高三二輪復(fù)習(xí)生物：標(biāo)記基因?qū)ｎ}訓(xùn)練

標(biāo)記基因?qū)ｎ}復(fù)習(xí)1標(biāo)記基因的作用基因工程操作的第三步是將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，導(dǎo)入受體細(xì)胞的不是單獨(dú)的目的基因，而是載體與目的基因在限制酶和DNA連接酶的作用下形成的重組DNA分子。這一步操作中需要進(jìn)行篩選，需要篩選出哪些受體細(xì)胞中導(dǎo)入了目的基因。篩選時(shí)需要用到與目的基因重組的載體上的標(biāo)記基因，標(biāo)記基因是一種已知功能或已知序列的基因，能夠起著特異性標(biāo)記的作用。標(biāo)記基因的作用是便于重組DNA分子的篩選，是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來。例1.（2023年全國乙卷節(jié)選）構(gòu)建目的基因表達(dá)載體?？蒲腥藛T從構(gòu)建的GFP突變基因文庫中提取目的基因（均為突變基因）構(gòu)建表達(dá)載體，其模式圖如下所示（箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向）。圖中①為；②為，其作用是；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標(biāo)記基因，其作用是。2標(biāo)記基因的種類及篩選原理質(zhì)粒等載體上常有特殊的標(biāo)記基因，標(biāo)記基因一般是抗生素的抗性基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，但是標(biāo)記基因不能等同于抗性基因。高中生物學(xué)教學(xué)中標(biāo)記基因的種類主要包括抗生素抗性標(biāo)記基因、β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)標(biāo)記基因和營養(yǎng)標(biāo)記基因等。2.1抗生素抗性標(biāo)記基因常用的抗生素抗性標(biāo)記基因主要有氨芐青霉素抗性基因（ampr）、四環(huán)素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（chlr）及卡那霉素抗性基因（kanr）等。抗生素抗性標(biāo)記基因的篩選原理如下：①前提：目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞如大腸桿菌（填“有”或“沒有”）抵抗相關(guān)抗生素的能力。②過程：將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，然后把受體細(xì)胞培養(yǎng)在含有該抗生素的培養(yǎng)基中。③結(jié)果：抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對(duì)該抗生素產(chǎn)生抗性。在培養(yǎng)基上，被抗生素殺死的細(xì)胞是，未被殺死的細(xì)胞是。④原理如下圖所示：例2.（2021年全國乙卷）DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有______________________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因（如某種抗生素抗性基因），利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是。2.2β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)標(biāo)記基因某些載體，如M13噬菌體，PUC質(zhì)粒系列、pGEM質(zhì)粒系列等，它們的載體上都攜帶lacZ′基因一段序列，它編碼β-半乳糖苷酶的α肽，產(chǎn)生有生物活性的β-半乳糖苷酶，把培養(yǎng)基中的無色X-gal分解成半乳糖和呈藍(lán)色的5-溴-4氯-靛藍(lán)，使菌落呈藍(lán)色[1]。若將外源基因插入到載體上lacZ′序列中，使α基因失活，使α肽失活。因此攜帶空載體的大腸桿菌呈藍(lán)菌落，攜帶外源基因的大腸桿菌呈白菌落[2]。例3.圖甲為一種質(zhì)粒，圖乙為含有目的基因D的DNA片段。Ap為氨芐青霉素抗性基因，lacZ′為藍(lán)色顯色基因，其表達(dá)產(chǎn)物可以將無色化合物X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈藍(lán)色。EcoRⅠ、PvuⅠ為限制酶?；卮鹣铝袉栴}：獲取目的基因D時(shí)應(yīng)選擇圖乙中的_________對(duì)其所在的DNA進(jìn)行切割。利用自身不含lacZ′基因且對(duì)抗生素敏感的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，要在已轉(zhuǎn)化的含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞、已轉(zhuǎn)化的含空質(zhì)粒的受體細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化成功的受體細(xì)胞中篩選出已轉(zhuǎn)化的含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞的方法是。2.3營養(yǎng)標(biāo)記基因當(dāng)細(xì)胞中合成某種營養(yǎng)物質(zhì)的酶的編碼基因失活，就成為營養(yǎng)缺陷型，但如果導(dǎo)入細(xì)胞的重組DNA分子能夠彌補(bǔ)缺陷的基因，培養(yǎng)基中就無需補(bǔ)充有關(guān)的營養(yǎng)成分。營養(yǎng)標(biāo)記為重組體克隆的選擇提供了方便的方法[2]。例4．（2021年江蘇卷改編）URA3基因是酵母篩選標(biāo)記基因，缺失該基因酵母無法合成尿嘧啶，用含有尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導(dǎo)入重組質(zhì)粒A-m（A為載體，上面含有URA3基因，m為目的基因），然后涂布于無尿嘧啶的培養(yǎng)基上，篩選獲得目的菌株，其機(jī)理是。3利用影印平板培養(yǎng)法進(jìn)行篩選3.1只有1個(gè)標(biāo)記基因時(shí)會(huì)出現(xiàn)“假陽性”現(xiàn)象若載體上只有1個(gè)標(biāo)記基因,一般不能破壞其結(jié)構(gòu),否則無法在導(dǎo)入重組質(zhì)粒后對(duì)含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選。載體上只有1個(gè)標(biāo)記基因時(shí)會(huì)出現(xiàn)“假陽性”現(xiàn)象，即導(dǎo)入了含有目的基因的重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞和導(dǎo)入了不含目的基因的空質(zhì)粒的受體細(xì)胞都能正常表達(dá)標(biāo)記基因,造成無效篩選。3.2有兩個(gè)及以上標(biāo)記基因時(shí)的篩選外源DNA片段插入抗生素抗性基因內(nèi)部時(shí)，將導(dǎo)致相應(yīng)的抗性基因的失活。這種因外源DNA的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱為插入失活[1]。若載體上有兩個(gè)及以上的標(biāo)記基因,則可合理對(duì)其中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞,從而達(dá)到比只有1個(gè)標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有1個(gè)標(biāo)記基因時(shí)出現(xiàn)的“假陽性”現(xiàn)象。例如,載體上含有兩個(gè)不同的標(biāo)記基因A和B，若目的基因插入到標(biāo)記基因A內(nèi)部時(shí)，會(huì)使標(biāo)記基因A的結(jié)構(gòu)遭到破壞而失去活性。選擇標(biāo)記基因A不能正常表達(dá)而標(biāo)記基因B能正常表達(dá)的受體細(xì)胞，即為成功導(dǎo)入了重組載體的受體細(xì)胞。此時(shí)常運(yùn)用“影印平板培養(yǎng)法”來檢測(cè)重組載體是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。例5．（2023年湖北卷）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落3.3利用影印平板培養(yǎng)法篩選影印平板培養(yǎng)法是一種通過蓋印章的方式，達(dá)到在一系列培養(yǎng)皿平板的相同位置上出現(xiàn)相同遺傳型菌落的接種和培養(yǎng)方法[3]。影印平板培養(yǎng)法最初是證明抗藥性突變并非由于接觸了藥物引起的，而是突變?cè)诮佑|藥物之前就已自發(fā)地隨機(jī)地產(chǎn)生了，藥物只是起著定向選擇作用。在基因工程中可以利用影印平板培養(yǎng)法檢測(cè)基因表達(dá)載體是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，如下圖所示，利用EcoRⅠ和BamHⅠ兩種限制酶構(gòu)建基因表達(dá)載體并且導(dǎo)入無青霉素和四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，將大腸桿菌培養(yǎng)在含青霉素的培養(yǎng)基A中，形成如圖所示的6個(gè)菌落，然后利用影印平板培養(yǎng)法原位接種在含四環(huán)素的培養(yǎng)基B中，形成如圖所示的4個(gè)菌落。培養(yǎng)基A中的菌落就是含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌。例6.（2016年課標(biāo)Ⅰ卷改編）某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化原本無Ampr和Tetr的大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題：1）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是；并且和的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有的固體培養(yǎng)基。2）上述篩選的具體步驟如下，先將大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖2的菌落。再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖3的結(jié)果(空圈表示與圖2對(duì)照無菌落的位置)。圖3結(jié)果顯示，多數(shù)大腸桿菌中導(dǎo)入的是___________，與圖3空圈相對(duì)應(yīng)的圖2中的菌落表型是___________________________________，即為含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落。標(biāo)記基因?qū)ｎ}復(fù)習(xí)參考答案例1、鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來。例2、答案：一至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞例3、答案：PvuⅠ將受體細(xì)胞接種在含有氨芐青霉素和X-gal的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形