《鐵皮石斛繁育種子袋生產(chǎn)技術規(guī)程》編制說明

《鐵皮石斛繁育種子袋生產(chǎn)技術規(guī)程評定》編制說明一、工作簡況（一）任務來源云南大學、廣南藥王谷生物科技有限公司提出并立項《鐵皮石斛繁育種子袋生產(chǎn)技術規(guī)程評定》團體標準制定項目，協(xié)會負責該團體標準的起草工作。（二）起草單位云南大學、廣南藥王谷生物科技有限公司、云南山里紅生物科技有限公司、云南省地理標志產(chǎn)業(yè)協(xié)會、云南地標運營產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司、地標游學養(yǎng)科技服務（云南）有限公（三）標準主要起草人------------二、制定標準的必要性和意義石斛屬（DendrobiumSw.）為蘭科（Orchidaceae）第二大屬，全世界約有1500～1600種，都為附生植物，主要分布于熱帶東南亞及大洋洲地區(qū)。蘭科植物能產(chǎn)生像塵埃一樣數(shù)量巨大的種子，種子非常細小，沒有胚乳，需要依靠特定的菌根真菌提供營養(yǎng)來促進其萌發(fā)和幼苗形成，萌發(fā)后的生長發(fā)育過程中也往往需要依賴與之共生的真菌，只有當真菌與幼苗的根形成共生菌根后，改善了水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收利用，植株才能正常地生長發(fā)育。利用菌根真菌來促進種子萌發(fā)和獲得幼苗，能顯著提高幼苗在自然環(huán)境中的存活率和生長速度，被認為是瀕危蘭科植物保護的重要途徑。對于藥用石斛產(chǎn)業(yè)而言，在大棚集約化栽培模式中，通過組織培養(yǎng)技術進行種子無菌萌發(fā)生產(chǎn)種苗，人工增施營養(yǎng)，利用農(nóng)藥控制病蟲害，在整個生產(chǎn)過程中，菌根真菌的作用被完全忽略，但在自然條件下開展藥用石斛的仿野生栽培，利用種子和特定的真菌共生萌發(fā)，并制備成真菌袋，不僅能簡化種苗生產(chǎn)過程，豐富種植場景，降低生產(chǎn)成本，更重要的是能有效地促進幼苗的生長和增強抗逆性，提高產(chǎn)品品質(zhì)，縮短生產(chǎn)周期，具有巨大的應用價“真菌-種子袋”是一種專門為鐵皮石斛種子在野外進行直播而設計的繁殖材料，通過將顯著促進鐵皮石斛種子萌發(fā)及幼苗建成的特定真菌菌粉、鐵皮石斛種子以及水苔等按照特定配比混合制成，解決了蘭科植物種子在自然條件下萌發(fā)和幼苗形成的問題，對于以收獲植株莖干為目的藥用鐵皮石斛仿野生栽培來說，是鐵皮石斛仿野生栽培技術的革命性突破。目前已利用“真菌-種子袋”技術開展仿野生栽培技術示范和推廣，初步形成了鐵皮石斛仿野生栽培產(chǎn)業(yè)，促進農(nóng)民增收和區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展，具有顯著的社會效益和經(jīng)濟效三、主要起草過程組建了包含云南大學、廣南藥王谷生物科技有限公司、云南山里紅生物科技有限公司、云南地標運營產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司、地標游學養(yǎng)科技服務（云南）有限公司的企業(yè)代表以及云南省地理標志產(chǎn)業(yè)協(xié)會內(nèi)部專家的標準起草組。本項目立項后，標準起草組通過調(diào)研、收集資料、分析研究起草了標準討論稿，由協(xié)會專家?guī)祀S機抽取專家，經(jīng)多次討論修改、召開研討會、聽取意見建議修改后形成了征求意見稿及編制說明。征求意見稿及編制說明形成后，在省、州市級行政管理部門、相關研究機構和地理標志產(chǎn)品相關產(chǎn)業(yè)的企業(yè)進行了廣泛的征求意見。共提出意見15個，標準起草單位或工作組對意見處理結果：采納13個，因其中一個專家建議刪除其中條款，所以未采納另一個專家對該條款的內(nèi)容修改。經(jīng)過對相關反饋意見進行分析研究和處理，對標準征求意見稿進行修改完善，形成《鐵皮石斛繁育種子袋生產(chǎn)技術規(guī)程》團體標準草案。四、編制的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標準的關系1、合規(guī)性原則標準起草要完全按照國家相關法律法規(guī)和產(chǎn)業(yè)政策標準的規(guī)定。2、可行性原則標準內(nèi)容和要求要具有可行性、適用性和可操作性。3、規(guī)范性原則編寫內(nèi)容與格式嚴格按照按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)（二）依據(jù)國家/省市相關法律法規(guī)、產(chǎn)業(yè)政策的規(guī)定和鐵皮石斛的研發(fā)、栽培、管理、采收和溯源管理等實際情況。五、標準主要條款的說明（一）真菌-種子袋Fungus-seedbags真菌-種子袋是一種專門為鐵皮石斛種子在野外進行直播而設計的繁殖材料，通過將顯著促進鐵皮石斛種子萌發(fā)及幼苗建成的特定真菌菌粉、鐵皮石斛種子以及水苔等按照一定的配比混合制成。（二）茶包袋透氣、易降解的紙質(zhì)茶包袋（長*寬：6.2*5.5cm）。（三）菌株菌株為從鐵皮石斛自然萌發(fā)的原球莖中分離獲得的菌體，該菌株通過形態(tài)和分子序列研究，為蠟殼耳科的一個真菌新種，定名為石斛蠟殼菌（SerendipitaofficinaleX.J.Wang），菌株在GenBank登錄號：MN173026；在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為：CCTCCNo:M2019744。（四）菌株活化利用接種環(huán)，從試管斜面中取出一小塊石斛蠟殼菌（SerendipitaofficinaleX.J.Wang）菌種，將菌塊置于平板中心，該平板預先準備好馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA；馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L,瓊脂20g/L，pH=5.8-6）；用封口膜將平板密封，放置在25±2℃的培養(yǎng)室中進行暗培養(yǎng)，約10天，待真菌菌絲長滿培養(yǎng)基表面，即可將其作為后續(xù)的接種物。（四）培養(yǎng)基培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB；配方：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L,pH=5.8-6）。分裝300ml培養(yǎng)基至錐形瓶（500ml）中，用錫箔紙密封好瓶口，然后將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶放入高壓滅菌鍋中，設定條件為121℃下滅菌20分鐘。滅菌完成后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上冷卻至室溫。（五）真菌擴繁在超凈工作臺上，使用已滅菌的尖鑷切取步驟4.2.2中預備的液體培養(yǎng)基中。接菌操作完成后，立即用錫箔紙密封定。將含有培養(yǎng)基和菌塊的錐形瓶放置于振蕩培養(yǎng)箱中，啟動儀器進行振蕩培養(yǎng)（25℃±2℃,200轉(zhuǎn)/分），以促進真菌的孵化擴繁。培養(yǎng)15天左右，菌絲就能長滿；冬季，可能需要延長培養(yǎng)時間至大約20天，以確保菌絲生長充分。（六）菌粉配制利用尼龍網(wǎng)過濾步驟4.2.4中得到的含有培養(yǎng)基和菌絲的混合液，以分離出菌絲。移除溶液，僅保留菌絲，并使其自然瀝干，得到純凈的菌絲。將純菌絲與瓊脂以1:2的重量比混合，放入多功能粉碎機中，先進行4秒的快速粉碎，然后暫停機器，等待儀器完全停止，打開蓋子，用干凈玻璃棒進行攪拌，確保菌絲充分粉碎，再次啟動粉碎機進行3秒的粉碎，以獲得粒徑均勻的菌粉。將得到的菌粉倒入不銹鋼托盤中，攤平、不超過1厘米的厚度。將托盤放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，在28℃的溫度下吹風烘干24-36小時（期間適當攪拌菌粉，確保菌粉充分干燥）。（七）鐵皮石斛種子活力檢驗鐵皮石斛種子使用前，先使用TTC（2,3,5-氯化三苯基以上，備用。具體方法見附錄A。（八）萌發(fā)率檢測試驗之后，使用高壓滅菌鍋對其進行滅菌處理，確保松樹皮的無菌狀態(tài)。冷卻后，將松樹皮均勻地鋪（厚度：2-3cm）到塑料飯盒中。手動將鐵皮石斛真菌-種子袋中的粉末抖均勻，并用干凈水源充分浸泡（浸泡5-10分鐘直至濕透。將濕潤的真菌-種子袋放置于松樹皮基質(zhì)上，緊接著蓋上飯盒蓋。最后將塑料飯盒放置在組織培養(yǎng)室內(nèi)（25℃±2℃,光照周期：12/12h光/暗，光照強度：2000lx）中進行共生萌發(fā)培養(yǎng)。（九）萌發(fā)率評估共生萌發(fā)培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計鐵皮石斛真菌-種子袋的萌發(fā)情況。萌發(fā)率（%）=成功萌發(fā)袋數(shù)/總袋數(shù)*100%。（十）菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末含水率檢驗菌粉+鐵皮石斛種子混合粉末長期貯存要求的含水率與鐵皮石斛種子貯存要求的含水率一致，因此統(tǒng)一按照GB/T3543.6的規(guī)定進行含水率檢驗。（十一）真菌-種子袋菌粉量檢驗使用天平依次稱重每袋真菌-種子袋的菌粉重量。（十二）檢驗結果判定上述報告中若有