偽狂犬病病毒pUL46與pUL16功能的深度解析與機制探究

偽狂犬病病毒pUL46與pUL16功能的深度解析與機制探究一、引言1.1偽狂犬病病毒概述偽狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV），又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，在分類學上屬于皰疹病毒科皰疹病毒亞科水痘病毒屬。1902年，匈牙利學者AladarAujeszky通過兔子接種試驗，將其與狂犬病相區(qū)別并定為一種獨立的疾病，為紀念他的研究成就，偽狂犬病也被稱為Aujeszky病。PRV粒子呈橢圓形或圓形，直徑為150-180nm，具有囊膜結構，囊膜上有呈放射狀排列的纖突，這些纖突由11種糖蛋白（gB、gC、gD、gE、gC、gH、gI、gK、gL、gM、gW、gN）形成，其中gB、gH和gL的基因是PRV復制所必需的。PRV的基因組為線形雙股DNA，長度約150kb，其G+C含量高達73%，在皰疹病毒中是最高的。這種高含量的G+C使得在體外PCR診斷時，對檢測引物和試劑有更高要求，使用常規(guī)PCR試劑檢測時容易出現(xiàn)假陰性結果。PRV對外界環(huán)境具有較強的抵抗力，耐熱性較好，在60℃下需30-50min才能使病毒失活，80℃下3min可滅活；在pH值為4-9時穩(wěn)定存在，在畜舍內干草上的病毒，夏季可存活30d，冬季可達46d。不過，PRV對一般的消毒劑如乙醚、氯仿、福爾馬林敏感，0.5%-1%NaOH可在短時間內使病毒失活，在低溫條件下，如-70℃以下能保存數(shù)年。PRV具有廣泛嗜性，能在多種動物組織細胞中增殖，包括雞胚成纖維細胞、豬、牛、猴等腎原代細胞，豬、牛睪丸細胞以及一些傳代細胞（如Hela細胞、PK-15細胞等）。在雞胚培養(yǎng)中，可通過絨毛尿囊膜、卵黃囊和尿囊腔途徑接種雞胚培養(yǎng)PRV，絨毛尿囊膜接種雞胚4d后，絨毛尿囊膜上會產生灰白色痘樣病變，嚴重時可侵入雞胚神經系統(tǒng)，引起雞胚死亡。PRV可感染各種哺乳動物，包括豬、牛、羊、犬、兔子、嚙齒動物和貓等，其中豬是唯一的自然宿主。不同年齡和種類的動物感染PRV后的癥狀有所不同。豬感染后，仔豬主要表現(xiàn)為神經癥狀，如運動失調、間歇性抽搐、昏迷以至衰竭死亡，還可侵害消化系統(tǒng)，導致厭食、嘔吐、腹瀉；成年豬常為隱性感染；妊娠母豬則表現(xiàn)為流產、死胎、弱胎、木乃伊胎。其他動物感染后，主要臨床癥狀為發(fā)熱、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎，癥狀類似狂犬病，故稱為偽狂犬病。偽狂犬病在全世界呈廣泛分布，給養(yǎng)豬業(yè)及其他相關動物產業(yè)帶來了巨大的危害。在美國、新西蘭和歐盟的許多成員國已經成功根除了PRV，但在世界范圍內的許多地區(qū)，PRV仍然呈散發(fā)流行狀態(tài)。長期以來，我國豬場采用弱毒疫苗免疫接種，使該病得到了一定程度的控制。然而，2011年底以來，我國多個免疫過Bartha-K61疫苗的規(guī)模化豬場相繼出現(xiàn)了變異PRV疫情，造成母豬流產率和仔豬死亡率升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經濟損失。2018年非洲豬瘟爆發(fā)后，全國性跨區(qū)域的種豬調運和三元種豬大量進入生產群，進一步導致偽狂犬病呈燎原之勢，目前仍有大量的規(guī)?；i場偽狂犬野毒抗體陽性率高居不下。除了對養(yǎng)豬業(yè)的經濟影響外，偽狂犬病毒還可以感染人，2017至2020年已報道了21例人感染偽狂犬病毒導致出現(xiàn)嚴重的神經癥狀和后遺癥，這也凸顯了對偽狂犬病進行深入研究和有效防控的重要性和緊迫性。1.2pUL46和pUL16研究的重要性對偽狂犬病病毒（PRV）的pUL46和pUL16進行研究，具有極其重要的意義，這主要體現(xiàn)在對理解病毒感染機制以及防控疫病這兩個關鍵方面。從理解病毒感染機制角度來看，PRV作為一種復雜的病毒，其感染過程涉及眾多基因和蛋白的相互作用。pUL46和pUL16作為病毒的重要組成部分，在病毒的生命周期中扮演著不可或缺的角色。pUL46可能參與病毒粒子的組裝與成熟過程，其具體作用機制的研究，有助于深入了解病毒如何在宿主細胞內完成自身結構的構建，從而實現(xiàn)高效的感染和傳播。比如，通過對pUL46在病毒組裝過程中與其他蛋白相互作用的研究，可以揭示病毒粒子形成的分子機制，為進一步探究病毒感染的起始階段提供關鍵線索。而pUL16則可能在病毒的吸附、侵入宿主細胞等早期感染步驟中發(fā)揮關鍵作用。研究其如何協(xié)助病毒突破宿主細胞的防御機制，成功進入細胞內部，對于全面認識PRV的感染途徑和致病機制具有重要價值。例如，研究pUL16與宿主細胞表面受體的結合特性，能夠明確病毒感染的特異性靶點，為后續(xù)開發(fā)針對性的抗病毒藥物提供理論基礎。在防控疫病方面，深入研究pUL46和pUL16可為疫苗研發(fā)提供新的靶點。目前，雖然已有針對PRV的疫苗，但隨著病毒的變異，現(xiàn)有的疫苗效果可能受到影響。通過對這兩個蛋白的研究，有望發(fā)現(xiàn)新的抗原表位，從而開發(fā)出更有效的新型疫苗，提高對PRV的免疫預防效果。以基因工程疫苗為例，若能基于pUL46和pUL16的結構和功能特點，設計出包含特定抗原表位的重組疫苗，將有可能增強疫苗對病毒變異株的免疫保護能力。此外，對pUL46和pUL16的研究還有助于開發(fā)更精準的診斷方法。通過檢測機體對這兩個蛋白的免疫反應，或者直接檢測病毒中pUL46和pUL16的存在及其表達水平，可以實現(xiàn)對PRV感染的早期、準確診斷，為疫病的防控爭取寶貴時間。在實際養(yǎng)殖生產中，快速準確的診斷方法能夠及時發(fā)現(xiàn)感染豬只，采取有效的隔離和治療措施，防止疫情的擴散，降低經濟損失。二、偽狂犬病病毒pUL46的功能研究2.1pUL46的結構特點pUL46是偽狂犬病病毒的一個重要組成部分，深入了解其結構特點對于探究病毒的感染機制和致病過程具有關鍵意義。從氨基酸序列角度來看，pUL46基因編碼的蛋白包含特定數(shù)量和排列順序的氨基酸殘基。通過對其氨基酸序列的分析，發(fā)現(xiàn)其中存在一些保守結構域，這些保守結構域在不同毒株的pUL46中具有高度相似性，暗示著它們在病毒的生命活動中發(fā)揮著重要且保守的功能。例如，某些保守結構域可能參與了蛋白質與蛋白質之間的相互作用，這對于病毒粒子的組裝、病毒基因的轉錄調控等過程至關重要。同時，序列中還存在一些可變區(qū)域，這些可變區(qū)域可能與病毒的進化、宿主適應性以及毒力變異等現(xiàn)象相關。不同地區(qū)分離的PRV毒株，其pUL46蛋白的可變區(qū)域可能存在差異，這種差異可能導致病毒在感染不同宿主或在不同環(huán)境下的感染特性和致病能力有所不同。在空間結構方面，pUL46蛋白呈現(xiàn)出獨特的三維構象。它由多個結構域組成，這些結構域通過特定的折疊方式相互作用，形成了穩(wěn)定的空間結構。其中，一些結構域形成了緊密的核心區(qū)域，為蛋白質的穩(wěn)定性提供了基礎；而另一些結構域則位于蛋白質的表面，參與了與其他分子的相互作用。通過X射線晶體學、核磁共振等技術手段，對pUL46蛋白的空間結構進行解析，發(fā)現(xiàn)其具有特定的二級結構，如α-螺旋和β-折疊等，這些二級結構進一步組裝形成了復雜的三級結構。這種精確的空間結構對于pUL46蛋白的功能發(fā)揮至關重要，任何結構上的改變都可能影響其與其他分子的結合能力，進而影響病毒的感染和復制過程。pUL46蛋白還具有與其他蛋白的相互作用位點，這些相互作用位點對于病毒的感染和致病過程同樣不可或缺。研究發(fā)現(xiàn)，pUL46能夠與病毒自身的多種蛋白相互作用，如與pUL47蛋白的相互作用，在病毒的基因轉錄激活過程中發(fā)揮著協(xié)同作用。pUL46和pUL47可以形成蛋白復合物，共同識別并結合到病毒基因的啟動子區(qū)域，促進病毒即刻早期基因的表達，從而啟動病毒的感染生命周期。此外，pUL46還能與宿主細胞內的一些蛋白發(fā)生相互作用，這種病毒-宿主蛋白之間的相互作用可能有助于病毒逃避宿主的免疫防御機制，或者利用宿主細胞的代謝途徑來滿足自身的復制和生存需求。比如，pUL46與宿主細胞內的某些信號通路相關蛋白相互作用，可能會干擾宿主細胞的正常信號傳導，從而為病毒的感染和增殖創(chuàng)造有利條件。2.2pUL46在病毒感染周期中的作用2.2.1病毒吸附與侵入在病毒感染的起始階段，吸附與侵入是關鍵步驟，pUL46在這一過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，pUL46可能參與了病毒與宿主細胞表面受體的識別與結合過程。通過一系列實驗，如利用基因敲除技術構建缺失pUL46基因的偽狂犬病病毒突變株，然后觀察其對宿主細胞的吸附能力變化。結果顯示，缺失pUL46基因的突變株在吸附宿主細胞時，吸附效率明顯低于野生型病毒。這表明pUL46對于病毒有效吸附到宿主細胞表面至關重要。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，pUL46可能通過與病毒表面的某些糖蛋白相互作用，間接影響病毒與宿主細胞表面受體的結合。例如，pUL46與gB、gD等參與病毒吸附的糖蛋白存在相互作用關系，這種相互作用可能會改變這些糖蛋白的構象，從而影響它們與宿主細胞表面受體的親和力。在某些細胞系的感染實驗中，當干擾pUL46與gD的相互作用后，病毒對宿主細胞的吸附能力顯著下降，說明pUL46通過影響糖蛋白與受體的結合，在病毒吸附過程中起到重要的調節(jié)作用。對于病毒侵入宿主細胞的過程，pUL46同樣有著不可忽視的影響。病毒侵入宿主細胞的方式主要有直接穿透細胞膜和內吞作用兩種。有研究推測，pUL46可能參與調節(jié)病毒侵入的具體方式。在對不同細胞類型的感染研究中發(fā)現(xiàn)，當pUL46正常表達時，病毒更傾向于通過某種特定的侵入方式進入細胞，而當pUL46表達受到抑制時，病毒的侵入方式可能會發(fā)生改變，且侵入效率也會受到影響。這可能是因為pUL46參與了病毒與細胞膜融合的相關過程，或者影響了細胞內吞病毒的機制。比如，pUL46可能與宿主細胞內的一些參與內吞作用的蛋白相互作用，調控內吞體的形成和運輸，從而影響病毒的侵入效率。在對細胞內吞相關蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)當pUL46缺失時，細胞內吞相關蛋白的分布和功能發(fā)生變化，進而影響了病毒的侵入過程。2.2.2病毒基因轉錄與復制在病毒基因轉錄起始階段，pUL46起著關鍵的調控作用。病毒基因轉錄起始需要多種轉錄因子和病毒蛋白的協(xié)同參與。研究發(fā)現(xiàn)，pUL46能夠與病毒的即刻早期基因啟動子區(qū)域結合，招募轉錄相關的酶和因子，從而促進轉錄起始復合物的形成。通過染色質免疫沉淀（ChIP）實驗，可以檢測到pUL46與即刻早期基因啟動子區(qū)域的特異性結合。在缺失pUL46的情況下，轉錄起始復合物的形成效率明顯降低，導致即刻早期基因的轉錄水平顯著下降。這表明pUL46在病毒基因轉錄起始過程中，通過與啟動子區(qū)域的結合，為轉錄起始提供了必要的條件，促進了病毒基因表達的啟動。在病毒基因轉錄延伸階段，pUL46同樣發(fā)揮著重要功能。轉錄延伸過程中，RNA聚合酶需要沿著DNA模板穩(wěn)定移動，合成RNA分子。pUL46可能通過與RNA聚合酶以及其他轉錄延伸相關因子相互作用，影響轉錄延伸的速率和準確性。有研究表明，pUL46能夠與一些轉錄延伸因子形成復合物，這些復合物可以調節(jié)RNA聚合酶在DNA模板上的移動速度，避免轉錄過程中的停頓和錯誤。在體外轉錄實驗中，加入pUL46蛋白后，轉錄延伸的效率和準確性得到顯著提高，而當pUL46缺失時，轉錄延伸過程中出現(xiàn)更多的異常終止和錯誤，說明pUL46對于維持病毒基因轉錄延伸的正常進行至關重要。對于病毒DNA復制過程，pUL46也有著不可或缺的作用。病毒DNA復制需要一系列的酶和蛋白參與，形成復雜的復制復合物。pUL46可能參與了復制復合物的組裝和穩(wěn)定過程。研究發(fā)現(xiàn)，pUL46能夠與病毒的DNA聚合酶以及其他參與DNA復制的蛋白相互作用，促進它們在復制起始位點的聚集，形成有活性的復制復合物。在缺失pUL46的情況下，復制復合物的組裝受到阻礙，DNA復制效率明顯降低。此外，pUL46還可能通過調節(jié)宿主細胞內的代謝環(huán)境，為病毒DNA復制提供所需的物質和能量。例如，pUL46可以影響宿主細胞內的核苷酸代謝途徑，確保有足夠的核苷酸供病毒DNA合成使用。2.2.3病毒裝配與釋放在病毒粒子裝配過程中，pUL46參與了多個關鍵環(huán)節(jié)。病毒粒子的裝配是一個復雜的過程，涉及病毒基因組、結構蛋白和被膜蛋白等的有序組裝。pUL46作為被膜蛋白的一種，在病毒粒子的結構完整性和功能方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，pUL46能夠與其他被膜蛋白相互作用，形成穩(wěn)定的蛋白復合物，這些復合物是病毒粒子裝配的重要組成部分。通過蛋白質相互作用實驗，如酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術，可以鑒定出pUL46與多種被膜蛋白之間存在直接或間接的相互作用。在缺失pUL46的情況下，病毒粒子的裝配出現(xiàn)異常，無法形成完整的病毒粒子結構，導致病毒的感染性顯著降低。這表明pUL46在病毒粒子裝配過程中，通過與其他被膜蛋白的相互作用，參與了病毒粒子的結構構建，保證了病毒粒子的正常裝配。pUL46還可能參與了病毒基因組與結構蛋白的組裝過程。病毒基因組需要與特定的結構蛋白結合，形成核衣殼，然后再與被膜蛋白組裝成完整的病毒粒子。有研究推測，pUL46可能在病毒基因組與結構蛋白的識別和結合過程中發(fā)揮作用，促進核衣殼的形成。在對病毒裝配過程的電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)，當pUL46正常表達時，病毒基因組與結構蛋白能夠有序地組裝成核衣殼，而當pUL46缺失時，核衣殼的形成出現(xiàn)紊亂，病毒基因組與結構蛋白的結合也受到影響，進一步證明了pUL46在病毒基因組與結構蛋白組裝過程中的重要性。在病毒從宿主細胞釋放過程中，pUL46也發(fā)揮著重要作用。病毒的釋放方式主要有裂解性釋放和出芽釋放兩種。研究表明，pUL46可能參與調節(jié)病毒的釋放方式和效率。對于一些通過出芽釋放的病毒，pUL46可能與宿主細胞膜上的某些蛋白相互作用，促進病毒粒子從細胞膜上出芽釋放。在對細胞表面蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，pUL46能夠與宿主細胞膜上的特定蛋白結合，改變細胞膜的局部結構和流動性，為病毒粒子的出芽釋放創(chuàng)造有利條件。在缺失pUL46的情況下，病毒的出芽釋放效率明顯降低，病毒粒子在細胞內積累。此外，pUL46還可能影響病毒釋放過程中的宿主細胞反應，例如調節(jié)宿主細胞的凋亡程序，避免宿主細胞過早凋亡，從而保證病毒能夠完成裝配和釋放過程。2.3pUL46對宿主細胞的影響pUL46對宿主細胞的生理功能有著多方面的顯著影響。在細胞代謝方面，研究發(fā)現(xiàn)pUL46能夠干擾宿主細胞的能量代謝途徑。通過對感染PRV的細胞進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)細胞內的糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝等過程均發(fā)生了改變。在糖代謝方面，pUL46可能影響了糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)中的關鍵酶活性，導致細胞內葡萄糖的攝取和利用發(fā)生變化，進而影響細胞的能量供應。在脂代謝方面，pUL46可能干擾了脂肪酸的合成和分解過程，影響細胞內脂質的組成和分布，這可能與病毒粒子的膜結構形成和病毒的組裝過程有關。在氨基酸代謝方面，pUL46可能影響了某些氨基酸的轉運和代謝，導致細胞內氨基酸水平失衡，從而影響蛋白質的合成和細胞的正常生理功能。pUL46還會影響宿主細胞的信號通路。在細胞周期調控相關的信號通路中，pUL46能夠干擾細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細胞周期蛋白（Cyclin）的表達和活性，使細胞周期進程發(fā)生紊亂。研究表明，pUL46可以通過與細胞內的一些信號分子相互作用，抑制細胞從G1期向S期的過渡，導致細胞周期阻滯在G1期。這種細胞周期的改變可能有利于病毒利用宿主細胞的物質和能量進行自身的復制和增殖，同時也可能影響宿主細胞的正常生長和分化。在細胞凋亡信號通路中，pUL46也發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。pUL46可以抑制細胞凋亡的發(fā)生，從而為病毒的復制和傳播提供有利的細胞環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，pUL46能夠與細胞凋亡相關的蛋白，如Bcl-2家族蛋白和半胱天冬酶（Caspase）等相互作用，調節(jié)它們的活性和表達水平。pUL46可以上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時抑制促凋亡蛋白Bax的活性，從而抑制細胞凋亡的啟動。此外，pUL46還可能通過抑制Caspase的激活，阻斷細胞凋亡的執(zhí)行過程，使得宿主細胞能夠在感染病毒后繼續(xù)存活，為病毒的復制和傳播提供條件。三、偽狂犬病病毒pUL16的功能研究3.1pUL16的結構特征pUL16作為偽狂犬病病毒的重要組成部分，其結構特征對于理解病毒的感染機制和致病過程具有重要意義。從氨基酸序列層面來看，pUL16由特定數(shù)量的氨基酸殘基按照獨特的順序排列而成。對其氨基酸序列的分析顯示，其中存在多個保守區(qū)域。這些保守區(qū)域在不同毒株的pUL16中高度相似，暗示著它們在病毒的生命活動中承擔著關鍵且保守的功能。例如，某些保守區(qū)域可能參與了蛋白質與其他分子的相互作用過程，這對于病毒粒子的組裝、病毒與宿主細胞的相互作用等環(huán)節(jié)至關重要。同時，序列中也存在一些可變區(qū)域，這些可變區(qū)域可能與病毒的進化、宿主適應性以及毒力變異等現(xiàn)象密切相關。不同地區(qū)分離得到的PRV毒株，其pUL16蛋白的可變區(qū)域可能存在差異，這種差異可能導致病毒在感染不同宿主或在不同環(huán)境下的感染特性和致病能力發(fā)生變化。在空間結構方面，pUL16蛋白呈現(xiàn)出獨特而復雜的三維構象。它由多個結構域組成，這些結構域通過特定的折疊方式相互作用，形成了穩(wěn)定的空間結構。其中，一些結構域構成了緊密的核心區(qū)域，為蛋白質的穩(wěn)定性提供了堅實基礎；而另一些結構域則位于蛋白質的表面，參與了與其他分子的相互作用。借助X射線晶體學、核磁共振等先進技術手段對pUL16蛋白的空間結構進行解析，發(fā)現(xiàn)其具有特定的二級結構，如α-螺旋和β-折疊等，這些二級結構進一步組裝形成了復雜的三級結構。這種精確的空間結構對于pUL16蛋白的功能發(fā)揮起著決定性作用，任何結構上的細微改變都可能影響其與其他分子的結合能力，進而對病毒的感染和復制過程產生重大影響。pUL16蛋白還具有多個修飾位點，這些修飾位點在病毒的感染過程中發(fā)揮著重要的調控作用。常見的修飾方式包括磷酸化、糖基化等。磷酸化修飾可以改變pUL16蛋白的電荷分布和構象，從而影響其與其他蛋白的相互作用以及在細胞內的定位。研究發(fā)現(xiàn)，在病毒感染宿主細胞的過程中，pUL16蛋白的某些絲氨酸、蘇氨酸殘基會發(fā)生磷酸化修飾，這種修飾可能與病毒的吸附、侵入以及基因轉錄等過程相關。糖基化修飾則可以增加pUL16蛋白的穩(wěn)定性，同時也可能參與病毒與宿主細胞表面受體的識別和結合過程。通過對pUL16蛋白糖基化位點的研究，發(fā)現(xiàn)某些糖基化修飾可以增強病毒對宿主細胞的親和力，促進病毒的感染。3.2pUL16在病毒感染過程中的功能3.2.1與病毒增殖的關系pUL16在偽狂犬病病毒的增殖過程中扮演著重要角色。通過一系列嚴謹?shù)膶嶒炑芯?，能夠清晰地揭示其與病毒增殖之間的緊密聯(lián)系。在病毒感染宿主細胞的實驗中，科研人員運用基因編輯技術，構建了缺失pUL16基因的PRV突變株。將該突變株與野生型PRV分別感染相同類型和數(shù)量的宿主細胞，如常用的豬腎細胞系PK-15細胞。在感染后的不同時間點，采用實時熒光定量PCR技術檢測細胞內病毒基因組的拷貝數(shù)，以此來評估病毒的增殖情況。實驗結果顯示，在感染后的早期階段，野生型PRV感染的細胞內病毒基因組拷貝數(shù)迅速增加，而缺失pUL16基因的突變株感染的細胞內病毒基因組拷貝數(shù)增長速度明顯緩慢。隨著感染時間的延長，這種差異更加顯著，表明pUL16基因的缺失嚴重影響了病毒的增殖能力。進一步的蝕斑實驗也驗證了這一結果。在蝕斑實驗中，將不同稀釋度的野生型PRV和缺失pUL16基因的突變株分別接種到鋪滿單層細胞的培養(yǎng)板上，經過一定時間的培養(yǎng)后，用中性紅染色，觀察蝕斑的形成情況。結果發(fā)現(xiàn)，野生型PRV形成的蝕斑數(shù)量多且清晰，大小較為均勻；而缺失pUL16基因的突變株形成的蝕斑數(shù)量明顯減少，且蝕斑較小，這進一步說明pUL16對于病毒在細胞內的增殖和擴散具有重要的促進作用。從病毒增殖的各個階段來看，pUL16可能在病毒的吸附、侵入以及基因組復制等環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。在病毒吸附階段，pUL16可能通過與病毒表面的其他蛋白相互作用，影響病毒與宿主細胞表面受體的結合效率，從而影響病毒的吸附過程。在侵入階段，pUL16可能參與調節(jié)病毒進入宿主細胞的方式和效率，確保病毒能夠順利進入細胞內部。在病毒基因組復制階段，pUL16可能與病毒的復制酶或其他參與復制的蛋白相互作用，促進病毒基因組的復制，為病毒的增殖提供充足的遺傳物質基礎。3.2.2與宿主蛋白的相互作用pUL16與宿主蛋白之間存在著復雜的相互作用關系，這種相互作用對病毒感染以及宿主細胞的生理活動產生了深遠的影響。以凋亡誘導因子1（AIFM1）與pUL16的相互作用為例，研究發(fā)現(xiàn)AIFM1能與豬偽狂犬病病毒的pUL16發(fā)生特異性結合。通過免疫共沉淀實驗，可以清晰地檢測到AIFM1與pUL16在細胞內形成的蛋白復合物。從功能影響角度來看，AIFM1原本是一個結構復雜的線粒體蛋白，能優(yōu)化線粒體呼吸鏈的功能、參與氧化還原代謝，同時也是第一個被發(fā)現(xiàn)的caspase非依賴性的凋亡蛋白。當AIFM1與pUL16相互作用后，其功能發(fā)生了顯著變化。過表達AIFM1的實驗表明，AIFM1能夠抑制PRV的增殖。這可能是因為AIFM1通過與pUL16結合，干擾了pUL16在病毒增殖過程中的正常功能，從而影響了病毒的吸附、侵入、基因組復制或裝配等環(huán)節(jié)。例如，AIFM1與pUL16的結合可能改變了pUL16的構象，使其無法與其他病毒蛋白或宿主蛋白正常相互作用，進而影響了病毒的增殖進程。而pUL16也能減弱AIFM1對病毒增殖的抑制作用。這可能是由于pUL16在與AIFM1結合后，通過某種機制降低了AIFM1的活性，或者干擾了AIFM1參與的抗病毒信號通路，使得AIFM1無法有效地發(fā)揮其抑制病毒增殖的功能。在PRV感染細胞的過程中，激光共聚焦和流式試驗顯示，AIFM1從線粒體易位至細胞核，且AIFM1增強了PRV引起的細胞凋亡。這表明pUL16與AIFM1的相互作用不僅影響了病毒的增殖，還改變了宿主細胞的凋亡進程。AIFM1從線粒體易位至細胞核可能是其發(fā)揮抗病毒作用的一種方式，而pUL16與AIFM1的相互作用可能干擾了這一過程，從而影響了細胞凋亡的調控，為病毒的生存和繁殖創(chuàng)造了有利條件。3.3pUL16在病毒免疫逃逸中的作用pUL16在偽狂犬病病毒的免疫逃逸過程中扮演著關鍵角色，它通過多種巧妙的機制幫助病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，從而在宿主體內得以生存、復制和傳播。從干擾免疫細胞活化的角度來看，pUL16能夠與免疫細胞表面的特定受體結合，從而阻止免疫細胞的活化。以T淋巴細胞為例，T淋巴細胞在機體的細胞免疫中發(fā)揮著核心作用，其活化需要抗原呈遞細胞（APC）呈遞抗原，并通過T細胞受體（TCR）與抗原-主要組織相容性復合體（MHC）復合物相互作用，同時還需要共刺激信號的參與。研究發(fā)現(xiàn)，pUL16可以與T淋巴細胞表面的某些共刺激分子受體結合，阻斷共刺激信號的傳遞，使得T淋巴細胞無法被有效活化。在體外實驗中，將表達pUL16的細胞與T淋巴細胞共同培養(yǎng)，檢測T淋巴細胞的活化標志物表達情況，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，實驗組中T淋巴細胞表面的CD25、CD69等活化標志物的表達明顯降低，表明T淋巴細胞的活化受到了抑制。這一結果說明pUL16通過干擾T淋巴細胞的活化，削弱了機體的細胞免疫應答，為病毒逃避細胞免疫攻擊創(chuàng)造了條件。pUL16還可以干擾免疫細胞內的信號傳導通路，抑制免疫細胞的功能。在免疫細胞中，存在著一系列復雜的信號傳導通路，這些通路的正常激活對于免疫細胞發(fā)揮功能至關重要。例如，在巨噬細胞中，Toll樣受體（TLR）信號通路在識別病原體相關分子模式（PAMP）后被激活，進而引發(fā)一系列的免疫反應，包括產生細胞因子、趨化因子等。研究表明，pUL16能夠抑制TLR信號通路中的關鍵信號分子的活性，如MyD88、TRIF等。通過蛋白質免疫印跡實驗（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，在感染表達pUL16的病毒的巨噬細胞中，MyD88和TRIF的磷酸化水平明顯降低，下游的核因子κB（NF-κB）的活化也受到抑制，導致細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等的產生減少。這使得巨噬細胞的吞噬和殺傷病原體的能力下降，無法有效地清除病毒感染，從而幫助病毒逃避了巨噬細胞介導的免疫防御。在抑制免疫應答方面，pUL16能夠抑制干擾素的產生和信號轉導。干擾素是機體抗病毒感染的重要免疫因子，具有廣譜的抗病毒活性。在病毒感染宿主細胞后，宿主細胞會通過模式識別受體（PRR）識別病毒的核酸等PAMP，進而激活干擾素基因的表達。pUL16可以干擾這一過程，研究發(fā)現(xiàn)，pUL16能夠與參與干擾素基因表達調控的轉錄因子相互作用，抑制它們的活性，從而減少干擾素的產生。在病毒感染的細胞中，通過定量PCR檢測干擾素mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)感染表達pUL16的病毒的細胞中，干擾素mRNA的表達量明顯低于感染正常病毒的細胞。此外，pUL16還可以抑制干擾素信號轉導通路。干擾素與其受體結合后，會激活JAK-STAT信號通路，使信號轉導和轉錄激活因子（STAT）磷酸化并轉位到細胞核內，調節(jié)干擾素刺激基因（ISG）的表達，發(fā)揮抗病毒作用。pUL16可以抑制JAK激酶的活性，或者干擾STAT的磷酸化和轉位過程，從而阻斷干擾素信號的傳遞，使細胞無法有效地產生抗病毒蛋白，為病毒的生存和復制提供了有利條件。pUL16還可能通過誘導免疫耐受，使宿主免疫系統(tǒng)不再對病毒產生有效的免疫應答。免疫耐受是指機體免疫系統(tǒng)對特定抗原的特異性無應答狀態(tài)。研究推測，pUL16可能通過調節(jié)調節(jié)性T細胞（Treg）的活化和擴增來誘導免疫耐受。Treg細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，能夠抑制其他免疫細胞的活性。pUL16可能通過與抗原呈遞細胞相互作用，促進Treg細胞的活化和擴增，增加Treg細胞在免疫微環(huán)境中的比例。在病毒感染的動物模型中，檢測Treg細胞的數(shù)量和功能，發(fā)現(xiàn)感染表達pUL16的病毒的動物體內，Treg細胞的數(shù)量明顯增加，且其抑制功能增強，導致機體對病毒的免疫應答減弱，病毒得以在體內持續(xù)存在和傳播。四、pUL46和pUL16功能的比較與聯(lián)系4.1功能相似性分析在病毒感染周期中，pUL46和pUL16在多個關鍵環(huán)節(jié)展現(xiàn)出功能相似性，尤其是在病毒裝配與釋放過程中。在病毒裝配環(huán)節(jié)，二者都參與了病毒粒子結構的構建過程。pUL46作為被膜蛋白，能與其他被膜蛋白相互作用，形成穩(wěn)定的蛋白復合物，參與病毒粒子的結構完整性維持。研究表明，通過免疫共沉淀實驗，可檢測到pUL46與多種被膜蛋白存在直接的相互作用，這些相互作用對于病毒粒子的正確組裝至關重要，缺失pUL46會導致病毒粒子裝配異常，無法形成完整的病毒粒子結構。而pUL16同樣在病毒裝配中發(fā)揮作用，雖然其具體作用機制與pUL46有所不同，但也參與了病毒粒子的某些組裝過程。有研究推測，pUL16可能與病毒的核心結構蛋白相互作用，協(xié)助病毒基因組與結構蛋白的組裝，形成具有感染性的病毒粒子。在對病毒裝配過程的電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)，當pUL16正常表達時，病毒基因組與結構蛋白能夠有序地組裝成核衣殼，而當pUL16缺失時，核衣殼的形成出現(xiàn)紊亂，這表明pUL16在病毒裝配過程中起到了不可或缺的作用。在病毒釋放環(huán)節(jié)，pUL46和pUL16都對病毒從宿主細胞的釋放產生影響。pUL46可能通過與宿主細胞膜上的某些蛋白相互作用，促進病毒粒子從細胞膜上出芽釋放。研究發(fā)現(xiàn)，pUL46能夠與宿主細胞膜上的特定蛋白結合，改變細胞膜的局部結構和流動性，為病毒粒子的出芽釋放創(chuàng)造有利條件。在缺失pUL46的情況下，病毒的出芽釋放效率明顯降低，病毒粒子在細胞內積累。pUL16同樣可能參與調節(jié)病毒的釋放過程，雖然其作用方式與pUL46不完全相同，但也對病毒的釋放效率和方式產生影響。有研究表明，pUL16可能通過影響宿主細胞內的某些信號通路，間接調控病毒的釋放過程。在對感染PRV的細胞進行信號通路分析時發(fā)現(xiàn)，當pUL16正常表達時，細胞內與病毒釋放相關的信號通路被激活，而當pUL16缺失時，這些信號通路的活性受到抑制，導致病毒釋放受阻。4.2功能差異性分析在病毒感染機制中，pUL46和pUL16對宿主細胞不同信號通路的影響存在顯著差異，這也體現(xiàn)了它們在病毒感染過程中功能的差異性。在細胞周期調控信號通路方面，pUL46主要通過干擾細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細胞周期蛋白（Cyclin）的表達和活性，使細胞周期進程發(fā)生紊亂。研究表明，pUL46可以抑制細胞從G1期向S期的過渡，導致細胞周期阻滯在G1期。這種作用可能是pUL46與細胞內的某些信號分子相互作用，抑制了相關基因的轉錄和翻譯，從而影響了CDK和Cyclin的表達水平。通過對感染PRV的細胞進行蛋白質免疫印跡實驗（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，在感染早期，pUL46表達上調后，細胞內CyclinD1和CDK4的蛋白表達水平明顯降低，導致細胞周期進程受阻。而pUL16對細胞周期調控信號通路的影響則有所不同。研究發(fā)現(xiàn)，pUL16可能通過調節(jié)細胞內的某些生長因子信號通路，間接影響細胞周期。在感染PRV的細胞中，pUL16的表達會導致細胞內表皮生長因子受體（EGFR）信號通路的激活。pUL16可以與EGFR相互作用，促進EGFR的磷酸化，進而激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號通路。該信號通路的激活會影響細胞周期相關蛋白的表達，如上調CyclinE和CDK2的表達，促進細胞從G1期進入S期。通過對感染PRV的細胞進行免疫熒光和流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，在pUL16表達較高的細胞中，CyclinE和CDK2的蛋白表達水平顯著升高，細胞周期進程加快。在細胞凋亡信號通路方面，pUL46和pUL16也發(fā)揮著不同的作用。pUL46主要通過抑制細胞凋亡的發(fā)生，為病毒的復制和傳播提供有利的細胞環(huán)境。研究表明，pUL46能夠與細胞凋亡相關的蛋白，如Bcl-2家族蛋白和半胱天冬酶（Caspase）等相互作用，調節(jié)它們的活性和表達水平。pUL46可以上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時抑制促凋亡蛋白Bax的活性，從而抑制細胞凋亡的啟動。此外，pUL46還可能通過抑制Caspase的激活，阻斷細胞凋亡的執(zhí)行過程。在對感染PRV的細胞進行凋亡檢測實驗中，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，在pUL46正常表達的細胞中，凋亡細胞的比例明顯低于對照組，說明pUL46能夠有效抑制細胞凋亡。pUL16在細胞凋亡信號通路中的作用則較為復雜。一方面，pUL16可以與凋亡誘導因子1（AIFM1）相互作用，抑制AIFM1對病毒增殖的抑制作用，從而間接影響細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，AIFM1是一種caspase非依賴性的凋亡蛋白，能夠誘導細胞凋亡。當AIFM1與pUL16相互作用后，AIFM1的功能受到抑制，其誘導細胞凋亡的能力減弱。另一方面，pUL16可能通過激活細胞內的某些應激信號通路，在一定程度上促進細胞凋亡。在感染PRV的細胞中，pUL16的表達會導致細胞內的內質網應激信號通路激活，上調CHOP等促凋亡蛋白的表達，從而促進細胞凋亡。通過對感染PRV的細胞進行免疫印跡和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，在pUL16表達較高的細胞中，CHOP蛋白的表達水平顯著升高，細胞凋亡的比例也相應增加。這表明pUL16在細胞凋亡信號通路中具有雙重作用，其具體作用可能取決于病毒感染的階段和細胞的微環(huán)境。4.3相互作用關系研究為深入探究pUL46和pUL16是否存在直接或間接的相互作用，以及這種作用對病毒感染的影響，科研人員開展了一系列嚴謹且深入的實驗研究。在蛋白質相互作用實驗中，首先運用酵母雙雜交技術，構建了分別包含pUL46和pUL16基因的誘餌載體和獵物載體。將這些載體轉化至酵母細胞中，通過觀察酵母細胞在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上的生長情況以及β-半乳糖苷酶活性檢測，判斷pUL46和pUL16是否存在直接相互作用。結果顯示，在特定的實驗條件下，含有pUL46和pUL16的酵母細胞在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上能夠正常生長，且β-半乳糖苷酶活性檢測呈陽性，表明pUL46和pUL16在酵母細胞中存在直接相互作用。進一步采用免疫共沉淀（Co-IP）技術在哺乳動物細胞中驗證這一結果。將編碼pUL46和pUL16的表達質粒共轉染至293T細胞中，經過一定時間的培養(yǎng)后，收集細胞裂解液。利用針對pUL46的特異性抗體進行免疫沉淀，將與pUL46相互結合的蛋白復合物沉淀下來。隨后，通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測，發(fā)現(xiàn)pUL16也存在于沉淀的蛋白復合物中，這進一步證實了pUL46和pUL16在哺乳動物細胞中能夠直接相互作用。在探究這種相互作用對病毒感染的影響時，構建了一系列病毒突變株。利用基因編輯技術，分別構建了缺失pUL46基因、缺失pUL16基因以及同時缺失pUL46和pUL16基因的偽狂犬病病毒突變株。將這些突變株和野生型病毒分別感染豬腎細胞系PK-15細胞，通過檢測病毒在細胞內的增殖情況來評估相互作用對病毒感染的影響。在病毒增殖實驗中，采用實時熒光定量PCR技術檢測細胞內病毒基因組的拷貝數(shù)。結果顯示，缺失pUL46基因或pUL16基因的突變株，其病毒基因組拷貝數(shù)在感染后的各個時間點均顯著低于野生型病毒，表明pUL46和pUL16的缺失均會影響病毒的增殖能力。而同時缺失pUL46和pUL16基因的突變株，其病毒基因組拷貝數(shù)下降更為明顯，這說明pUL46和pUL16之間的相互作用對于病毒的增殖具有協(xié)同促進作用。當兩者同時缺失時，對病毒增殖的抑制作用更為顯著。通過蝕斑實驗觀察病毒在細胞單層上形成蝕斑的能力，也得到了類似的結果。野生型病毒能夠在細胞單層上形成清晰、大小均勻的蝕斑，而缺失pUL46基因或pUL16基因的突變株形成的蝕斑數(shù)量明顯減少，且蝕斑較小。同時缺失pUL46和pUL16基因的突變株幾乎無法形成蝕斑，進一步證明了pUL46和pUL16之間的相互作用對病毒感染和增殖的重要性。從作用機制角度分析，pUL46和pUL16的相互作用可能影響病毒粒子的組裝和釋放過程。在病毒粒子組裝過程中，pUL46和pUL16可能通過相互作用，協(xié)同參與病毒基因組與結構蛋白的組裝，形成具有感染性的病毒粒子。當兩者的相互作用被破壞時，病毒粒子的組裝出現(xiàn)異常，導致病毒感染性下降。在病毒釋放過程中，pUL46和pUL16的相互作用可能影響病毒從宿主細胞的出芽釋放效率，兩者的缺失會導致病毒釋放受阻，從而影響病毒在宿主細胞間的傳播。五、研究展望5.1現(xiàn)有研究的不足盡管目前對偽狂犬病病毒（PRV）的pUL46和pUL16功能研究已取得一定成果，但仍存在諸多不足。在研究方法上，當前主要依賴傳統(tǒng)的基因敲除、過表達以及蛋白質相互作用等實驗技術?；蚯贸夹g雖然能直觀地揭示基因缺失對病毒功能的影響，但可能會引發(fā)其他基因的代償性變化，從而干擾對pUL46和pUL16真實功能的判斷。例如，在敲除pUL46基因時，病毒可能會通過上調其他相關基因的表達來部分彌補pUL46缺失帶來的功能缺陷，導致實