液體發(fā)酵生產(chǎn)桑黃多糖技術(shù)規(guī)程

1DB43/TXXXX—2021液體發(fā)酵生產(chǎn)桑黃多糖技術(shù)規(guī)程1本文件擬規(guī)定液體發(fā)酵生產(chǎn)桑黃多糖的主要技術(shù)指標(biāo)和要求，包括發(fā)酵工藝、提取方法、含量測定、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等規(guī)范。本文件適用于湖南省內(nèi)液體發(fā)酵生產(chǎn)桑黃多糖。2規(guī)范性引用文件GB4806.7食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸用塑料材料及制品GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T12728食用菌術(shù)語NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1731食用菌菌種良好作業(yè)規(guī)范3術(shù)語和定義GB/T12728界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1桑黃多糖Phellinuslinteuspolysaccharides桑黃多糖是從桑黃中提取的有效成分，能夠提高人體的免疫力，抵制癌細(xì)胞，而且還具有其它的食療作用。3.2硫酸-苯酚法sulfuricacidphenolmethod利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測定。4液體發(fā)酵產(chǎn)多糖4.1菌種生產(chǎn)菌種的生產(chǎn)應(yīng)符合NY/T528和NY/T1731的規(guī)定，母種宜使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）4.2發(fā)酵培養(yǎng)基按照附錄A規(guī)定配制。2DB43/T1907—20204.2裝液量采用1000mL的常規(guī)三角瓶，每瓶裝液量為200mL～300mL，八層紗布和牛皮紙封口。4.3滅菌在121℃~126℃,0.14MPa～0.17MPa的壓力下，保持25分鐘。4.4接種將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至30℃以下，無菌條件下用打孔法（10mm孔徑）將菌絲接種到液體搖瓶培養(yǎng)基上，按每100mL液體培養(yǎng)基接種3個菌絲塊。4.5培養(yǎng)接種后移至搖床，26℃,130r/min條件下培養(yǎng)10天。5粗多糖的提取5.1發(fā)酵上清液收集發(fā)酵后的菌液5000rpm、4℃條件下離心15min，棄去沉淀，收集上清。5.2三氯乙酸處理上清液中緩慢加入濃度為800mg/mL三氯乙酸，使其終濃度為40mg/mL，4℃靜置8h后10000rpm、4℃條件下離心10min，棄去沉淀，收集上清。5.3無水乙醇處理按1:4的體積比向上清液中加入無水乙醇，4℃過夜，10000rpm、4℃條件下離心10min后收集底部沉淀。將沉淀溶于60℃蒸餾水中，10000rpm離心10min，棄去底部不溶沉淀，收集上清。5.4透析將上清液裝入截留分子量為8KDa的透析袋內(nèi)，透析2h～4h后，更換透析液，之后每6h～8h更換一次透析液，連續(xù)透析2d。收集透析袋內(nèi)多糖溶液，真空冷凍干燥制得乳酸菌粗多糖。6多糖的純化6.1離子交換純化6.1.1層析柱填裝將DEAE-SepharoseFastFlow填料裝填于ColumnXK26/40（內(nèi)徑：26mm，高度400mm）層析柱中，體積為150mL，用Tris-HCl溶液（55mM，pH7.5～7.8）以1.5mL/min流速過夜平衡層析柱。6.1.2過柱分離將粗多糖溶于Tris-HCl中，配成濃度為10mg/mL溶液，0.22um濾膜過濾后上樣。流動相使用Tris-HCl和含1MNaCl的Tris-HCl洗脫液，將蛋白質(zhì)核酸純化系統(tǒng)的流速設(shè)置為2.0mL/min，每3min收集一次洗脫液至試管中。3DB43/TXXXX—20216.2分子篩純化6.2.1層析柱填裝將SephadexLH-20裝填于ColumnXK16/100（內(nèi)徑：16mm，高度1000mm）層析柱中，體積為150mL，用Tris-HCl溶液（55mM，pH7.5～7.8）以0.5mL/min流速過夜平衡層析柱。6.2.2過柱分離將上一步純化收集得到的多糖組分溶于Tris-HCl中，配成濃度為5mg/mL溶液，0.22μm濾膜過濾后上樣。流動相使用Tris-HCl洗脫液，流速為0.5mL/min，每10min收集一次洗脫液至試管中。將得到的多糖進(jìn)行冷凍干燥。7苯酚-硫酸法測定多糖含量7.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制稱取葡萄糖100mg，蒸餾水定容至100mL的1mg/L的葡萄糖液，搖勻后吸取10mL該溶液，用去離子水稀釋定容至100mL，即得100ug/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。7.290%苯酚液的配制量取苯酚90mL，用去離子水定容至100mL，即得90%苯酚液，棕色瓶中避光保存。7.36%苯酚液的配制將90%苯酚液稀釋至6%，即一體積儲存液對應(yīng)十四體積去離子水，臨用現(xiàn)配。7.4實(shí)驗(yàn)步驟7.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取8支干凈的帶塞試管，按表1方法分別加入相應(yīng)體積的葡萄糖溶液，然后在冰水浴中加入0.5mL的6%苯酚溶液，震蕩搖勻后緩慢逐滴加入純硫酸，以不放熱或微量放熱為宜，搖勻后恒溫加塞，沸水放置20min，取出后用涼水冷卻10min，以0號作為空白調(diào)零，在最大吸收波長處（490nm）測定吸光度。以葡萄糖濃度X為橫坐標(biāo)(μg/mL吸光度Y為縱坐標(biāo)，從而來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用excel軟件求得回歸方程。表1表1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作的試劑配制方法012345677.4.2待測樣品多糖含量的測定與計(jì)算4DB43/T1907—2020將提取得到的待測多糖用去離子水溶解，定容至100mL，取溶解后的溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線中的測定方法，以樣液為參比液，測定溶液的吸光值，按回歸方程計(jì)算待測溶液的多糖濃度，乘以稀釋倍數(shù)則為多糖含量。8質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)用苯酚-硫酸法測的多糖含量大于80%以上，視為提取的桑