1.2.2 微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)課件-高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

平板劃線法

接種獲得微生物純培養(yǎng)物（單菌落）的方法：稀釋涂布平板法操作簡(jiǎn)單，不可以計(jì)數(shù)。操作較麻煩，可以計(jì)數(shù)。1.2.2微生物的選擇培養(yǎng)與計(jì)數(shù)目標(biāo)：1.闡明微生物選擇培養(yǎng)的原理。2.進(jìn)行土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)。農(nóng)作物能直接吸收尿素嗎？不能，將有機(jī)物尿素分解成無(wú)機(jī)物氨，才能被植物利用CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3如何才能把尿素細(xì)菌從土壤中篩選出來(lái)？探究·實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)碳源氮源能。只有產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌能利用尿素作為氮源而生存。選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許______________________，同時(shí)_________________________生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。特定種類的微生物生長(zhǎng)抑制或阻止其他種類微生物（一）篩選菌株一、研究思路

此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？以尿素為唯一氮源無(wú)機(jī)鹽

1、PCR技術(shù)（體外DNA復(fù)制技術(shù)）需要耐高溫（930C）的DNA聚合酶。如何篩選出能產(chǎn)生耐高溫的DNA聚合酶的細(xì)菌？1973年，布魯克在美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉中發(fā)現(xiàn)了耐熱的Taq細(xì)菌，并分離到耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）。舉一反三：如何篩選菌株？美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉到菌種相應(yīng)的生存環(huán)境中去尋找

2、如何篩選自養(yǎng)型的微生物？

3、如何篩選抗青霉素的微生物？

4、如何篩選能分解石油的微生物？

篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。

通常1g土壤中有幾億到幾百億個(gè)土壤微生物，其中，細(xì)菌的數(shù)量最多，能分解尿素的細(xì)菌是其中的一部分。

由于土壤細(xì)菌的數(shù)量龐大，要想得到特定微生物的純培養(yǎng)物，僅有選擇培養(yǎng)基是不夠的，還需要對(duì)土壤進(jìn)行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上。稀釋涂布平板法探究·實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)二、實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣探究·實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)制備培養(yǎng)基梯度稀釋涂布平板培養(yǎng)觀察微生物計(jì)數(shù)（1）土壤取樣:從酸堿度接近中性、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中?！钊⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要

。滅菌二、實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣探究·實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)制備培養(yǎng)基梯度稀釋涂布平板培養(yǎng)觀察微生物計(jì)數(shù)以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基、制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。（2）制備培養(yǎng)基：作為對(duì)照，檢驗(yàn)選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。10g1×101mL90mL無(wú)菌水移液管（3）梯度稀釋：1mL1×1071×1061×1051×1041×1031×1029mL無(wú)菌水1mL1mL1mL1mL稀釋倍數(shù)注意：移液管需要經(jīng)過(guò)滅菌；試管口和移液管離火焰1～2cm處。取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。(5)將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，培養(yǎng)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。（4）涂布平板：培養(yǎng)基表面的菌液過(guò)多會(huì)導(dǎo)致菌體堆積，影響分離效果。（4）涂布平板：每個(gè)稀釋度下涂布

個(gè)選擇培養(yǎng)基和

個(gè)蛋白胨培養(yǎng)基，另外，兩種培養(yǎng)基各留1個(gè)空白平板做

.細(xì)菌：一般選用104

、105

、106倍的稀釋液放線菌：一般選用103

、104

、105倍的稀釋液真菌：一般選用102

、103

、104倍的稀釋液不同微生物在土壤中含量不同，最適稀釋度不同31空白對(duì)照目的：獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計(jì)數(shù)的平板。在培養(yǎng)皿底作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型組別、培養(yǎng)日期、稀釋度、培養(yǎng)物等。（5）微生物的培養(yǎng)與觀察：細(xì)菌：30～370C的溫度下培養(yǎng)1～2d選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物需要不同的培養(yǎng)溫度及時(shí)間在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目不同微生物會(huì)表現(xiàn)出不同的菌落特征，包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等，這是區(qū)別不同微生物的關(guān)鍵。二、實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣制備培養(yǎng)基梯度稀釋涂布平板培養(yǎng)觀察微生物計(jì)數(shù)稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍稀釋涂布平板法：聚集的微生物單個(gè)細(xì)胞梯度稀釋菌液?jiǎn)尉渫坎计桨迳L(zhǎng)繁殖（1）計(jì)數(shù)原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠___時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)____，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)____；通過(guò)計(jì)數(shù)平板上的____數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少_____；高活菌菌落活菌菌落（6）微生物計(jì)數(shù)：例2.某同學(xué)在三種稀釋度下取0.1mL的菌液涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，得到了以下的數(shù)據(jù)，試計(jì)算1g樣品的活菌數(shù)。平板稀釋度平板1平板2平板310432036035610521223428710621231830～300范圍內(nèi)，計(jì)算其平均值為(212＋234＋287)/3≈244。1g樣品中活菌數(shù)為(244÷0.1)×105＝2.44×108(個(gè))。（2）計(jì)數(shù)原則①選擇菌落數(shù)為_______的平板計(jì)數(shù)30-300②同一稀釋度下，應(yīng)至少對(duì)__個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，求出______3平均值樣品的______將直接影響平板上的菌落數(shù)目；稀釋度每克樣品中的菌落數(shù)＝(平均數(shù)÷0.1)×稀釋倍數(shù)【例1】用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確的是（）A.涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230B.涂布了兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C.涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D.涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233D第一組結(jié)果誤差過(guò)大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值（操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)）。沒(méi)有重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布3個(gè)平板）。例2：下圖為“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)”實(shí)驗(yàn)中樣品稀釋示意圖。據(jù)圖分析，每克土壤中的菌株數(shù)約為多少？約為(170÷0.1)×106個(gè)。每克樣品中的菌落數(shù)＝(平均數(shù)÷0.1)×稀釋倍數(shù)=1.70×109個(gè)。2、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。誤差：計(jì)總數(shù)（6）微生物計(jì)數(shù)：1、

稀釋涂布平板法（間接計(jì)數(shù)）計(jì)活菌數(shù)統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌數(shù)目低（原因？）因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。誤差：計(jì)數(shù)結(jié)果偏大（不能區(qū)分死菌與活菌）(1)土樣不同(2)培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))你能說(shuō)出結(jié)果差異大的兩個(gè)可能的因素嗎？在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106

倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度只選擇出大約50個(gè)菌落。分析其原因。?三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，空白對(duì)照的培養(yǎng)基出現(xiàn)菌落；若培牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數(shù)遠(yuǎn)大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。2.樣品的稀釋操作是否成功及重復(fù)組的結(jié)果是否一致如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30—300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。3.重復(fù)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否一致如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，則可能操作有誤，需要重做試驗(yàn)。結(jié)果分析四、操作提示（一）無(wú)菌操作（二）做好標(biāo)記平板：皿底注明培養(yǎng)基種類、日期、樣品的稀釋度、微生物種類等試管：按稀釋梯度做好標(biāo)記。（三）規(guī)劃時(shí)間〖注意〗在研究未知微生物時(shí)務(wù)必規(guī)范操作，以防被____________感染，實(shí)驗(yàn)后一定要洗手消毒。致病微生物在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→酚紅變紅→脲酶陽(yáng)性.進(jìn)一步探究在上述實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，一定是尿素分解菌嗎？脲酶陰性脲酶陽(yáng)性五、對(duì)所篩選菌種的鑒定不一定，固氮菌也能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)如何鑒定尿素分解菌鑒定方法【拓展】測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法-濾膜法。是將一定體積的水過(guò)濾后，將濾膜放到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)深紫色有金屬光澤，通過(guò)計(jì)數(shù)得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)課堂小結(jié)以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑土壤取樣→稀釋涂布→培養(yǎng)與觀察→計(jì)數(shù)稀釋涂布平板法使用以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基菌種鑒定分離方法實(shí)驗(yàn)流程菌種篩選二、拓展應(yīng)用

2.地球上的植物每年產(chǎn)生的纖維素超過(guò)70億噸，其中40%~60%能被土壤中某些微生物分解利用，這是因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生纖維素酶。對(duì)這些微生物的研究與應(yīng)用，使人們能夠利用精桿等生產(chǎn)酒精，用纖維索酶處理服裝面料等。已知?jiǎng)偣t是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不與水解后的纖維二糖、葡萄糖等發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)我們?cè)诤欣w維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅與纖維素形成紅色復(fù)合物；而當(dāng)纖維索被纖維素分解菌分解后，復(fù)合物就無(wú)法形成，培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以這些菌為中心的透明圈(如下圖所示)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。練習(xí)與應(yīng)用（P20）

纖維素分解菌的篩選方案土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋涂布樣品到鑒別培養(yǎng)基挑選菌落選擇富含__________的環(huán)境，目的菌的含量相對(duì)較高。纖維素例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。例：人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境：濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對(duì)集中，一般將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。

纖維素分解菌的篩選土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別培養(yǎng)基挑選菌落目的：增加纖維素分解菌的濃度該培養(yǎng)基從物理性質(zhì)上看屬于：選擇機(jī)制：以纖維素粉為唯一碳源，能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。液體培養(yǎng)基土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別培養(yǎng)基挑選菌落1.鑒別的方法：2.原理：剛果紅染色法剛果紅+纖維素→紅色復(fù)合物纖維素酶纖維二糖或葡萄糖→不產(chǎn)生紅色復(fù)合物菌落特征：具有透明圈

纖維素分解菌的篩選4.在篩選纖維素分解菌的培養(yǎng)基中加入剛果紅染料，研究者觀察到幾個(gè)有透明圈的菌落。據(jù)圖分析正確的是(

)C.圖中菌落可能是細(xì)菌也可能是真菌A.透明圈內(nèi)的剛果紅染料已被分解B.菌落②中的菌株降解纖維素能力最強(qiáng)D.圖中培養(yǎng)基可用牛肉膏、蛋白胨配制小本一、概念檢測(cè)

1.研究人員用無(wú)機(jī)鹽、瓊脂和石油配制的培養(yǎng)基從被石油污染的土壤中篩選出了一種石油降解菌。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）這種培養(yǎng)基是一種選擇培養(yǎng)基。（

）（2）利用這種石油降解菌可以降解石油。修復(fù)土壤。（

）（3）相對(duì)于未被污染的土壤,從被石油污染的土壤中更容易分離到石油降解菌。（

）√√√練習(xí)與應(yīng)用（P20）一、概念檢測(cè)

2.用稀釋涂布平板法來(lái)統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌數(shù)時(shí)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)就能推測(cè)出樣品中的活菌數(shù),原因是()A.菌落中的細(xì)菌數(shù)目是固定的B.平板上的一個(gè)菌落就是一個(gè)細(xì)菌C.通過(guò)此方法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)與活菌的實(shí)際數(shù)目相同D.平板上的一個(gè)菌落一般來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌D練習(xí)與應(yīng)用（P20）二、拓展應(yīng)用

1.反芻動(dòng)物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能分解尿素。請(qǐng)你設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)從瘤胃中分離出能夠分解尿素的微生物。提示：反芻動(dòng)物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會(huì)死亡，因此分離其中能分解尿素的微生物除了需要準(zhǔn)備選擇培養(yǎng)基，還應(yīng)該參照厭氧菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。練習(xí)與應(yīng)用（P20）二、拓展應(yīng)用（1）現(xiàn)在要從土壤中分離纖堆素分解菌,請(qǐng)你給出詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。（2）你打算到什么環(huán)境中去尋找纖維素分解菌？為什么？（3）有同學(xué)說(shuō),可以把濾紙埋在土壤中,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后,再?gòu)囊迅癄€的濾紙上篩選纖維素分解菌。請(qǐng)你評(píng)價(jià)這一做法。（1）可以參考本節(jié)“探究·實(shí)踐”中的設(shè)計(jì)思路進(jìn)行設(shè)計(jì)。

以纖維素為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基練習(xí)與應(yīng)用（P20）（2）纖維素分解菌大多分布在富含纖維素的環(huán)境中，采集土樣時(shí)，可以選擇纖維素豐富的環(huán)境，如樹林中多年落葉形成的腐殖土等。（3）這是人工設(shè)置適合纖維素分解菌生存的環(huán)境,腐爛的濾紙上很可能有纖維素分解菌。1、選擇培養(yǎng)基：允許

種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)

或

其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。原理：人為提供有利于目的菌生長(zhǎng)的條件（包括

、

和

），同時(shí)

或

其他微生物的生長(zhǎng)。用途：培養(yǎng)、、

出目標(biāo)微生物2、微生物選擇培養(yǎng)獲取純培養(yǎng)物的方法：

3、稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠___時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)____，來(lái)源于__________中的一個(gè)____；通過(guò)計(jì)數(shù)平板上的____數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少_____

。

計(jì)數(shù)原則：選擇菌落數(shù)為_______的平板計(jì)數(shù)

統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目____；原因：

__________________________________________

計(jì)算公式：

4、顯微鏡直接計(jì)數(shù)

優(yōu)點(diǎn)：

缺點(diǎn)：統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和，不能區(qū)分

與

。

計(jì)算公式：

5、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：絕大多數(shù)微生物都能利用

，但是只有能合成

的微生物才能分解

，利用以

作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。1、選擇培養(yǎng)基：允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。原理：人為提供有利于目的菌生長(zhǎng)的條件（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、和pH），同時(shí)抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)。用途：培養(yǎng)、分離、計(jì)數(shù)出目標(biāo)微生物2、微生物選擇培養(yǎng)獲取純培養(yǎng)物的方法：稀釋涂布平板法3、稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠___時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)____，來(lái)源于__________中的一個(gè)____；通過(guò)計(jì)數(shù)平板上的____數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少_____

。

計(jì)數(shù)原則：選擇菌落數(shù)為_______的平板計(jì)數(shù)

統(tǒng)計(jì)的菌落