流動相的選擇技巧

流動相的選擇技巧

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流動相的選擇技巧

常用做反相流動相的溶劑是甲醇和乙月青，甲醇有其性價比的優(yōu)勢，但是甲醇活性

高，可能與某些樣品發(fā)生反應，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈

敏度；乙睛雖然價格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強，很少與樣品發(fā)生反

應，用作流動相系統(tǒng)常用做反相流動相的溶劑是甲醇和乙般，甲醇有其性價比的優(yōu)勢，

但是甲醇活性高，可能與某些樣品發(fā)生反應，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低

分析方法的靈敏度；乙騰雖然價格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強，很少

與樣品發(fā)生反應，用作流動相系統(tǒng)壓力要比甲醇低很多，且截止波長比甲醇低20nm,增

加了檢測出在低波長下才有吸收的雜質(zhì)的可能性，所以我們一般傾向于多用乙晴，少用

甲醇。但是有時候樣品峰形不好或者分離不好，更換溶劑試試是一個很好的選擇，畢竟

不同的溶劑提供不同的選擇性。

對流動相的優(yōu)化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改善峰

形、提高分離度。流動相里加堿的情況比較少，主要還是加酸，常用的酸有磷酸、三氟

乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低

波長下沒有紫外吸收，而三氟乙酸在低波長下有，但是三朝乙酸易揮發(fā)而磷酸不行，所

以單純做液相，低波長下磷酸最合適，三氟乙酸有吸收，運行梯度時基線漂移很嚴重，

而做液質(zhì)就要考慮首選三氟乙酸了，近些年還比較流行加甲酸或乙酸。一般情況下這兒

種酸沒有太大區(qū)別，我們更多的是考慮通過加酸改變流動相的pH值，從而改善樣品的

分離度和峰形。

相同進樣量樣品峰越高則意味著峰形越好，從圖中可以看出多數(shù)樣品在低M值下

峰形都比中性要好，這個主要是由色譜柱本身的性質(zhì)所決定的。色譜柱主要都是硅膠基

質(zhì)，現(xiàn)有的填料處理工藝無法將硅膠上殘余的硅羥基全部去除，硅羥基會造成樣品峰拖

尾，一般認為硅羥基的pKa在到之間，低pH值能幫助抑制硅羥基的活性，減小拖尾，

從而改善峰形，提高分離度。水溶液中添加％（體積）的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在

2左右，用作流動相正好抑制硅羥基的活性，所以開發(fā)液相分析方法時流動相首選水加

01.%的磷酸，然后再以此為基礎(chǔ)做優(yōu)化。

在單獨用酸不行的時候就要考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡單、穩(wěn)定、

緩沖能力強、配制簡單，需要調(diào)pH值時要有相應的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，

主要是鉀鹽和鈉鹽，再有就是醋酸鹽，常用的鹽濃度在10~20初左右。以前因為色譜柱

填料生產(chǎn)工藝的問題，往往需要在流動相里添加三乙胺來減少拖尾，但是三乙胺對色譜

柱的壽命有很大影響，現(xiàn)在新的色譜柱都不再需要了。流動相里有時會需要調(diào)節(jié)pH值

到堿性，具體pH要視色譜柱的耐受范圍而定，常用NaOIKKOH溶液或氨水做為調(diào)節(jié)緩

沖鹽溶液堿性pH的試劑，也可以往水里單獨添加氨水做堿性流動相。

在緩沖鹽做流動相時，舟峰太早、峰形很差、相似結(jié)構(gòu)的化合物峰因為拖尾或峰型

太寬而不能達到基線分離時，可以考慮使用離子對試劑，常用的離子對試劑主要是各種

烷基磺酸鈉和四丁基錢鹽，但是流動相里使用離子對試劑時，系統(tǒng)需要的平衡時間長，

樣品保留時間不是很穩(wěn)定，因為離子對試劑的背景吸收基線會很差，且做完樣品后需要

長時間清洗，所以我們盡量不使用離子對試劑。

使用緩沖鹽時要注意流動相混合以后鹽可能析出的問題和鹽背景吸收導致基線漂移

嚴重的問題，尤其是在流動相里添加醋酸鏤以后，在低波長下梯度變化時基線下降非常

嚴重，嚴重影響對含量較小雜質(zhì)的準確定量，可以考慮在乙懵里加入10%的水，水中預

先加入10倍水溶液濃度的緩沖鹽，這樣梯度中A、B兩項鹽的濃度相同，可以避免基線

漂移嚴重的問題。

原料藥一般結(jié)構(gòu)式比較大，分子構(gòu)成比較復雜，開發(fā)分析方法時用水加磷酸效果可

能效果不好，通常還要求最少嘗試2和兩個pH值的磷酸鹽緩沖溶液，并依據(jù)結(jié)果對流

動相進行pH優(yōu)化，如效果不理想再進一步嘗試其它緩沖鹽溶液。開發(fā)中間體或者IPC

的分析方法時可以根據(jù)經(jīng)驗酌情簡化流動相的選擇過程。

分析方法選擇的基本原則

假如你想做一頓豐盛的晚餐，首先必須看一下食譜，然后檢查一下你所需的東西是

否齊全，如果少了配料還必須去商店購買，這樣你才可能做出一頓可口的晚餐。同樣進

行液相色譜分析時，也必須按照一定的程序進行，首先你必須要有專門的儀器和試劑，

然后有目的地選擇分析方法，這樣你才可能得到好的分析結(jié)果，避免走一些彎路。

二：柱子的選擇

在液相色譜分析方法中最重要的就是色譜柱的選擇，色譜分析人員面對幾百種色譜

柱，你從何入手呢?我采取的方法就是訂閱LCGC亞太版中RonMajors的“色譜柱觀

察”這一專欄，自1984（1）年以來，RonMajors在這一專欄中介紹許多新柱子、色譜柱

新技術(shù)、色譜柱使用方法等方面的信息。

現(xiàn)在大部分液相色譜分析都是使用反相色譜柱，其中以C18和C8柱最為流行。然

而色譜分析并不是流行歌曲，這兩種色譜柱之所以運用廣泛是因為在大多數(shù)情況下，使

用這兩種柱子都能獲得理想的分離效果。盡管一些樣品的分離并不是這兩種柱子（如表

一所示），但C18和C8經(jīng)常是最好的固定相，C18和C8柱兩者之間并無明顯的差別，

但在我們實驗室中以常使用的是C8柱。

色譜分析人員遇到的多數(shù)樣品需要利用反相色譜柱進行分析，但一些樣品可能需要

其它的分析技術(shù)才能成功地分離，這些樣品及分離方法在表一中作了簡要的敘述，在以

后的章節(jié)中將進一步闡述。

表一：樣品及分析方法

樣品的特性分析方法及色譜柱

大分子量專用色譜柱、離子交換柱、size-excusion色譜柱

手性異構(gòu)體手性色譜柱

其它異構(gòu)體（位置、立方體）正相色譜柱、沒有改性的二氧化硅柱

無機鹽混合物離子色譜分析

碳水化合物（糖類）反和氨基柱、離子交換法

在過去的15年中，高純度、低金屬雜質(zhì)含量的硅膠基質(zhì)色譜柱是最為實用的色譜

柱之一。但傳統(tǒng)色譜分析用的硅膠顆粒具有差異性及酸性表面，固定在柱子表面后，導

致出現(xiàn)拖尾峰，而且柱與柱之間的重現(xiàn)性較差。最近硅膠基質(zhì)中出現(xiàn)一種新的產(chǎn)品，這

種硅膠具有Metal-free特性，因此柱子性能更穩(wěn)定，重現(xiàn)性也更好，分離后峰的形狀

也很不錯。這種改性后的硅膠稱為B型硅膠。由于具有上述優(yōu)點，大多數(shù)色譜制造商都

用不同的名稱來表明它們與傳統(tǒng)的產(chǎn)品之間的不同，如Inuerlsil(日本)、

BDS(USA)、YMC-Base(USA)等等。大多數(shù)色譜柱制造商都生產(chǎn)以B型硅膠為基質(zhì)的色譜

柱，因此你可以選擇你所喜歡的供應商提供的產(chǎn)品。由于這種產(chǎn)品具有上述特性，建議

使用A型硅膠柱的改為使用B硅膠柱。

三：柱子尺寸規(guī)格的選擇

液相色譜分析時柱子選擇的另一個因素就是柱子大小、及填充顆粒的直徑(dp)的選

擇。最常用顆粒直徑為5um,但顆粒的直徑(dp)為及um的也適合分析使用，大多數(shù)

色譜工作者都喜歡使用顆粒直徑為5um的色譜柱，因為這種色譜柱具有很長的使用歷

更。顆粒的dp小意味著可以獲得較高的理論塔板數(shù)，但所需的柱壓增大，而且dp為

um的色譜柱易堵塞，所以一些色譜制造商又生產(chǎn)出dp為um的色譜柱。

在我們實驗室中經(jīng)常使用的是150mmX,dp為5uni的色譜柱。另一種可以選擇的

色譜柱為75nlmX,dp為Um的柱子，這種柱子的分離效果與前一種色譜柱分離效果相

似，但使用時間減小一半。這兩種柱子還有一個優(yōu)點就是在合理的壓力下

?2000psi),流速可以設(shè)定在之間，而流速高意味著可以縮短分析時間。

有些分析者建議使用30or50mm長的柱子作為前處理柱，但這種柱子不能提供足夠

的塔板數(shù)。另一種意見是使用窄孔柱(2mmid)或微孔柱(Wlnmiid),這兩種柱子所需的溶

劑少，但是這兩種柱子所需的某些儀器與正常使用的色譜儀有些不同，而且正處在一個

研究階段，建議等這兩種色譜柱研究成熟之后再使用。

150mmX,dp為5um的色譜柱最為常用，75mmX,dp為um的色譜柱也中較常

見,在一般情況下流速可設(shè)定為min。

四：有機相的選擇

獲得成功分離的另一個重要因素就是流動相有機溶劑的選擇，如果使用反相色譜柱

可以有三種有機溶劑可以選擇，甲醇、乙睛和四氫吠喃。每一種溶劑都有其獨特的優(yōu)

點，但色譜分析人員很少能預見哪一種溶劑更合適，所以具體選擇哪一種溶劑你必須充

分考慮同行的意見。

在我的實驗室中多數(shù)工作分析藥物中的成份，其中有些樣品的紫外吸收很弱，所以

分析時紫外檢測器的波長為220nm甚至更低，但是四氫吠喃的紫外吸收比較強，所以在

波長低于240nm時，就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度的甲醇在較低的波長下也可使

用，但是在低于220nm時，甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品及

空氣之間不發(fā)生作用，而四氫吠喃易分解，形成過氧化物，所以使用這種溶劑時須格外

小心。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，在四氫吠喃中加入水可以解決這個問題(4),但它與色譜柱

平衡所需的時間比甲醇、乙睛長，而且其不愉快的氣味也是一個不利因素。與四氫吠喃

相比，甲醇和乙月青的最大優(yōu)點是在柱壓較低的條件下，流速可控制在l-2nil/min之間。

考慮到理想溶劑的特點，如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用，而且使用方

便，所以首選的有機溶劑應是乙懵，當然利用甲醇作為有機溶劑的也較為常見。

五：水相的選擇

假如樣品為一般化合物，可以用水作為水相，然而離子化合物在藥物分析時普遍存

在，而這類化合物需要控制PH值才能得到很好的分離。如流動相的PH值必須高于或低

于樣品的個單位。在分析有機酸時，當PH值低于3時，色譜柱一般還比較穩(wěn)定，然而

當PH值高于8時，就需要緩沖液，因為此PH值己經(jīng)超出了二氧化硅的有效使用范圍。

寬PH值的二氧化硅柱也比較常見，但是對高PH值物質(zhì)的分離，很少有這方面的報道。

所以建議使用緩沖液來減少二氧化硅的流失。

考慮到樣品的特性及柱子的穩(wěn)定，建議在分析PH值較高的物質(zhì)時應使用緩沖液，

的磷酸鹽緩沖液（PH二是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀，那么就必

須選擇易揮發(fā)的緩沖液，盡管不如真正的緩沖液有用，但為Trifluoroacetic酸和乙酸

能夠滿足PH值的控制要求。

六：其它的因素在你選擇液相色譜的分析方法時，必須考慮到其它的一些因素，

匕如溫度。因為溫度變化1度，保留時間將變化1-3樂所以溫度控制十分重要，溫度的

變化還影響色譜柱的選擇性，這會使你更積極地投入到溫度選擇中去。在分析時柱溫一

般比室溫高一點（如35℃）,因為此溫易控制，而且在低壓下有利于降低溶劑的粘度，從

而降低柱壓。有時你需要利用其它的一些方法，如在流動相中加入部分特殊的物質(zhì)，不

過我建議最好在你實在必須時才用這種方法，記住KISS原則（Keepitsimple,

stupid）,不要使你的流動相過分復雜！

HPLC中梯度的優(yōu)化

梯度優(yōu)化主要是通過調(diào)節(jié)流動相的起始比例和梯度的斜率來調(diào)整樣品的保留時間，優(yōu)化

樣品的分離度。有機相起始比例越小，樣品保留時間越長，隨著梯度的改變，樣品出峰

的先后順序也有可能改變。我們做梯度優(yōu)化時主要調(diào)整梯度的起始比例和斜率?，F(xiàn)在的

色譜柱或者采度優(yōu)化主要是通過調(diào)節(jié)流動相的起始比例和梯度的斜率來調(diào)整樣品的保留

時間，優(yōu)化樣品的分離度。有機