新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)課程實(shí)驗(yàn)課教案

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案首頁(yè)

課程名稱：獻(xiàn)達(dá)物學(xué)授課教師姓名及職稱：教授

一、授課題目實(shí)險(xiǎn)一佃雷的笥單染色*革里氏累色

二、授課對(duì)象2005級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生

1、學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的操作技術(shù)；

三、實(shí)驗(yàn)教學(xué)目2、掌握細(xì)菌單染色和革蘭氏染色的方法；

標(biāo)與課時(shí)分3、初步掌握無(wú)菌操作技術(shù)；

配4、掌握革蘭氏染色反應(yīng)原理、操作步驟和意義。

3課時(shí)

1、微生物涂片、染色的基本技術(shù)；

四、授課重點(diǎn)

2、無(wú)菌操作技術(shù)

1、微生物涂片、染色的基本技術(shù)；

五、授課難點(diǎn)

2、無(wú)菌操作技術(shù)

六、授課形式實(shí)驗(yàn)課講授

七、授課方法與授課方法：?jiǎn)l(fā)式教學(xué)，討論式教學(xué)；

課前準(zhǔn)備課前準(zhǔn)備：做預(yù)實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編?！段⑸飳W(xué)實(shí)驗(yàn)（第三版）》，高等教育出

文獻(xiàn)版社。

1.你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)

節(jié)是什么？

九、思考題

2.當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操

作正確，結(jié)果可靠？

教研室主任（簽字）課程負(fù)責(zé)人（簽字）

十、教研室主任

及課程負(fù)責(zé)人簽

年月日年月日

字

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案

課程名稱：獻(xiàn)士揚(yáng)等任課教師：

教學(xué)手段和教學(xué)

基本內(nèi)容

組織

細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹?qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)課的要求和

1、學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的操作技術(shù)；

規(guī)則

2、掌握細(xì)菌單染色和革蘭氏染色的方法；

簡(jiǎn)單復(fù)習(xí)理論知識(shí)過(guò)

3、初步掌握無(wú)菌操作技術(shù)；

渡到本實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

4、掌握革蘭氏染色反應(yīng)原理、操作步驟和意義。

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理

結(jié)合理論知識(shí)講解實(shí)

細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。細(xì)菌個(gè)

驗(yàn)原理

體微小，且較透明，必須借助染色法使菌體著色，與背景形成鮮明

的對(duì)比，以便在顯微鏡下進(jìn)行觀察。此法操作簡(jiǎn)便，適用于菌體一

般形狀和細(xì)菌排列的觀察。

用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三

大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)

菌蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)

常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料(如美藍(lán)、結(jié)晶紫、感性復(fù)紅

或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷

的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶

正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。

中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料，如伊紅美藍(lán)、伊紅天青

等。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，可分為?jiǎn)單染色法、鑒別染色法和特殊染

色法等，本實(shí)驗(yàn)主要做前面兩種。

(-)簡(jiǎn)單染色法原理：

這是最基本的染色法,由于細(xì)菌在中性環(huán)境下一般帶負(fù)電荷，

所以通常采用一種堿性染料如美藍(lán)、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫進(jìn)行染色。

簡(jiǎn)單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)，簡(jiǎn)單染色不

能辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。

(二)革蘭氏染色法原理

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革

蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法，因?yàn)橥ㄟ^(guò)此法染色，

可將細(xì)菌鑒別為革蘭氏陽(yáng)性菌(GD和革蘭氏陰性菌(G1兩大類。

革蘭氏染色過(guò)程所用四種不同溶液和作用：

1、堿性染料：這在簡(jiǎn)單染色中已討論過(guò)，此處用結(jié)晶紫。

2、媒染劑：其作用是增強(qiáng)染料與細(xì)菌的親和力，更好地加強(qiáng)

染料與細(xì)胞的結(jié)合。常用的媒染劑是碘液。

3、脫色劑：幫助染料從被染色的細(xì)胞中脫色。利用細(xì)菌對(duì)染

料脫色的難易程度不同，而將細(xì)菌加以區(qū)分。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌不易

被脫色劑脫色，而革蘭氏陰性細(xì)菌則易被脫色。常用的脫色劑是丙

酮或乙醇，這里所用的是95%的乙醇。

4、復(fù)染液：也是一種堿性染料，目的是使脫色的細(xì)菌重新染

上另一種顏色，以便與未脫色菌進(jìn)行比較。這里用的是蕃紅花紅溶

液。

近年來(lái)由于對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有了較深入的了解，對(duì)革蘭氏

染色的機(jī)制提出不同的看法。一般認(rèn)為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的肽聚糖層

較厚，經(jīng)乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結(jié)晶紫與碘

的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色；而革蘭氏陰性細(xì)菌的肽聚糖層

很薄，脂肪含量高，經(jīng)乙醉處理后部份細(xì)胞壁可能被溶解并改變其

組織狀態(tài)，細(xì)胞壁孔徑大，不能阻止溶劑透入，因而將結(jié)晶紫與碘

的復(fù)合物洗去而被脫色。雖然如此，革蘭氏染色的差異并不能完全

認(rèn)為是化學(xué)的差別，也有物理結(jié)構(gòu)不同的結(jié)果，因?yàn)榻湍妇?xì)胞壁

的成份完全和細(xì)菌不同，但具有革蘭氏染色陽(yáng)性反應(yīng)。

三、實(shí)驗(yàn)器材

1、活材料：培養(yǎng)12-16h的枯草桿菌(Bacillussubtilis)，培養(yǎng)

24小時(shí)的大腸桿菌(Escherichiacoli)簡(jiǎn)單介紹本次實(shí)驗(yàn)所

2、染色液和試劑：草酸較結(jié)晶紫染液、盧哥氏碘液、95%酒用器材

精、著紅染液、復(fù)紅、乙醛酒精溶液、香柏油、無(wú)菌水

3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、

顯微鏡等。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1、簡(jiǎn)單染色：

（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴

重點(diǎn)介紹制片方法，強(qiáng)

無(wú)菌水，按無(wú)菌操作法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，

調(diào)無(wú)菌操作

并涂成薄膜，涂布面積約1?1.5cn?,左邊涂枯草桿菌，右邊涂大

腸桿菌。注意取菌不要太多，圖片要均勻。

（2）干燥：讓涂片自然晾干。邊講解邊演示，并強(qiáng)調(diào)

（3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過(guò)火焰2-3次固實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

定。在火上固定時(shí)，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載片

在火上烤，否則細(xì)菌形態(tài)毀壞。（染色前必須固定細(xì)菌。其目的有

二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對(duì)染料的親

和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時(shí)盡量維持細(xì)胞原

有的形態(tài)。）

（4）染色：將固定過(guò)的涂片放在廢液缸上的擱架上，加草酸

錢結(jié)晶紫染液

（5）水洗：傾去染色液，斜置載片，用自來(lái)水的細(xì)水流由載

片上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載片上流下的水中無(wú)

染色液的顏色為止。

（6）干燥：將洗過(guò)的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。

（7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅?/p>

將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)

調(diào)焦觀察細(xì)菌的形態(tài)。

2、革蘭氏染色：

（1）涂片：涂片方法與簡(jiǎn)單染色涂片相同。通過(guò)提出問(wèn)題加強(qiáng)學(xué)

（晾干：與簡(jiǎn)單染色法相同。

2）生對(duì)實(shí)驗(yàn)原理的理解

（3）固定：與簡(jiǎn)單染色法相同。

（4）結(jié)晶紫染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以

蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1分鐘。

（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。

（6）媒染：滴加盧哥天碘液，媒染lmin°

（7）水洗：用水洗去碘液。

（8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20-25s至流

出液無(wú)色，立即水洗。

（9）復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染2min。

（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。

（11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。

（12）鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍，再用高倍，最后用波鏡觀察，

并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。

（13）實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：

①將浸過(guò)油的鏡頭按下述方法擦拭干凈：a.先用擦鏡紙將油鏡

頭上的油擦去；b.用擦鏡紙沾少許乙酸酒精溶液將鏡頭擦2-3次；

c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)后處理的重

拭。

要性

②看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈。

五、注意事項(xiàng)

1.載玻片要潔凈無(wú)油跡，否則菌液涂不開(kāi)。涂片時(shí)，滴水不要

過(guò)多，挑菌量宜少，涂片要均勻，菌膜宜薄。

2.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過(guò)度，革蘭氏陽(yáng)通過(guò)正反兩方面再次

性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過(guò)短，革蘭氏陰性菌也強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

會(huì)被染成革蘭氏陽(yáng)性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄及乙醇用量

多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。

3.染色過(guò)程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的

殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。

4.選用幼齡的細(xì)菌。G，菌培養(yǎng)12h-16h,〃培養(yǎng)24h。若菌

齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。

六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)

（一）繪圖

繪出B37/〃ss2而如和〃革蘭氏染色視野圖。

（二）問(wèn)題和思考

布置本次實(shí)驗(yàn)報(bào)告和

1.你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最

思考題

關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？

2.當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染

色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案首頁(yè)

課程名稱：獻(xiàn)士物學(xué)授課教師姓名及職稱：教授

一、授課題目宴徐二鈿雷的身也和美旗累邑

二、授課對(duì)象2005級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生

1、繼續(xù)學(xué)習(xí)微生物標(biāo)本的制作方法；

三、實(shí)驗(yàn)教學(xué)目2、掌握芽抱、莢膜染色的基石原理及方法；

標(biāo)與課時(shí)分

3、鞏固無(wú)菌操作技術(shù)。

酉己

3課時(shí)

1、微生物標(biāo)本的制作方法；

四、授課重點(diǎn)

2、芽胞、英膜染色的方法及注意事項(xiàng)

1、微生物標(biāo)本的制作方法：

五、授課難點(diǎn)

2、芽胞、莢膜染色的方法及注意事項(xiàng)

六、授課形式實(shí)驗(yàn)課講授

七、授課方法與授課方法：?jiǎn)l(fā)式教學(xué)，討論式教學(xué)；

課前準(zhǔn)備課前準(zhǔn)備：做預(yù)實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編?！段⑸飳W(xué)實(shí)驗(yàn)（第三版）》，高

文獻(xiàn)等教育出版社。

1.若涂片中觀察到的只是大量游離芽也，很少看到芽泡囊及

營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，你認(rèn)為這是什么原因？

九、思考題

2.組成莢膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，為什

么？

教研室主任（簽字）課程負(fù)責(zé)人（簽字）

十、教研室主任

及課程負(fù)責(zé)人簽

年月日年月日

字

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案

課程名稱：獻(xiàn)士物等授課教師姓名及職稱：教授

教學(xué)手段和

基本內(nèi)容

教學(xué)組織

細(xì)菌的芽抱和莢膜染色法

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

先點(diǎn)評(píng)上次實(shí)

1、繼續(xù)學(xué)習(xí)微生物標(biāo)本的制作方法；

驗(yàn)作業(yè)

2、掌握芽泡、莢膜染色的基本原理及方法；

3、鞏固無(wú)菌操作技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理

芽抱、莢膜染色法都是利用細(xì)菌各部位（分）的構(gòu)造不同，它們對(duì)染料

結(jié)合理論知識(shí)

的親和力也不同。因此，可以采用各種特殊染色方法，使細(xì)菌細(xì)胞的不同構(gòu)

講解實(shí)驗(yàn)原理

造能在顯微鏡下顯示出來(lái)，便于觀察和區(qū)別。

（一）芽抱染色法：

芽胞乂稱內(nèi)生抱子（endospore）,是某些細(xì)菌（革蘭氏染色陽(yáng)性桿菌）

生長(zhǎng)到一定時(shí)間（對(duì)數(shù)期后期），在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓彩、橢圓形或圓柱形

的結(jié)構(gòu)。

芽也有的長(zhǎng)在中央或近中央，圓形或橢圓形，芽m的大小，位置，在分

類鑒定上有一定的意義，它僅僅是芽胞細(xì)菌生活史的一個(gè)環(huán)節(jié)，它還是檢驗(yàn)

培養(yǎng)基滅菌徹底不徹底的依據(jù)。

芽抱壁厚、透性低，著色和脫色均較困難，當(dāng)用弱堿性染料（孔雀綠）

在加熱的情況下進(jìn)行染色時(shí)，使染料不僅進(jìn)入菌體也可進(jìn)入芽胞內(nèi)，進(jìn)入菌

體的染料經(jīng)水洗后被脫色，當(dāng)用對(duì)比度大的復(fù)染色劑（落紅液）染色后，芽

胞仍保留初染劑的顏色，是芽泡和菌體更易區(qū)分。菌體呈紅色而芽抱呈綠色。

（二）莢膜染色法

莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外的一層粘液狀或膠狀物質(zhì)，其成分為多糖、糖

蛋白或多肽。由于莢膜與染料的親和力弱、不易著色；而且可以溶于水，易

在用水沖洗時(shí)被除去。

莢膜雖不是細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)，但它是細(xì)胞外碳源和能源性貯藏物質(zhì)，并

能保護(hù)細(xì)胞免受干燥的影響，同時(shí)能增加某些病原菌的致病能力，使之抵御

宿主吞噬細(xì)胞的吞噬。

由于莢膜與染料的親和力弱、不易著色；而且可以溶于水，易在用水沖

洗時(shí)被除去。通常用負(fù)染色法染色，使細(xì)菌和背景著色，背景與菌體之間形

成一透明區(qū)即莢膜，便于觀察，由于莢膜很薄，容易變形，在制片是一般不

用加熱固定。

三、實(shí)驗(yàn)器材

1、菌種：蠟樣芽抱桿菌約2d營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物；褐球固氮菌簡(jiǎn)單介紹本次

（Azotobacterchmococczs）約2d無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物。實(shí)驗(yàn)所月器材

2、染色液和試劑：5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅溶液、碳素墨水、甲醇、

生理鹽水等

3、器材：試管夾、酒精燈、接種針、載玻片、顯微鏡、香柏油、乙酸酒

精、擦鏡紙等。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1、芽抱染色：

（1）制片；按常規(guī)涂片、干燥、固定；

（2）染色：用試管夾夾住玻片的一端，在涂片上滴加孔雀綠3-4滴，再次介紹制片

維持5min；方法，強(qiáng)調(diào)無(wú)菌

水洗：待玻片冷卻、用細(xì)水流沖洗至流出的水為無(wú)色；

（3）操作

（4）復(fù)染：蕃紅溶液復(fù)染2?3min,水洗;

（5）鏡檢：干后，先低倍鏡觀察，再高倍鏡觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅?/p>

邊講解邊演示,

將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察。

并強(qiáng)調(diào)‘文驗(yàn)注

2、莢膜染色（濕墨水法）：

（1）制備菌和墨水混合液：加一滴墨水于潔凈的載玻片上，然后挑取少意事項(xiàng)

量褐球固氮菌與之充分混合均勻；

（2）加蓋玻片：將一潔凈蓋波片蓋在混合液上，然后在蓋波片上放一張

濾紙，輕輕按壓以吸去多余的混合液；

（3）鏡檢：用低倍鏡和高倍鏡觀察。

再次強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)

五、注意事項(xiàng)

注意事項(xiàng)

1、供芽抱染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽胞仍保留在菌體上為宜。

2、染色加熱過(guò)程要及時(shí)補(bǔ)充染液，切勿讓涂片干涸。

3、莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢膜皺縮變形。

4、涂片不要用力過(guò)猛，不要滴加水，以防破壞其莢膜原形。

六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)布置本次實(shí)驗(yàn)

（一）繪圖

報(bào)告和思考題

I.繪出表示芽胞桿菌的形態(tài)特征，注意芽抱的形狀、著生位置及芽抱囊

的形態(tài)特征。

2.繪圖說(shuō)明你所觀察到的細(xì)菌的菌體和莢膜的形態(tài)。

（二）問(wèn)題和思考

1.若涂片中觀察到的只是大量游離芽花，很少看到芽覺(jué)囊及營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，

你認(rèn)為這是什么原因？

2.組成莢膜的成分是什么？涂片一般用什么同定方法，為什么？

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案首頁(yè)

課程名稱：獻(xiàn)金物名授課教師姓名及職稱：郭偉表講師

一、授課題目宴歌三數(shù)鐵雷的形態(tài)觀察

二、授課對(duì)象2005級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生

1、學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌形態(tài)的基本方法；

三、實(shí)臉教學(xué)目

標(biāo)與課時(shí)分2、初步了解放線菌帶形態(tài)特征。

配3課時(shí)

四、授課重點(diǎn)1、放線菌的制片方法及其注意事項(xiàng)

五、授課難點(diǎn)1、放線菌的制片方法及其注意事項(xiàng)

六、授課形式實(shí)驗(yàn)課講授

七、授課方法與授課方法：?jiǎn)l(fā)式教學(xué)，討論式教學(xué)；

課前準(zhǔn)備課前準(zhǔn)備：做預(yù)實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編?！段⑸飳W(xué)實(shí)驗(yàn)（第三版）》，高

文獻(xiàn)等教育出版社。

L試比較二種培養(yǎng)和觀察放線菌方法的優(yōu)缺點(diǎn).

九、思考題

2.鏡檢時(shí)，你如何區(qū)分放線茵的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲？

教研室主任（簽字）課程負(fù)責(zé)人（簽字）

十、教研室主任

及課程負(fù)責(zé)人簽

年月日年月日

字

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案

課程名稱：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)授課教師姓名及職稱：郭偉云講師

基本內(nèi)容教學(xué)手段和

教學(xué)組織

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

先點(diǎn)評(píng)上次實(shí)

1、學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌形態(tài)的基本方法；

2、初步了解放線菌帶形態(tài)特征。驗(yàn)作業(yè)

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理

放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體帶一類革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。結(jié)合理論知識(shí)

常見(jiàn)放線菌大多能形成菌絲體，緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)帶叫基和圖片講解實(shí)

內(nèi)菌絲（簡(jiǎn)稱“基絲”），基絲生長(zhǎng)到一定階段還能向空華中生長(zhǎng)出氣生菌絲（簡(jiǎn)驗(yàn)原理

稱“氣絲”），并進(jìn)一步分化產(chǎn)生抱子絲及抱子。

放線菌的抱子絲形狀和電子排列情況是放線菌分類的重要依據(jù)，為了不打亂

抱子的排列情況，常用印片染色法和膠帶紙粘菌染色法進(jìn)行制片觀察。

為了觀察放線菌的形態(tài)特征，人們?cè)O(shè)計(jì)了各種培養(yǎng)和觀察方法，這些方法的

主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長(zhǎng)條件下的形態(tài)特征，本實(shí)驗(yàn)介紹其中

幾種常用的方法。

（1）桿片法

將放線菌接種在瓊脂立板上，桿上滅菌蓋玻片后培養(yǎng)，使放線菌絲沿著培養(yǎng)

基表面與蓋玻片的交接處生長(zhǎng)而附著在蓋玻上，觀察時(shí)，輕輕取出蓋玻片，置于

載玻片上直接鏡檢。這種方法可以觀察到放線菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的特征，而且便

于不同生長(zhǎng)期的形態(tài)。

（2）玻璃紙法

玻璃紙是一種透明的當(dāng)透膜，將滅菌的玻璃紙覆蓋在瓊脂平板表面，然后將

放線菌接種于玻璃紙上，經(jīng)培養(yǎng)，放線菌在玻璃紙上生長(zhǎng)形成菌苔。觀察時(shí)，揭

下玻璃紙，固定在載玻片上直接鏡檢。這種方法既能保持放線菌的自然生長(zhǎng)，也

便于觀察不同生長(zhǎng)期的形態(tài)特征。

（3）印片法

將要觀察帶放線菌帶菌落或菌苔，先印在載玻片上，經(jīng)染色后觀察。這種方

法主要用于觀察抱子絲帶形態(tài)、抱子帶排列及其形狀等。該方法簡(jiǎn)便、但形態(tài)特

征可能有所改變。

我們本次實(shí)驗(yàn)主要采用印片法來(lái)觀察放線菌的基本形態(tài)。

三、實(shí)驗(yàn)器材簡(jiǎn)單介紹本次

1.菌種：細(xì)黃鏈霉菌4M乂稱5406或青色鏈霉菌（S.

實(shí)驗(yàn)所用器材

glaucus'）,弗氏鏈霉菌（S.fradiae'）；

2.染色液：石炭酸復(fù)紅染色液；

3.器材：載玻片，玻璃紙，小刀，接種環(huán)，吸水紙，擦鏡紙，酒精燈，香柏

油，乙醛-乙醇混合液，顯微鏡。

四、實(shí)驗(yàn)方法

（1）印片：用解剖刀取放線菌培養(yǎng)體一塊，將菌面朝上放在一載玻片上，

另取一潔凈載玻片置于火后上微熱后，蓋在菌苔上，輕輕按壓，使培養(yǎng)物（氣絲、

邊講解邊演示

電子絲或抱子）粘附（“印”）在后一塊載玻片的中央，有印跡的一面朝上，通過(guò)

印片方法，并強(qiáng)

火焰2-3次固定；

調(diào)實(shí)驗(yàn)注意事

（2）染色：用碳酸復(fù)紅覆蓋印跡，染色約Imin后水洗；

項(xiàng)

（3）鏡檢：干后先用低倍鏡后用高倍鏡，最后用油鏡觀察抱子絲、抱子的

形態(tài)及抱子排列情況。

五、注意事項(xiàng)

1、鏟菌苔時(shí)注意不要將瓊脂鏟得太厚.以免影響壓片：再次強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)

、玻片不要太熱，以免瓊脂融化，干擾放線菌的附著；

2注意事項(xiàng)

3、制片過(guò)程中切不可涂片，以免破壞菌絲形態(tài)；

4、印片完畢后注意將印有放線菌的一面朝上進(jìn)行固定，印片不要用力過(guò)大

壓壞瓊脂培養(yǎng)基，也不要挪動(dòng)，以免改變放線菌的自然形態(tài)；

5、觀察時(shí)宜采用略暗的光線。

六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)

（一）繪圖布置本次實(shí)驗(yàn)

繪出說(shuō)明你所觀察到的放線菌的主要形態(tài)特征。報(bào)告和思考題

（二）問(wèn)題和思考

1.試比較三種培養(yǎng)和觀察放線菌方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

2.鏡檢時(shí)，你如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲？

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案首頁(yè)

課程名稱：獻(xiàn)士物學(xué)授課教師姓名及職稱：郭偉衣講師

一、授課題目宴歌四酵號(hào)雷的形態(tài)觀察及無(wú)活福蹌的泰助

二、授課對(duì)象2005級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生

1、觀察酵母菌的細(xì)胞形態(tài)及巴芽生殖方式；

三、實(shí)驗(yàn)教學(xué)目2、學(xué)習(xí)掌握區(qū)分酵母菌死、活細(xì)胞的染色方法；

標(biāo)與課時(shí)分

3、掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細(xì)菌的區(qū)別。

酉己

3課時(shí)

1、酵母菌的形態(tài)特征

四、授課重點(diǎn)

2、酵母菌死活細(xì)胞鑒別的原理

1、酵母菌的形態(tài)特征

五、授課難點(diǎn)

2、酵母菌死活細(xì)胞鑒別的原理

六、授課形式實(shí)驗(yàn)課講授

七、授課方法與授課方法：?jiǎn)l(fā)式教學(xué)，討論式教學(xué)；

課前準(zhǔn)備課前準(zhǔn)備：做預(yù)實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編。《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（第三版）》，高

文獻(xiàn)等教育出版社。

1、呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時(shí)間的不同，對(duì)醉母菌死細(xì)

九、思考題胞數(shù)量有何影響？試分析其原因。

2、在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別于一般細(xì)菌？

教研室主任（簽字）課程負(fù)責(zé)人（簽字）

十、教研室主任

及課程負(fù)責(zé)人簽

年月日年月日

字

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案

課程名稱：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)授課教師姓名及職稱：郭偉云講師

基本內(nèi)容教學(xué)手段和

教學(xué)組織

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

先點(diǎn)評(píng)上次實(shí)

1、觀察酵母菌的細(xì)胞形態(tài)及出芽生殖方式；

2、學(xué)習(xí)掌握區(qū)分酵母菌死、活細(xì)胞的染色方法；驗(yàn)作業(yè)

3、掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細(xì)菌的區(qū)別。

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理

酵母菌是多形的、不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞微生物，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)已有明顯的分化，結(jié)合理論知識(shí)

菌體比細(xì)菌大。繁殖方式乜較復(fù)雜，無(wú)性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是和圖片講解實(shí)

以分裂方式繁殖：有性繁燃是通過(guò)接合產(chǎn)生于囊胞子。驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用美藍(lán)染色浸片來(lái)觀察生活的酵母形態(tài)和出芽生殖方式。

美藍(lán)是一種無(wú)毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無(wú)色的，用它來(lái)

對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色。

由于細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)

色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型，所以酵母的活細(xì)胞無(wú)色，而對(duì)于死細(xì)胞或代謝緩

慢的老細(xì)胞，則因它們無(wú)此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)

色。因此，用美藍(lán)水浸片大僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細(xì)胞。

三、實(shí)驗(yàn)器材

1、菌種：釀酒酵母（SaccharomycescereWshe）培養(yǎng)約2d的麥芽汁斜面培

簡(jiǎn)單介紹本次

養(yǎng)物；

實(shí)驗(yàn)所用器材

2、染色液和試劑：0.05%和0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液：

3、器材：廢液缸、載玻片、蓋玻片、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。

四、實(shí)驗(yàn)方法

（1）在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色液，用接種環(huán)挑取少量醉邊講解邊演示

母菌苔放入上述液滴里，混合均勻；實(shí)驗(yàn)方法，并強(qiáng)

（2）用鎰子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下調(diào)實(shí)驗(yàn)注意事

使其蓋在菌液上：

項(xiàng)

（3）將制片放置約3min,先低倍鏡后高倍鏡觀察醉母形態(tài)和出芽情況，并

根據(jù)顏色區(qū)別死活細(xì)胞。

（4）染色30min后再次觀察，注意死活細(xì)胞數(shù)量的變化：

（5）用0.05%的呂氏堿性美藍(lán)染色液重復(fù)上述操作。

五、注意事項(xiàng)

再次強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)

1、加染液不宜過(guò)多或過(guò)少，否則，在蓋上蓋玻片時(shí)，菌液會(huì)溢出或出現(xiàn)大

量氣泡而影響觀察；注意事項(xiàng)

2、蓋玻片不宜平著放下，以免產(chǎn)生氣泡影響觀察。

六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)

（一）繪圖布置本次實(shí)驗(yàn)

繪圖說(shuō)明你所觀察到的酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及出芽生殖方式。

報(bào)告和思考題

（二澗題和思考

1、呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時(shí)間的不同，對(duì)醉母菌死細(xì)胞數(shù)量有何影

響？試分析其原因。

2、在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別于一般細(xì)菌？

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案首頁(yè)

課程名稱：獻(xiàn)金物學(xué)授課教師姓名及職稱：知偏語(yǔ)副秋裁

一、授課題目案徐，，拷泉泉的制備與天雷

二、授課對(duì)象2005級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生

1、明確培養(yǎng)基的配制原則；

三、實(shí)險(xiǎn)教學(xué)目2、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；

3、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍；

標(biāo)與課時(shí)分

4、掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)，了解幾種常用滅菌方法。

配

6課時(shí)

1、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；

四、授課重點(diǎn)

2、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍；

五、授課難點(diǎn)掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟

六、授課形式實(shí)驗(yàn)課講授

七、授課方法與授課方法：?jiǎn)l(fā)式教學(xué)，討論式教學(xué)；

課前準(zhǔn)備課前準(zhǔn)備：做預(yù)實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編?！段⑸飳W(xué)實(shí)驗(yàn)（第三版）》，高

文獻(xiàn)等教育出版社。

九、思考題為什么微生物培養(yǎng)需要不同的培養(yǎng)基？

教研室主任（簽字）課程負(fù)責(zé)人（簽字）

十、教研室主任

及課程負(fù)費(fèi)人簽

年月日年月日

字

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案

課程名稱：獻(xiàn)金物名宴般授課教師姓名及職稱：對(duì)徜濤副赦裁

基洋的客教學(xué)手段和

教學(xué)組織

一、實(shí)球目的

先點(diǎn)評(píng)上次實(shí)

1、明確培養(yǎng)基的配制原則；驗(yàn)作業(yè)

2、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；

3、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍；

4、掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)，了解幾種常用滅菌方法。

二、賣險(xiǎn)原理

結(jié)合理論知識(shí)

培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工講解實(shí)驗(yàn)原理

方法配制而成的一種基質(zhì)。它包括碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽和水六

類營(yíng)養(yǎng)要素。由于不同微生物細(xì)胞組成不同，因而所需營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)不同，為了分離、

培養(yǎng)和鑒定不同的微生物，必須根據(jù)其需要，配制合適的培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基的種類繁多，根據(jù)培養(yǎng)基的成分、物理性狀不同，可分為天然培養(yǎng)基、

合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。

滅菌是指應(yīng)用物理或化學(xué)的方法，殺滅物體表面和內(nèi)部一切微生物營(yíng)養(yǎng)體、

芽泡和狗子。滅菌方法很多，可分為加熱、過(guò)濾、照射和化學(xué)藥品法等。

常用加熱滅菌法：

1、干熱滅菌：

這種滅菌法是利用熱空氣使物體升溫，而導(dǎo)致物體上所帶的微生物由于干

熱脫水而死亡。常用于空玻璃器皿、金屬用具等的滅菌，對(duì)于帶膠皮的物品、液

體及固體培養(yǎng)基等不能使月此法滅菌。

2、高壓蒸汽滅菌法

此種滅菌方法的原理是在一密閉容器中，煮沸時(shí)形成的蒸汽不能擴(kuò)散到容器

外面去，而堆積在密閉的容器內(nèi)，使蒸汽壓力升高；隨著水的煮沸，溫度也就相

應(yīng)增高。利用過(guò)熱的蒸汽及使細(xì)菌及其耐熱芽泡蛋白質(zhì)凝固變性，以致失去生命

力，從而達(dá)到徹底滅菌的效果。

高壓蒸汽滅菌是最有效的滅菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2）,

12L30C保持15—30分鐘進(jìn)行滅菌,就可殺死一切微牛物細(xì)胞及其芽狗或抱子。

進(jìn)行高壓蒸汽滅菌的儀器叫高壓蒸汽滅菌鍋。滅菌對(duì)象是培養(yǎng)基、玻璃器皿和各

種不因高溫處理而變質(zhì)的物品材料。但對(duì)一些不耐高溫、高壓的溶液或培養(yǎng)基不

宜用此種方法。

簡(jiǎn)單介紹本次

三.畀材和用晶

實(shí)驗(yàn)所用器材

1.1000ml刻度分裝搪瓷缸、200ml燒杯、角匙、天平、稱量紙或小燒杯、

pH試紙、500ml三角瓶，I8mmx180mm試管、紗布、棉花、10ml移液管等。

2.牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10%NaOH溶液、10%鹽酸溶液。邊講解邊演示,

0、方依和步藤并強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)注

1.培養(yǎng)基配方：牛肉膏5.0g,蛋白陳10.0g,NaCI5.0g,瓊脂20.0g,蒸儲(chǔ)水意事項(xiàng)

KX）0ml,pH7.0o

2.操作步驟

（1）用稱量紙分別稱取牛肉膏5.0g、蛋白陳10.0g,把牛肉膏連同稱量紙與

蛋白陳一起放入200ml的燒杯中，然后加入100ml水，置電爐上加熱攪拌至其完

全溶解。用玻璃棒把稱量紙?zhí)舫鰶_凈（用洗瓶洗，沖洗液流入燒杯）。

（2）將溶解的混合液倒入1000ml搪瓷缸中，稱取5.0gNaCl加入，洗滌燒

杯2?3次，洗液倒入缸中，補(bǔ)足自來(lái)水到1000ml（液體培養(yǎng)基制成，即可分裝）,

攪拌加熱煮沸。

（3）稱取20g瓊脂，放入煮沸的溶解液中，繼續(xù)加熱至瓊脂完全溶解，加

熱過(guò)程中要不斷攪拌以防瓊脂沉淀糊底或溢出杯外。

（4）待瓊脂完全融化后，再補(bǔ)足自來(lái)水，趁熱用玻璃棒蘸少許液體點(diǎn)在pH

試紙上測(cè)定酸堿度并用NaOH或HCI溶液調(diào)整pH值至7.2?7.4。

（5）趁熱分裝入15mmX150mm試管中，每管5m1（斜面用）。18mmX180mm

試管，每管分裝15ml（平板用）。

（6）將余下的分裝在500ml三角瓶中（每瓶約300ml）。

（7）將上述分裝在各種容器中的培養(yǎng)基，塞好棉塞，捆孔好。

（8）O.IMPa高壓蒸汽滅菌30分鐘。

強(qiáng)調(diào)注意事

（9）擺斜面滅菌后，需做斜面的試管，應(yīng)待培養(yǎng)基冷卻至50?60C（溫度

不能過(guò)高，以防斜面上冷凝水太多）后，擺成斜面。斜面的斜度要適當(dāng)，斜面的項(xiàng)

長(zhǎng)度不超過(guò)試管長(zhǎng)度的二分之一。擺放時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污棉塞，冷凝過(guò)程

中不要移動(dòng)試管，待斜面完全凝固后，再收起使用或貯藏。

上，整盤串項(xiàng)

1、稱取藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙稱一種藥品；

2、蛋白陳極易吸濕，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速；

3、配制固體培養(yǎng)基時(shí)，先將其他藥品加熱溶解到快沸時(shí)，再將稱好的瓊脂

加入，繼續(xù)加熱至瓊脂完全熔化，此過(guò)程要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火

力，防止沸騰外溢；

4、分裝量根據(jù)試管大小和實(shí)際需要而定，固體培養(yǎng)基裝量約為管高的1/5,

液體培養(yǎng)基的裝量約為管高的1/4,三角瓶的裝量不超過(guò)瓶體的1/2；

5、分裝過(guò)程中注意不要將培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起

污染。

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案首頁(yè)

課程名稱：獻(xiàn)士物學(xué)授課教師姓名及職稱：方啟禹講師

一、授課題目

二、授課對(duì)象2005級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生

1、了解微生物分離和純化的原理

三、實(shí)險(xiǎn)教學(xué)目2、掌握倒平板的方法和兒種常用的分離純化接種培養(yǎng)的基本

標(biāo)與課時(shí)分操作技術(shù)，掌握微生物的無(wú)菌操作技術(shù)。

西己

6課時(shí)

四、授課重點(diǎn)微生物分離和純化的基本原理

五、授課難點(diǎn)微生物分離和純化的基本原理

六、授課形式實(shí)驗(yàn)課講授

七、授課方法與授課方法：?jiǎn)l(fā)式教學(xué)，討論式教學(xué)；

課前準(zhǔn)備課前準(zhǔn)備：做預(yù)實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)備示教材料，寫教案

八、教材與參考沈萍、范秀榮、李廣武主編?！段⑸飳W(xué)實(shí)驗(yàn)（第三版）》，高

文獻(xiàn)等教育出版社。

1.在你所實(shí)驗(yàn)的三種培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的菌落屬于哪個(gè)類

群？簡(jiǎn)述它們的菌落形態(tài)特征。

2.稀釋分離時(shí)，為什么要將已融化的瓊脂培養(yǎng)基冷卻到45?

九、思考題50℃左右才能傾入到裝有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)？

3.劃線分離時(shí)，為什么每次都要將接種環(huán)上多余的菌體燒

掉？劃線為何不能重疊？

教研室主任（簽字）課程負(fù)責(zé)人（簽字）

十、教研室主任

及課程負(fù)費(fèi)人簽

年月日年月日

字

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)課教案

課程名稱：微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)授課教師姓名及職稱：高啟禹講師

基漳向客教學(xué)手段和

教學(xué)組織

一、實(shí)球目的

先點(diǎn)評(píng)上次實(shí)

1、了解微生物分離和純化的原理驗(yàn)作業(yè)

2、掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化接種培養(yǎng)的基本操作技術(shù)，掌

握微生物的無(wú)菌操作技術(shù)。

二、宴般煮理結(jié)合理論知識(shí)

在自然界中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起的，為了生產(chǎn)講解實(shí)驗(yàn)原理

和科學(xué)研究的需要，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類

群中分離出它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)物，這種獲得純培養(yǎng)物的方

法稱為微生物的分離與純化。為了獲得純種的微生物，一般根據(jù)該微生物營(yíng)養(yǎng)或

培養(yǎng)特點(diǎn)，或?qū)δ撤N抑制劑的耐受性不同，或?qū)δ撤N環(huán)境條件要求不同，從而制

作或設(shè)置一些選擇性培養(yǎng)基，或選擇性培養(yǎng)條件，再用稀釋涂布平板法或稀釋混

合平板法或劃線法分離，純化該微生物，直至得到該純種菌株。

土壤是微生物生活的大本營(yíng)，在這里生活的微生物數(shù)量和種類都極其豐富，

因此，土壤是我們開(kāi)發(fā)利月微生物資源的重要來(lái)源，可以從其中分離純化到許多

有用的菌株。簡(jiǎn)單介紹本次

三、看初雜用晶實(shí)驗(yàn)所用器材

1.樣品土樣

2.培養(yǎng)基牛肉膏蛋白腺瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、豆芽汁

培養(yǎng)基。

3.其它盛9ml無(wú)菌水的試管、盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶、無(wú)

菌玻璃涂棒、無(wú)菌吸管、接種環(huán)、無(wú)菌培養(yǎng)皿。

邊講解邊演示，

四.方依痛步跋

并強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)注

（一）、稀釋混合平板法

1.細(xì)菌的分離意事項(xiàng)

（1）土壤稀釋液的制備①稱取土樣10g,放入盛90ml無(wú)菌水三角瓶中，

振蕩15?20分鐘，使微生物細(xì)胞分散，靜置約20?30秒，即成1（尸的土壤懸液。

②另取裝有9ml無(wú)菌水的試管,編號(hào)為10410-3、10＜、10\IO-及io”,用

無(wú)菌吸管吸取IO」土壤懸液1mL加入編號(hào)IO2的無(wú)菌試管中，吹吸三次，使之

混合均勻，即成ICTz的土壤稀釋液。再用另一支吸管吸取IO。試管中的土壤稀稀

液1ml,加入編號(hào)104的無(wú)菌試管中，輕輕搖動(dòng)，使之混合均勻，即成IO-的土

壤稀釋液，一定要每次更換一支無(wú)菌吸管（連續(xù)稀釋）。同法依次分別稀釋成10±

10-5和10-6等一系列稀釋度菌懸液（見(jiàn)圖1）。

（2）平板制作將無(wú)菌培養(yǎng)皿編上10-4、10-5、］0心號(hào)碼，每一.號(hào)碼設(shè)三個(gè)重

復(fù)，用1ml無(wú)菌吸管按無(wú)菌操作要求吸10-6稀釋液各11rL分別放入編號(hào)1（）4的

三個(gè)培養(yǎng)皿中。同法吸取IO。稀釋液各iml,分別放入編號(hào)IO。的三個(gè)培養(yǎng)皿中。

再吸取1（尸稀釋液各1ml,分別放入編號(hào)1（尸的三個(gè)培養(yǎng)皿中。然后在9個(gè)培養(yǎng)

皿中分別倒入15ml已融化并且冷卻至45℃左右的牛肉育蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基，加

蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板，

整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照元菌操作（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)1）。

圖1從土城中分離微生物操作過(guò)程

（3）培養(yǎng)與移植待平板完全冷凝后，將平板倒置37c恒溫箱中培養(yǎng)24?

48小時(shí)，檢查分離結(jié)果。將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取接種到牛肉育蛋白陳

培養(yǎng)基的斜面上，然后置于37c恒溫箱中培養(yǎng)，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查菌苔是否單

純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其它雜曲混雜，就可

再一次進(jìn)行分離、純化，直至獲得純培養(yǎng)。

2.放線菌的分離由于放線菌在培養(yǎng)基上蔓延生長(zhǎng)不如真菌快，其繁殖速

度又比細(xì)菌慢，故分離這類微生物時(shí)要特別注意防止細(xì)菌和霉菌的蔓延，以免妨

礙放線菌的生長(zhǎng)。為了保證放線菌的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，可對(duì)樣品做如下處理：（I）為了

除去部分細(xì)菌，可先將土壤進(jìn)行風(fēng)干。因?yàn)榧?xì)菌營(yíng)養(yǎng)體遇干燥環(huán)境容易死亡，而

放線菌比細(xì)菌的抗干燥能力強(qiáng)。風(fēng)干的土壤與少量CaCO?混合，于28c培養(yǎng)數(shù)

天，更能進(jìn)一步減少細(xì)菌和增加放線菌的數(shù)量。（2）選用的土壤稀釋度要根據(jù)放

線菌的多少來(lái)決定，可用1（尸、10-4或其它稀釋度。在所選用的稀釋液中加入l（）0g/L

酚10滴，充分混勻，可進(jìn)一步減少細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)。

一般放線菌生長(zhǎng)的適宜溫度為25?28C,培養(yǎng)5?7天，培養(yǎng)基為高氏一號(hào)

培養(yǎng)基。具體操作過(guò)程見(jiàn)“細(xì)菌的分離工

3.霉菌的分離大多數(shù)霉菌為好氧微生物，必須有充足的氧氣才能很好地

生長(zhǎng)。霉菌能耐受較酸性環(huán)境，所以一般分離霉菌時(shí)取偏酸性、含有機(jī)質(zhì)較豐富

的接近表層的土壤，特別是森林土壤中含有較多霉菌。如果用特定的材料為培養(yǎng)

基分離霉菌，經(jīng)培養(yǎng)后，長(zhǎng)出的菌種可能較為單一。比如用新鮮的桔皮保溫培養(yǎng),

容易長(zhǎng)出青霉。

分離方法具體操作過(guò)程見(jiàn)“細(xì)菌分離”，只是將稀釋度向前移2位數(shù)。采

用馬丁氏（Martin）瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加1/3000的孟加拉紅水溶液,使用

時(shí)每10ml培養(yǎng)基再加0.03%鏈霉素溶液1ml（含鏈霉素30ug/mD,用28?30℃

下培養(yǎng)

3?5天，待菌落長(zhǎng)出后，卷查結(jié)果。

（二）稀釋涂布平板法

此法與稀釋混合平板法基本相同，無(wú)菌操

作也一樣，所不同的是先將牛肉育蛋白陳培養(yǎng)

基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基，馬丁氏培養(yǎng)基融化，在

火焰旁注入培養(yǎng)皿，搖勻后制成平板，然后用

三支1ml無(wú)菌吸管分別由10”、10\10《三管

土壤稀釋液中各吸取0.2W對(duì)號(hào)放入已寫好稀

釋度的平板中，用無(wú)菌玻謫涂棒在培養(yǎng)基表面

輕輕地涂布均勻，然后分別倒置于28℃和37℃

溫箱中培養(yǎng)后，再挑取單個(gè)菌落，直至獲得純

培養(yǎng)。

（三）平板劃線分離法圖2平板劃線操作圖

1.將各種固體培養(yǎng)基融化后制成平板，并

用記號(hào)筆標(biāo)明培齊基名稱。

2.劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10”的土壤

稀釋液一環(huán)在平板上劃線（如圖2）,劃線方法很多，但無(wú)論哪種方法劃線，其目

的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使形成單個(gè)菌落。常用劃線方法有下

列三種：

（1）交又劃線法用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)

基的一邊作第一次平行劃線3?4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70。角，并將接種環(huán)上的

殘菌燒抻，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過(guò)第二

次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃

線（如圖3）,劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫箱培養(yǎng)。

（2）連續(xù)劃線法用接種環(huán)挑取樣品在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線（如圖

14-3b）,劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫箱培養(yǎng)。