1.2基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序?qū)嵤┗蚬こ痰谝徊?/p>

目前常用的方法有:1、從自然界已有的物種中分離

2、用人工方法合成目的基因的獲取目的基因:主要指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。

也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。1.2

基因工程的基本操作程序原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼區(qū)上游)(編碼區(qū)下游)與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)不編碼蛋白質(zhì)，有調(diào)控作用編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列不編碼蛋白質(zhì)，有調(diào)控作用編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點（間隔的、不連續(xù)的）真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)1.從基因文庫中獲取目的基因。

(1)概念：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。一、目的基因的獲取(2)分類：(3)基因文庫的構(gòu)建基因組文庫部分基因文庫基因組文庫：包含了一種生物所有的基因。部分基因文庫：包含了一種生物的一部分基因。基因組文庫的構(gòu)建通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因mRNA單鏈cDNA雙鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶cDNA文庫的構(gòu)建2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因（1）PCR——__________反應(yīng)

PCR技術(shù)是一項在生物_____復(fù)制____________的核酸合成技術(shù)。（使用PCR擴增儀）（2）原理：（3）前提：要有一段______________的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成_____。（4）過程：（5）比較PRC技術(shù)與細(xì)胞中的DNA復(fù)制一、目的基因的獲取DNA雙鏈復(fù)制原理多聚酶鏈?zhǔn)襟w外特定DNA片段已知目的基因引物PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點原料條件不同點場所酶解旋方式結(jié)果四種脫氧核苷酸模板、ATP、酶體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化在短時間內(nèi)形成大量的DNA片段形成整個DNA分子3.人工合成基因一、目的基因的獲取反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA目的基因的mRNA單鏈cDNA雙鏈cDNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成二、構(gòu)建表達(dá)載體同一種目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代，使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用。P15思考3&4幾種常見的轉(zhuǎn)化方法：1、導(dǎo)入到植物細(xì)胞2、導(dǎo)入到動物細(xì)胞3、導(dǎo)入到微生物細(xì)胞三、導(dǎo)入受體細(xì)胞顯微注射技術(shù)轉(zhuǎn)化

：目的基因進入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

基因槍法

花粉管通道法三、導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法土壤農(nóng)桿菌：具有趨化性（酚），感染雙子葉植物和裸子植物三、導(dǎo)入受體細(xì)胞基因槍法：

單子葉植物常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但成本較高。三、導(dǎo)入受體細(xì)胞花粉管通道法：

十分簡便經(jīng)濟的方法。我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用此方法獲得。三、導(dǎo)入受體細(xì)胞顯微注射法

重組DNA提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵發(fā)育新性狀動物三、導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入到微生物細(xì)胞將目的基因轉(zhuǎn)到大腸桿菌細(xì)胞中的操作步驟：1)獲得目的基因和質(zhì)粒載體；2)形成重組質(zhì)粒；3)用Ca+處理，制備感受態(tài)細(xì)胞,用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；4)培養(yǎng)大腸桿菌，讓重組質(zhì)粒形成大量拷貝；5)篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞。1.篩選含有目的基因的受體細(xì)胞（1）抗藥性篩選法——標(biāo)記基因（2）DNA分子雜交：2.檢測目的基因的表達(dá)——性狀體現(xiàn)（1）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA（2）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（3）檢測性狀四、目的基因的檢測與鑒定分子雜交抗原—抗體雜交——個體生物學(xué)水平抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等四、目的基因的檢測與鑒定DNA分子雜交示意圖