì)色譜圖，見圖A.4。圖A.4甘草內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖（800mg/L）7T/GDFCA104—2025A.5光甘草定-40光果甘草根提取物樣品色譜圖，見圖5.1