(完整版)《儀器分析》高效液相色譜法

第十章高效液相色譜法學(xué)習(xí)目標(biāo)1.掌握高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)、功能和特點；2.了解高效液相色譜法的分類及應(yīng)用。主要內(nèi)容§10-1高效液相色譜儀§10-2高效液相色譜的類型高壓輸液系統(tǒng)分離系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進樣系統(tǒng)檢測系統(tǒng)§10-1高效液相色譜儀一、高壓輸液系統(tǒng)儲液瓶脫氣裝置高壓輸液泵梯度洗脫裝置高壓輸液系統(tǒng)（一）儲液瓶用于存放流動相。儲液瓶材料要耐腐蝕，常用的材料為玻璃、不銹鋼、或表面噴涂聚四氟乙烯的不銹鋼等；儲液瓶應(yīng)配有溶劑過濾器，以防止流動相中的顆粒進入泵內(nèi)；流動相：色譜純有機溶劑、新鮮去離子水（二）脫氣裝置流動相使用之前需要脫氣脫氣的目的是為了防止流動相從高壓柱內(nèi)流出時，釋放出氣泡進入檢測器而使噪聲劇增，甚至不能正常檢測。脫氣方式有吹氦脫氣、超聲波脫氣、真空脫氣等。超聲脫氣（三）高壓輸液泵高壓輸液泵：提供流動相和樣品通過色譜柱、進入檢測器所需的動力，其性能好壞直接影響分析結(jié)果的可靠性。高壓輸液泵應(yīng)流量穩(wěn)定，以保證測定結(jié)果的重復(fù)性和定量定性分析的精度；輸出壓力高，流量范圍寬；耐酸、堿、緩沖液腐蝕；壓力波動小；死體積小。流動相的注意事項：防止固體微粒進入泵體——流動相和樣品必須過濾有機系0.45μm濾膜，水系0.45μm濾膜流動相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)，緩沖液不能保留在泵內(nèi)——純水清洗防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完不超過規(guī)定的最高壓力

（1）等度洗脫：流動相組成恒定（2）梯度洗脫：流動相組成改變（四）梯度洗脫裝置梯度洗脫的特點

改善分離,加快分析速度；

改善峰形,減少拖尾;

基線漂移、重現(xiàn)性差。適用于組分多，極性范圍寬的復(fù)雜樣品二、進樣系統(tǒng)六通閥Load狀態(tài)注入樣品液Inject狀態(tài)進樣操作：

load時，注入樣品

扳至Inject

約1min后，扳回load，拔針三、分離系統(tǒng)色譜柱是高效液相色譜儀的重要部件，由柱管和固定相組成按主要用途可分為分析型色譜柱和制備型色譜柱；四、檢測系統(tǒng)高效液相色譜儀中的檢測器是通過將組分的量轉(zhuǎn)變成為電信號；檢測器應(yīng)具備靈敏度高、響應(yīng)對流動相流量及溫度變化都不敏感、死體積小、線性范圍寬、適用范圍廣、重現(xiàn)性好的特點。四、檢測系統(tǒng)常用的檢測器有

紫外吸收檢測器（UVD）

蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）

示差折光檢測器（RID）

熒光檢測器（FLD）

電導(dǎo)檢測器（ECD）

質(zhì)譜檢測器（MSD）紫外吸收檢測器（UVD）紫外檢測器是使用最廣泛的一種檢測器特點：靈敏度較高，噪聲低，檢出限小，適合分析有紫外吸收的物質(zhì)；為濃度型檢測器；選擇性檢測器，僅對有紫外吸收的物質(zhì)有響應(yīng)；可用于制備，或與其它檢測器串聯(lián)使用；對溫度和流動相流量波動不敏感，可用于梯度洗脫。紫外吸收檢測器（UVD）

UVD有三種類型：固定波長型、可變波長型及二極管陣列檢測器。目前使用最多的是可變波長型及二極管陣列檢測器。圖10-8

流通池示意圖可變波長型紫外檢測器可變波長型紫外檢測器是目前高效液相色譜儀中配置最多的檢測器，采用氘燈作光源，波長在190～600nm范圍內(nèi)可連續(xù)調(diào)節(jié)。其結(jié)構(gòu)與一般的紫外分光光度計一致，主要差別是用流通池代替吸收池。二極管陣列檢測器三維色譜-光譜圖（二）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）ELSD一般都是由三部分組成，即霧化器、加熱漂移管和光散射池主要用于糖類、高分子化合物、高級脂肪酸以及甾體類等幾十類化合物（三）示差折光檢測器（RID）特點：通用性強，適用于具有與流動相折射率不同的樣品組分，但是靈敏度低，也不能用于梯度洗脫。通常只用于糖類化合物的檢測。（四）熒光檢測器（FLD）特點:靈敏度高，檢測限可達到10-10g·ml-1，選擇性好，樣品用量少應(yīng)用：具有熒光的有機化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等），都可用熒光檢測法檢測。（五）電導(dǎo)檢測器（ECD）電導(dǎo)檢測器是根據(jù)電化學(xué)原理和物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)進行檢測的特點:靈敏度高、專屬性高應(yīng)用:主要應(yīng)用于復(fù)雜樣品中痕量組分的選擇測定，亦即較復(fù)雜生物樣品中藥物和其代謝物的測定(六)質(zhì)譜（MS）質(zhì)譜將化合物打碎成離子和碎片離子，按其質(zhì)荷比的不同進行分離測定。質(zhì)譜是強有力的結(jié)構(gòu)解析工具之一，它的應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、分析速度快，但儀器和實驗成本很高，在一般性的實驗中不太適宜?！?0-2高效液相色譜的類型一、液固吸附色譜二、液-液分配色譜三、化學(xué)鍵合相色譜四、離子交換色譜五、凝膠色譜法（一）正相鍵合相色譜法（NBPC）（二）反相鍵合相色譜法（RBPC）一、液-固吸附色譜

流動相為液體，固定相為固體吸附劑1、基本原理：利用各組分吸附能力的差異而分離的；吸附能力大的組分，分配系數(shù)大，保留值就大（后出峰）。2、固定相：極性固定相：硅膠、氧化鋁、氧化鎂、分子篩；非極性固定相：活性炭較常使用的是5～10μm的全多孔型硅膠吸附劑。以極性吸附劑為固定相時，組分的極性越大，保留值就越大。不同類型的有機物在極性吸附劑上的保留時間如下：氟碳化合物<飽和烴<烯烴<芳烴<有機鹵化物<醚<硝基化合物<腈<酯、醛、酮<醇<羧酸硅膠固定相分離苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流動相：干燥正庚烷1份水飽和的正庚烷2份干燥正庚烷水飽和的正庚烷流動相影響分離的選擇性3、流動相（也稱洗脫液）：極性大的樣品用極性大的流動相，極性小的樣品用極性小的流動相；4、應(yīng)用

具有不同官能團的化合物

油溶性試樣

同分異構(gòu)體思考：（鄰、間、對）硝基苯胺的三種異構(gòu)體極性大??？鄰位<間位<對位鄰硝基苯胺間硝基苯胺對硝基苯胺適合分離的物質(zhì)（二）液-液分配色譜固定相與流動相均為液體（互不相溶）；1、基本原理：利用組分在固定相和流動相上的溶解度不同而分離；分配系數(shù)大，保留值就大。2、固定相：將固定液涂于載體，易流失，較少采用；固定相極性-流動相非極性反相分配色譜正相分配色譜分離極性物質(zhì)固定相非極性-流動相極性分離芳烴、烷烴等弱極性物質(zhì)3、按固定相與流動相的極性大小可分為：化學(xué)鍵合相是利用化學(xué)反應(yīng)通過共價鍵將有機官能團鍵合在載體（硅膠表面的游離羥基）上，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相。優(yōu)點：穩(wěn)定，不易流失。三、化學(xué)鍵合相色譜1、定義2、鍵合相色譜的種類和選擇正相鍵合相色譜：固定相極性>流動相極性固定相：極性鍵合相（氰基、氨基、二醇基鍵合相）流動相：非極性或弱極性有機溶劑分離中等極性至強極性的化合物極性強的組分→K

→tR

→

出峰

大長后反相鍵合相色譜：固定相極性<流動相極性固定相：非極性鍵合相，如十八烷基硅烷鍵合相（C18柱/ODS柱）、苯基、苯甲基鍵合相流動相：甲醇-水；乙腈-水分離非極性、弱極性至中等極性的化合物極性強的組分→K

→tR

→

出峰小小先思考：以O(shè)DS柱、甲醇-水為流動相分離以下兩種酸，試判斷出峰次序？沒食子酸3,4-二羥基苯甲酸已知組分極性:沒食子酸>3,4-二羥基苯甲酸沒食子酸先出峰（保留值較?。┛偨Y(jié)1：HPLC與經(jīng)典LC的比較高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時數(shù)小時高效：填充物顆粒極細且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV—10-9g,熒光檢測器—10-11g。分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，只占有機物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，占有機物總數(shù)的80%；流動相的選擇：GC采用的流動相中為“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用?。籋PLC采用的流動相除了起運載作用外，影響組分分離的關(guān)鍵因素操作溫度：GC需高溫；HPLC常室溫進行總結(jié)2：HPLC與GC的比較課堂練習(xí)1、液液分配色譜法中的反相液相色譜法，其固定相、流動相和分離化合物的性質(zhì)分別為（）A、極性、非極性和非極性C、極性、非極性和極性D、非極性、極性和離子化合物B、非極性、極性和非極性答錯了，再來一次答對了，點擊此處進入下一題課堂練習(xí)2、分配色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，選擇不同類別的溶劑（分子間作用力不同），以改善分離度，主要是（）D、提高色譜柱柱效能C、增加保留時間B、增大容量因子A、提高分配系數(shù)答錯了，再來一次答對了，點擊此處進入下一題課堂練習(xí)3、在液相色譜中，梯度洗脫適用于分離（）A、異構(gòu)體D、沸點相差大的樣品B、沸點相近，官能團相同的化合物C、極性范圍寬的樣品答錯了，再來一次答對了，點擊此處進入下一題課堂練習(xí)4、高效液相色譜中屬于通用型檢測器的是（）A、紫外檢測器C、熒光檢測器D、電導(dǎo)檢測器B、示差折光檢測器答錯了，再來一次答對了，點擊此處進入下一題課堂練習(xí)5、在液相色譜中，常用作固定相，又可用作鍵合相基體的物質(zhì)是（）A、分子篩C、氧化鋁D、活性炭B、硅膠答錯了，再來一次答對了，點擊此處進入下一題課堂練習(xí)6、用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱分離一有機弱酸混合物樣品，以甲醇-水為流動相時，樣品容量因子較小，若想使容量因子適當(dāng)增加，較好的方法是（）A、增加流動相中甲醇比列C、流動相中加入少量的醋酸B、增加流動相中水的比例D、流動相中加入少量的氨水答錯了，再來一次答對了，點擊此處進入下一題課堂練習(xí)7、在反相鍵合色譜法中固定相與流動相的極性關(guān)系是（）A、固定相的極性>流動相的極性C、固定相的極性=流動相的極性D、不一定，視組分性質(zhì)而定的B、固定相的極性<流動相的極性答錯了，再來一次答對了，點擊此處進入下一題課堂練習(xí)8、下列那種因素將使組分的保留時間變短？A、減慢流動相的流速D、正相色譜流動相為正己烷-二氯甲烷，增大正己烷比例B、增加色譜柱柱長C、反