免疫學(xué)檢測與防治2014傳閱 學(xué)習(xí)資料

一、免疫學(xué)檢測技術(shù)（二）二、免疫學(xué)防治本次課教學(xué)內(nèi)容P197第二十一章免疫學(xué)檢測及其應(yīng)用教學(xué)要求：1、掌握體外抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素；凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)與免疫標(biāo)記技術(shù)的原理和方法2、熟悉淋巴細(xì)胞的分離、鑒定及T細(xì)胞功能測定。3、了解B細(xì)胞功能測定；免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用。第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素第二節(jié)檢測抗原抗體的體外試驗第三節(jié)免疫細(xì)胞功能的檢測本章教學(xué)內(nèi)容BLOODTYPETEST抗原抗體反應(yīng)：是指抗原和抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。可發(fā)生于體內(nèi)（invivo），也可發(fā)生于體外（invitro）。簡介

在體內(nèi)（invivo），抗原抗體反應(yīng)是體液免疫的基礎(chǔ)Ag與Ab在體內(nèi)結(jié)合可發(fā)生中和作用、調(diào)理吞噬、溶菌效應(yīng)等

在體外（invitro）,Ag與Ab在體外結(jié)合，可出現(xiàn)凝集、沉淀、補(bǔ)體參與的溶血等反應(yīng)。臨床上一般多采用血清作試驗。所以體外的抗原抗體反應(yīng)又稱為血清學(xué)反應(yīng)。體外抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)和影響因素1．高度特異性：結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：由抗原表位與Ab

的CDR互補(bǔ)結(jié)合所決定。

----如抗白喉毒素只能與白喉毒素結(jié)合，不能與破傷風(fēng)毒素結(jié)合。是一切血清學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)。

----臨床上通過檢測Ag或Ab可以診斷或輔助診斷疾病。

一、體外抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)

Ag+AbAg-Ab

非共價結(jié)合，保持動態(tài)平衡，在一定條件下是可逆的。Ag-Ab復(fù)合物的解離程度，除受環(huán)境條件（溫度、PH、離子強(qiáng)度）影響之外，通常主要取決于Ag-Ab的親和力。2.可逆性親和力（affinity)：抗體分子上一個抗原結(jié)合部位與相應(yīng)抗原表位之間的互補(bǔ)結(jié)合的強(qiáng)度

抗原和抗體之間發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系，只有當(dāng)二者的濃度比例適當(dāng)時，才出現(xiàn)可見反應(yīng)。3．適宜的抗原抗體濃度和比例前帶后帶等價帶

網(wǎng)格學(xué)說(latticetheory)cross-linking4.階段性反應(yīng)階段特點(diǎn)①特異結(jié)合階段發(fā)生特異結(jié)合，但不出現(xiàn)可見反應(yīng);反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分。②可見反應(yīng)階段可見的反應(yīng)（凝集、沉淀、溶解細(xì)胞等），復(fù)合物受環(huán)境因素(pH、電解質(zhì)、溫度)的影響；反應(yīng)慢，常需數(shù)分鐘至數(shù)小時。在血清學(xué)反應(yīng)中，兩階段往往不能嚴(yán)格分開。

適量電解質(zhì)的存在，可使抗原抗體結(jié)合后呈現(xiàn)明顯的沉淀或凝集等反應(yīng)現(xiàn)象。無電解質(zhì)存在，不出現(xiàn)可見反應(yīng)現(xiàn)象。如果電解質(zhì)濃度過高，會出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。常用含生理鹽水(8.5g/L,0.9%NaCl)的溶液作為抗原和抗體的稀釋劑。1.電解質(zhì)二、影響抗原抗體反應(yīng)的因素

抗原抗體反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行，pH過高或過低，均可直接影響抗原抗體的反應(yīng)性。血清學(xué)反應(yīng)一般在pH6～8進(jìn)行。補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)及溶解反應(yīng)最適為pH7.2～7.4。2.酸堿度（pH）一定范圍內(nèi)，溫度升高可增加抗原與抗體分子碰撞的機(jī)會，加快二者結(jié)合速度。不宜過高過低，保持適當(dāng)。

血清學(xué)反應(yīng)一般以15～40℃為宜，最適為37℃。3.溫度

總之,血清學(xué)反應(yīng)影響因素較多，因此必須十分注意實驗條件的選擇和穩(wěn)定，必須做好嚴(yán)格的實驗對照

(例如，陽性對照positivecontrol、陰性對照negativecontrol、標(biāo)準(zhǔn)品對照standardcontrol等)，只有這樣才能保證結(jié)果準(zhǔn)確。4.其它：震搖混勻等三、免疫學(xué)檢測技術(shù)的類型第2節(jié)檢測抗原和抗體的體外試驗在一定條件下（溫度、PH、離子強(qiáng)度適宜），抗原與相應(yīng)抗體在體外可發(fā)生特異性結(jié)合，出現(xiàn)可檢測或觀測的現(xiàn)象。第2節(jié)檢測抗原和抗體的體外試驗1、定性檢測2、定量檢測一、概述據(jù)Ag性質(zhì)、出現(xiàn)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)成分不同分：二、檢測抗原和抗體的體外試驗類型（三）免疫標(biāo)記技術(shù)（一）凝集反應(yīng)（二）沉淀反應(yīng)（一）凝集反應(yīng)（Agglutinationreactions）

顆粒性抗原（細(xì)菌、細(xì)胞或表面包被抗原的顆粒）與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下特異性結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)塊的現(xiàn)象。

適宜的溫度、酸堿度、電解質(zhì)等顆粒性抗原直接與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象，如紅細(xì)胞凝集或細(xì)菌凝集。包括玻片凝集和試管凝集兩種檢測方法。1、直接凝集反應(yīng)玻片法：試管法：定性試驗半定量試驗，肥達(dá)氏反應(yīng)ABO血型鑒定、細(xì)菌鑒定（一）凝集反應(yīng)（Agglutinationreactions）將可溶性抗原或抗體先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。2、間接凝集反應(yīng)正向間接凝集：反向間接凝集：抗體致敏顆粒，測抗原抗原致敏顆粒，測抗體RBC，乳膠顆粒，活性炭（一）凝集反應(yīng)（Agglutinationreactions）（二）沉淀反應(yīng)（Precipiationreactions）

可溶性抗原（毒素、組織浸液及血清中的蛋白等）與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下特異性結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物。

原理和方法1、單向瓊脂擴(kuò)散應(yīng)用：Ig和補(bǔ)體C3的定量測定AFP或其他可溶性抗原測定抗原擴(kuò)散、沉淀環(huán)的直徑與抗原含量成正相關(guān)Ab+瓊脂制板打孔AgNSAgAg加樣觀察（含量）（二）沉淀反應(yīng)（Precipitationreactions）（二）沉淀反應(yīng)（Precipitationreactions）原理和方法2、雙向瓊脂擴(kuò)散應(yīng)用：①檢測可溶性抗原或抗體②測定稀釋免疫血清的效價（半定量）③對復(fù)雜的抗原或抗體成分進(jìn)行純度鑒定（三）免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelingtechniques）免疫標(biāo)記技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，以檢測抗原或抗體的一類試驗方法。常用標(biāo)記物：酶、熒光素、放射性核素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)及膠體金等特點(diǎn)：敏感性高，定性、定量、定位1、酶免疫測定法酶免疫組化技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)：測定可溶性抗原/抗體測定細(xì)胞表面或組織中的抗原Enzymelinkedimmunosorbentassay辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）將已知抗原或抗體吸附于固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌液將游離成分洗去；然后由酶標(biāo)試劑作用于底物顯色，通過酶標(biāo)儀測定有色產(chǎn)物光密度值（OD）對抗原抗體作定性定量檢測。方法：①雙抗體夾心法：圖ELISA原理：檢測抗原②間接法：圖檢測抗體③生物素-親和素系統(tǒng)—ELISA2、免疫熒光技術(shù)方法：應(yīng)用：直接法和間接法標(biāo)記物：異硫氰酸熒光素（FITC）圖藻紅蛋白（PE）傳染病診斷、測定CD分子、自身免疫病診斷每檢查一種抗原，須制備相應(yīng)的熒光抗體一抗熒光素標(biāo)記的二抗3、放射免疫測定法（RIA）應(yīng)用：標(biāo)記物：放射性核素131I和125I用于微量物質(zhì)（激素、藥物）測定，達(dá)pg/ml缺點(diǎn)：放射性核素污染設(shè)備條件要求高4、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)5、免疫膠體金技術(shù)圖

(Immunologicalcolloidalgoldsignature,ICS)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。6、免疫印跡技術(shù)：可定性及定量分析蛋白質(zhì)圖

FLASH第3節(jié)免疫細(xì)胞及其功能檢測（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）第3節(jié)免疫細(xì)胞及其功能檢測（一）外周血單個核細(xì)胞的分離一、免疫細(xì)胞的分離及數(shù)量測定FLASHPBMC：包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞Ficoll分離液法人靜脈血2ml/試管，抗凝每管加Hank’s液2ml，混勻是一種單次、差速、密度梯度離心的分離法。該法分離的單個核細(xì)胞純度可達(dá)95%，其中淋巴細(xì)胞約占90%~95%原理及方法：

根據(jù)表面標(biāo)志分離。將抗細(xì)胞表面標(biāo)志的抗體結(jié)合于固相載體結(jié)果：使具有相應(yīng)表面標(biāo)志的淋巴細(xì)胞與細(xì)胞懸液中其他細(xì)胞分開。CD4抗CD41．免疫吸附分離法（二）淋巴細(xì)胞及其亞群的分離原理：根據(jù)表面標(biāo)志分離。磁珠表面包被免疫物質(zhì)后稱免疫磁珠，可顯示免疫活性和磁性2．免疫磁珠分離法原理：根據(jù)表面標(biāo)志分離。T細(xì)胞—CD3、CD4、CD8

，B細(xì)胞—mIgD、mIgM3．免疫熒光法與流式細(xì)胞術(shù)原理淋巴細(xì)胞DNA合成增加蛋白合成增加淋巴母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿增多胞質(zhì)空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松二、免疫細(xì)胞的功能測定（一）淋巴細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)化試驗淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：

PHA----------T細(xì)胞

ConA----------T細(xì)胞

PWM----------T、B細(xì)胞

特異性刺激物：

異種抗原同種組織抗原

方法②3H-TdR摻入法③MTT法①形態(tài)計數(shù)法（四）細(xì)胞毒試驗：（六）細(xì)胞因子檢測：ELISPOTCTL、NK（二）遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）檢測：（三）抗體形成細(xì)胞測定：溶血空斑試驗圖（五）吞噬功能測定：2、簡述體外Ag-Ab反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素。3、常用的免疫標(biāo)記技術(shù)有哪些？4、ELISA的雙抗夾心法的原理及基本操作步驟5、簡述T淋巴細(xì)胞增殖試驗的基本原理。1、名詞：

凝集反應(yīng)，沉淀反應(yīng)，ELISA思考題*雙抗體夾心法：免疫教研室免疫檢測與防治免疫教研室免疫檢測與防治溶血空斑溶血空斑試驗：空斑數(shù)

=抗體生成細(xì)胞數(shù)空斑大小

=產(chǎn)生的抗體多少一個斑點(diǎn)表示一個分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的細(xì)胞教學(xué)要求：1、掌握人工主動免疫/人工被動免疫的概念、主要制劑；免疫治療的概念。2、熟悉疫苗的基本要求；計劃免疫的含義；免疫治療的基本手段。3、了解新型疫苗，疫苗的應(yīng)用；免疫治療的發(fā)展前景、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的概念。P209第二十二章免疫學(xué)防治

第1節(jié)免疫預(yù)防一、概述：始于接種“人痘”預(yù)防天花，死亡率從20％～30％降至1％～2％。是根據(jù)特異性免疫原理來預(yù)防疾病的方法。EdwardJenner接種“牛痘”成功，人類消滅了天花。免疫教研室免疫檢測與防治

自然免疫適應(yīng)性免疫的獲得方式：人工免疫自然主動免疫自然被動免疫人工主動免疫人工被動免疫是根據(jù)適應(yīng)性免疫原理，將疫苗、抗體、細(xì)胞因子等生物制品應(yīng)用于人體，使其獲得適應(yīng)性免疫，以預(yù)防某些疾病的方法。

二、人工主動免疫：概念：用（疫苗等）抗原物質(zhì)接種機(jī)體，使之主動產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而預(yù)防或治療疾病的措施。疫苗：疫苗的要求：國際上將細(xì)菌性制劑、病毒性制劑、類毒素等統(tǒng)稱為疫苗。安全、有效、實用

（一）傳統(tǒng)疫苗1、滅活疫苗（死疫苗）：兩種疫苗特性比較

表選用免疫原性強(qiáng)的病原體，經(jīng)人工大量培養(yǎng)后，用理化方法滅活制成。2、減毒活疫苗：將病原體在培養(yǎng)基或動物細(xì)胞中反復(fù)傳代，使其失去或降低毒力，但保留免疫原性。即由減毒或無毒的活病原微生物制成。

3、類毒素：細(xì)菌的外毒素經(jīng)0.3%～0.4%甲醛處理，失去毒性而保留了免疫原性，接種后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗毒素。1、亞單位疫苗：（二）新型疫苗2、結(jié)合疫苗：3、合成肽疫苗：4、基因工程疫苗：保留有效免疫原成分，HBsAgTI-Ag（如莢膜多糖）+載體→TD-AgDNA疫苗，重組載體疫苗，轉(zhuǎn)基因植物疫苗

（三）疫苗的應(yīng)用1、抗感染和計劃免疫我國計劃免疫程序表2、抗腫瘤3、計劃生育4、防治免疫病理損傷EB病毒疫苗，人乳頭瘤病毒疫苗抗HCG，抗ZP3是根據(jù)某些特定傳染病的疫情監(jiān)測和人群免疫狀況分析，有計劃地用疫苗進(jìn)行免疫接種，預(yù)防相應(yīng)傳染病，最終控制乃至消滅相應(yīng)傳染病的重要措施。

三、人工被動免疫：概念：給人體注射含有特異性抗體或細(xì)胞因子的制劑，使之被動獲得免疫應(yīng)答，以治療或緊急預(yù)防疾病的措施。人工主動免疫和人工被動免疫特點(diǎn)比較

第2節(jié)免疫治療一、概述免疫增強(qiáng)療法免疫抑制療法特異性免疫治療非特異性免疫治療主動免疫治療被動免疫治療免疫治療的基本策略是從分子、細(xì)胞和整體水平干預(yù)或調(diào)整機(jī)體的免疫功能。是指利用免疫學(xué)原理，針對疾病發(fā)生機(jī)制，人為地干預(yù)或調(diào)整機(jī)體的免疫功能，達(dá)到治療疾病目的所采取的措施。

二、常用制劑：（一）抗原類：1、抗感染免疫血清微生物抗原疫苗、瘤苗（二）抗體類：導(dǎo)向治療(放射性核素、化療藥物、毒素)

2、抗淋巴細(xì)胞丙種球蛋白(ALG）3、抗腫瘤抗體制劑4、抗細(xì)胞因子抗體移植排斥、某些自身免疫病的治療抗TNF-α治療類風(fēng)關(guān)等慢性炎癥pAbmAb5、抗細(xì)胞表面分子的單抗抗毒素血清、人Ig制劑抗CD20治療B淋巴細(xì)胞瘤

（三）細(xì)胞因子：1、造血干細(xì)胞移植骨髓移植、臍血轉(zhuǎn)輸：淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞2、過繼免疫療法LAK：腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞TIL（四）免疫細(xì)胞類：：細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞CIK3、細(xì)胞疫苗：腫瘤細(xì)胞疫苗，DC疫苗

（五）生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑：1、卡介苗、短小棒桿菌、多糖成分

BRM，具有促進(jìn)或調(diào)節(jié)免疫功能的制劑，通常對免疫功能正常者無影響，對免疫功能異常特別是免疫功能低下者有促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用2、胸腺肽、轉(zhuǎn)移因子、免疫核糖核酸環(huán)磷酰胺；環(huán)孢菌素A、FK-