SZDBZ 132-2015 小反芻獸疫抗體檢測 競爭酶聯(lián)免疫吸附法

1發(fā)布2015-02-27發(fā)布發(fā)布 II 2 2 3 4 5 6 本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。1小反芻獸疫抗體檢測競爭酶聯(lián)免疫吸附法本標準適用于小反芻獸疫抗體檢測、監(jiān)測和流行病GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和SN/T2123出入境動物檢疫實驗樣品采集、而通過底物的顯色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)。本標準競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗則是在色反應(yīng)酶標儀讀數(shù)的方式判定待檢血清中是否有小反芻獸疫病毒抗體。2AcNPV：苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒。f)辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（HRP標記的羊抗鼠IgG按說明書指定的工作g)包被液、洗滌液、稀釋液、底物液/顯色劑、終止液：配制方法37.2.2取種毒病毒液，用Grace's培養(yǎng)基由10-1開始作10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、20%胎牛血清的2xGrace's培養(yǎng)基，置CO2恒溫培養(yǎng)箱27℃培養(yǎng)7d～10d，觀察并進行蝕斑計7.2.4按照病毒滴度=蝕斑數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/每孔體積數(shù)mL進行計算；病毒含量應(yīng)≥1.0蟲細胞，在2%胎牛血清的Grace's培養(yǎng)基中27℃培養(yǎng)72～96h，待出現(xiàn)80%細胞病變，收獲病7.3.2取生產(chǎn)用種毒按1∶10接種于長成單層的sf4沉淀蛋白，加入硫柳汞至終濃度為0.01%，按0.5μg/mL加入leupeptin（PPRV重組N蛋白抗原應(yīng)為白色固體，無臭、無按公式1.45×OD280-0.74×OD260計算抗原濃度，蛋白質(zhì)濃度應(yīng)不低于4每瓶PPRV重組N蛋白抗原用去離子水復(fù)溶為0.5mL液體后，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液1∶37℃作用1h。洗板3次，加入底物溶液避光顯色10～15min，用1mol/LH2SO4終止反應(yīng)，用酶與5份小反芻獸疫病毒陽性血清進行酶聯(lián)免疫吸附試驗時，應(yīng)呈陽性反應(yīng)；與小反芻獸5培養(yǎng)基重懸浮細胞，調(diào)整濃度至約1×106個細胞/mL。腹腔注射用降脂烷處理化后，用PBS稀釋成1.7mg/mL，加入硫柳汞8.5.1性狀用紫外分光光度計測定在OD280和OD260波長下的光吸收值，按公式1.45×OD280-0.74×OD260計算抗原濃度，單克隆抗體的蛋白濃度應(yīng)≥1用昆蟲桿狀病毒表達的N蛋白按0.8μg～后，進行間接ELISA試驗，測得OD450值與陰性對照OD450值的比值大于2.1時的單-80℃保存，有效期為12個月。9待測樣品的采集和處理6樣品保存等操作可按《出入境動物檢疫實驗樣品采集、運輸和保存規(guī)范》（SN/T2123每份待檢血清加2孔，每孔50μL；每板均設(shè)標準陰性血清、弱陽性血釋液對照各2孔，每孔50μL。加樣完畢，均用振蕩器充分振蕩混勻，記錄加樣每孔加50μL底物液，室溫(20～25℃)避光反應(yīng)17當PPRV強陽性對照PI值＞80%；50%≤PPRV弱陽性對照PI值≤80%；PPRV陰性對照PI值<30%時，試驗成立。則待檢樣品可按下表判定，可疑樣品需重復(fù)實驗，結(jié)8A.1磷酸鹽緩沖溶液（0.01mol/LpH7.4PBS）A.1.1成分氯化鉀（KCl）0.2g氯化鈉（NaCl）8.00gA.1.2制法稱取各組分溶于800mL蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾A.2包被液（0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液）A.2.1成分NaHCO3Na2CO3（Na2CO32O）A.2.2制法A.3洗滌液A.3.1成分NaClNa2HPO49A.3.2制法將各組分充分溶解，加入0.01%硫柳汞，調(diào)節(jié)pH值至7.2，用0.22μm（0.45μm）濾膜過A.4稀釋液：1%明膠或5%雞血清PB