4-1BBL轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞疫苗：機(jī)制、制備與療效探究

4-1BBL轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞疫苗：機(jī)制、制備與療效探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國每年的新發(fā)胃癌病例數(shù)占全球新發(fā)病例數(shù)的近一半，且近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病年齡也趨于年輕化。早期胃癌患者通過手術(shù)治療后的5年生存率超過90％，然而，大多數(shù)中國胃癌患者在確診時已處于中晚期，治療難度和死亡率顯著增加，進(jìn)展期胃癌的5年生存率徘徊在30%左右。導(dǎo)致胃癌難以治愈的原因眾多，其中腫瘤的免疫逃逸是關(guān)鍵因素之一。腫瘤免疫逃逸是指腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，從而得以在體內(nèi)生長、增殖和轉(zhuǎn)移。在抗腫瘤免疫過程中，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫發(fā)揮著核心作用。T細(xì)胞的活化需要雙信號刺激，第一信號由T細(xì)胞受體（TCR）與抗原提呈細(xì)胞（APC）表面的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）復(fù)合物結(jié)合提供，第二信號則由APC上的共刺激分子與T細(xì)胞上的相應(yīng)配體相互作用產(chǎn)生。缺乏第二信號，T細(xì)胞會進(jìn)入特異性無應(yīng)答狀態(tài)，無法有效發(fā)揮抗腫瘤作用。大量研究表明，腫瘤細(xì)胞常常通過缺乏共刺激分子等方式來逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。樹突狀細(xì)胞（Dendriticcell，DC）作為體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，能夠高效攝取、加工和提呈抗原，激活初始T細(xì)胞，誘導(dǎo)并維持初始免疫反應(yīng)，在抗腫瘤免疫中占據(jù)著重要地位。DC可以識別和吞噬病原體，將大分子抗原加工成肽段，并呈遞給T細(xì)胞，刺激未致敏T細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。基于DC的這些特性，用樹突狀細(xì)胞疫苗治療腫瘤成為當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。在眾多類型的樹突狀細(xì)胞疫苗中，利用全腫瘤信息負(fù)載DC，能夠引發(fā)多個抗原表位的免疫反應(yīng)，有效防止因抗原變異而導(dǎo)致的免疫逃避，受到了眾多研究者的關(guān)注。4-1BB/4-1BBL是除CD28/B7之外的另一對重要的協(xié)同刺激信號。4-1BBL屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員，主要表達(dá)于活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞上。4-1BBL主要在初次免疫應(yīng)答的后期發(fā)揮作用，可協(xié)同CD28或單獨(dú)活化靜止T細(xì)胞，維持T細(xì)胞的生存及免疫記憶應(yīng)答。將4-1BBL基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，有望增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，打破腫瘤免疫逃逸的困境。本研究聚焦于將4-1BBL基因?qū)胛赴┘?xì)胞，提取此轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞的總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，制備腫瘤疫苗，并深入觀察該疫苗的體外抗腫瘤效應(yīng)。本研究旨在為胃癌的臨床免疫治療提供新的理論依據(jù)和治療策略，有望為廣大胃癌患者帶來新的希望，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，4-1BBL轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究近年來備受關(guān)注。國外早在20世紀(jì)90年代就開始對4-1BB/4-1BBL信號通路進(jìn)行基礎(chǔ)研究，深入探究其在T細(xì)胞活化、增殖和免疫記憶形成中的作用機(jī)制。有研究表明，在小鼠模型中，通過激活4-1BB信號通路，能夠顯著增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤活性，抑制腫瘤生長。例如，將表達(dá)4-1BBL的載體導(dǎo)入小鼠黑色素瘤細(xì)胞，與未處理的腫瘤細(xì)胞相比，荷瘤小鼠的生存期明顯延長，腫瘤體積顯著減小。隨著研究的深入，國外在4-1BBL轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療的臨床試驗(yàn)方面也取得了一定進(jìn)展，部分研究已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。國內(nèi)對4-1BBL轉(zhuǎn)基因的研究起步稍晚，但發(fā)展迅速。眾多科研團(tuán)隊(duì)致力于4-1BBL轉(zhuǎn)基因在多種腫瘤中的應(yīng)用探索，包括肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌等。在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)方面不斷創(chuàng)新，提高了4-1BBL基因?qū)肽[瘤細(xì)胞的效率和穩(wěn)定性。通過構(gòu)建不同的4-1BBL轉(zhuǎn)基因載體，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，成功實(shí)現(xiàn)了4-1BBL在多種腫瘤細(xì)胞系中的高效表達(dá)，并在動物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了其增強(qiáng)腫瘤免疫原性的效果。樹突狀細(xì)胞疫苗的研究同樣在國內(nèi)外廣泛開展。國外在DC疫苗的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)方面處于領(lǐng)先地位。從DC的生物學(xué)特性、分化發(fā)育機(jī)制到DC疫苗的制備工藝、臨床應(yīng)用方案等都進(jìn)行了深入研究。多項(xiàng)針對不同腫瘤類型的DC疫苗臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示出一定的療效，如在黑色素瘤、前列腺癌等腫瘤的治療中，部分患者的生存期得到延長，生活質(zhì)量有所提高。國內(nèi)在DC疫苗研究方面也投入了大量資源，取得了一系列成果?？蒲腥藛T優(yōu)化了DC的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化方法，提高了DC的產(chǎn)量和質(zhì)量。同時，探索了多種腫瘤抗原負(fù)載DC的方式，包括腫瘤抗原肽、腫瘤裂解物、腫瘤mRNA等。一些研究團(tuán)隊(duì)將DC疫苗與其他治療方法，如化療、放療、免疫治療等聯(lián)合應(yīng)用，在動物模型和臨床研究中取得了較好的協(xié)同治療效果。將4-1BBL轉(zhuǎn)基因與樹突狀細(xì)胞疫苗相結(jié)合用于胃癌治療的研究，目前在國內(nèi)外都還處于探索階段。國外有少數(shù)研究嘗試將4-1BBL修飾的腫瘤細(xì)胞裂解物負(fù)載DC制備疫苗，但在疫苗的穩(wěn)定性、安全性和有效性方面仍存在諸多問題需要解決。國內(nèi)相關(guān)研究相對較少，主要集中在動物實(shí)驗(yàn)階段，通過構(gòu)建4-1BBL轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞，提取其RNA轉(zhuǎn)染DC制備疫苗，并在小鼠荷瘤模型中觀察疫苗的抗腫瘤效果。雖然部分研究顯示出一定的抗腫瘤活性，但距離臨床應(yīng)用還有很長的路要走，需要進(jìn)一步深入研究疫苗的作用機(jī)制、優(yōu)化制備工藝和治療方案。盡管國內(nèi)外在4-1BBL轉(zhuǎn)基因、樹突狀細(xì)胞疫苗及二者結(jié)合用于胃癌治療的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多不足和空白。在4-1BBL轉(zhuǎn)基因方面，其在胃癌細(xì)胞中的長期穩(wěn)定表達(dá)及對腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜影響機(jī)制尚未完全明確；在樹突狀細(xì)胞疫苗研究中，如何提高DC疫苗的免疫原性和靶向性，降低個體差異對疫苗療效的影響，仍是亟待解決的問題；而在二者結(jié)合的研究中，缺乏系統(tǒng)深入的作用機(jī)制研究和大規(guī)模的臨床前及臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，導(dǎo)致該聯(lián)合治療策略的臨床轉(zhuǎn)化面臨諸多挑戰(zhàn)。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在通過一系列實(shí)驗(yàn)操作，深入探究4-1BBL轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞疫苗的特性及抗腫瘤效應(yīng)，為胃癌的免疫治療提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和可行的治療策略。具體研究目的如下：構(gòu)建4-1BBL轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞：運(yùn)用脂質(zhì)體法將pM日Tneo/4.1BBL基因?qū)?15小鼠前胃癌細(xì)胞MFC內(nèi)，借助G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)4-1BBL基因的MFC/4-1BBL細(xì)胞，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中4-1BBL基因mRNA的存在，確保轉(zhuǎn)基因細(xì)胞構(gòu)建成功。制備樹突狀細(xì)胞疫苗：從615小鼠骨髓組織中分離樹突狀細(xì)胞（DC），并進(jìn)行體外培養(yǎng)使其進(jìn)一步成熟。利用脂質(zhì)體包裹MFC/4-1BBL細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細(xì)胞，成功制備DC/4-1BBL/RNA疫苗。觀察疫苗的體外抗腫瘤效應(yīng)：取615同種異體小鼠脾淋巴細(xì)胞，分別與DC、MFC/4-1BBL/DC混合培養(yǎng)，運(yùn)用MTT法測定各組淋巴細(xì)胞增殖率，以此評估疫苗對淋巴細(xì)胞增殖的影響；DC、MFC/4-1BBL/DC與小鼠淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后刺激T細(xì)胞產(chǎn)生特異性CTL細(xì)胞，再利用MTT法測定腫瘤細(xì)胞的殺傷率，明確疫苗誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力；采用ELISA法測定幼稚DC、DC、MFC/4-1BBL/DC培養(yǎng)上清中IL-12的含量及MFC/4-1BBL/DC、DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清中IFN-γ含量，探究疫苗對細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用，全面分析疫苗的體外抗腫瘤效應(yīng)。本研究在技術(shù)和研究角度上具有一定的創(chuàng)新點(diǎn)。在技術(shù)層面，采用脂質(zhì)體法導(dǎo)入基因以及脂質(zhì)體包裹RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，操作相對簡便且高效，能夠有效提高基因轉(zhuǎn)染效率和疫苗制備的成功率。同時，綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如RT-PCR、MTT法、ELISA法等，從基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞殺傷和細(xì)胞因子分泌等多個維度全面評估疫苗的特性和效應(yīng)，為研究提供了全面且準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。在研究角度方面，將4-1BBL轉(zhuǎn)基因技術(shù)與樹突狀細(xì)胞疫苗相結(jié)合用于胃癌治療的研究具有創(chuàng)新性。目前，國內(nèi)外針對這一聯(lián)合治療策略的研究相對較少，本研究深入探討其作用機(jī)制和治療效果，有望為胃癌的免疫治療開辟新的研究方向。通過觀察疫苗對T細(xì)胞活化、增殖以及細(xì)胞因子分泌的影響，從細(xì)胞和分子水平揭示疫苗的抗腫瘤機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化疫苗設(shè)計(jì)和治療方案提供理論基礎(chǔ)。此外，本研究聚焦于體外實(shí)驗(yàn)，能夠更精準(zhǔn)地控制實(shí)驗(yàn)條件，深入研究疫苗的作用機(jī)制，避免了體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的干擾，為后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供了重要的前期基礎(chǔ)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌概述胃癌是消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2022年全球新增癌癥病例數(shù)達(dá)到1,996萬例，其中胃癌新發(fā)病例數(shù)為96.84萬例，占所有新增癌癥病例的4.9%，位居全球癌癥發(fā)病率第五位。在死亡數(shù)據(jù)方面，2022年全球癌癥死亡病例數(shù)為974萬例，胃癌以65.99萬例的死亡數(shù)，占比6.8%，位列全球癌癥死亡原因第五。在中國，胃癌同樣是癌癥防治的重點(diǎn)之一。2022年，中國癌癥新發(fā)病例數(shù)為482.47萬例，其中新發(fā)胃癌病例數(shù)達(dá)到35.87萬例，占全國新增癌癥病例數(shù)的7.4%，位居國內(nèi)新發(fā)癌癥第五位，且男性和女性的發(fā)病率分別為34.20/10萬人和16.23/10萬人，顯示出性別間的顯著差異。更為嚴(yán)峻的是，2022年中國癌癥死亡病例數(shù)為257.42萬例，其中胃癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)26.04萬例，占全國癌癥死亡病例數(shù)的10.1%，排名癌癥死亡原因第三位，男女死亡率分別為25.18/10萬人和11.41/10萬人，凸顯了胃癌防治的緊迫性。值得注意的是，近年來胃癌的發(fā)病趨勢呈現(xiàn)出年輕化的特點(diǎn)。以往胃癌多見于中老年人，但如今越來越多的年輕人被診斷出患有胃癌。這可能與多種因素有關(guān)，如不良的生活習(xí)慣，包括長期熬夜、過度勞累、飲食不規(guī)律、高鹽高脂飲食、吸煙酗酒等。此外，幽門螺桿菌感染、遺傳因素、環(huán)境污染等也在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。幽門螺桿菌是一種革蘭氏陰性菌，它能夠在胃內(nèi)酸性環(huán)境中生存，長期感染幽門螺桿菌可導(dǎo)致胃黏膜的慢性炎癥，進(jìn)而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險。遺傳因素在胃癌發(fā)病中所占比例約為10%，家族中有胃癌患者的人群，其發(fā)病風(fēng)險明顯高于普通人群。胃癌的治療現(xiàn)狀仍面臨諸多挑戰(zhàn)。對于早期胃癌患者，手術(shù)切除是主要的治療方法，5年生存率相對較高，超過90％。然而，由于胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，此時腫瘤往往已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，單純手術(shù)治療效果不佳，需要綜合運(yùn)用化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種手段?；熗ㄟ^使用化學(xué)藥物來殺死癌細(xì)胞，但同時也會對正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等。放療利用高能射線照射腫瘤部位，以殺死癌細(xì)胞，但同樣存在副作用，如放射性胃炎、食管炎等。靶向治療和免疫治療是近年來發(fā)展起來的新型治療方法，它們能夠更精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，提高治療效果，減少不良反應(yīng)。例如，靶向HER2的曲妥珠單抗、維迪西妥單抗，VEGFR2藥物雷莫西尤單抗及阿帕替尼等被批準(zhǔn)用于胃癌治療。免疫檢查點(diǎn)抑制劑，特別是PD-1單抗，在胃癌治療中展現(xiàn)出巨大潛力，PD-1單抗聯(lián)合化療已成為不可切除局部晚期或轉(zhuǎn)移性食管胃結(jié)合部/胃癌患者的一線治療新標(biāo)準(zhǔn)。盡管這些治療方法在一定程度上改善了患者的預(yù)后，但總體來說，進(jìn)展期胃癌的5年生存率仍徘徊在30%左右，遠(yuǎn)不能滿足臨床需求，亟待開發(fā)新的治療策略。腫瘤免疫逃逸是導(dǎo)致胃癌難以治愈的重要原因之一。腫瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識別和攻擊。在免疫抑制細(xì)胞浸潤方面，腫瘤微環(huán)境中存在一些免疫抑制細(xì)胞，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等。這些細(xì)胞能夠分泌抑制性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，抑制免疫細(xì)胞的活性，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫攻擊。腫瘤細(xì)胞表面缺乏共刺激分子，如CD80、CD86等，無法提供足夠的信號給T細(xì)胞，導(dǎo)致T細(xì)胞活化和增殖受到抑制。腫瘤細(xì)胞還可以下調(diào)MHC分子的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞表面抗原的呈遞，從而減少被免疫細(xì)胞識別的機(jī)會。此外，腫瘤細(xì)胞能夠分泌一些免疫抑制分子，如前列腺素E2、轉(zhuǎn)化生長因子-β等，抑制免疫細(xì)胞的功能。腫瘤細(xì)胞通過誘導(dǎo)免疫耐受，使免疫系統(tǒng)對其產(chǎn)生免疫忽視或免疫耐受，從而避免被免疫攻擊。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要過程，新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞缺乏MHC分子的表達(dá)，有助于腫瘤細(xì)胞逃避免疫攻擊。腫瘤細(xì)胞在生長過程中會發(fā)生基因突變和抗原變異，使腫瘤細(xì)胞表面的抗原發(fā)生改變，從而降低被免疫細(xì)胞識別的概率。這些免疫逃逸機(jī)制相互交織，使得腫瘤細(xì)胞能夠在體內(nèi)持續(xù)生長和擴(kuò)散，給胃癌的治療帶來了極大的困難。2.2樹突狀細(xì)胞（DC）與腫瘤免疫樹突狀細(xì)胞（Dendriticcell，DC）是人體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞（Antigen-presentingcell，APC），因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。DC的起源與發(fā)育是一個復(fù)雜且有序的過程。它起源于多能造血干細(xì)胞，在骨髓中經(jīng)歷不同的分化階段，最終發(fā)育為成熟的DC。DC主要分為髓系樹突狀細(xì)胞（Myeloiddendriticcells，mDC）和淋巴樣樹突狀細(xì)胞（Lymphoiddendriticcells，pDC）。mDC主要參與抗原的攝取、加工和提呈，激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答；pDC則主要分泌大量的I型干擾素，在抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用。DC廣泛分布于全身各組織和器官，如皮膚、氣道、淋巴器官等。在這些部位，DC以未成熟的形式存在，具有較強(qiáng)的遷移能力。當(dāng)DC受到病原體或其他抗原刺激時，會逐漸成熟并遷移到淋巴結(jié)等淋巴組織，與T細(xì)胞相互作用，啟動免疫應(yīng)答。DC的主要功能包括抗原攝取、加工和提呈。未成熟的DC具有較強(qiáng)的攝取抗原能力，它可以通過吞噬作用、巨胞飲作用和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等方式攝取外源性抗原。例如，DC可以識別并吞噬腫瘤細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞表面的抗原攝取到細(xì)胞內(nèi)。攝取后的抗原在DC內(nèi)被加工處理成短肽片段，這些短肽片段與DC表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，形成抗原肽-MHC復(fù)合物。隨后，DC遷移到淋巴結(jié)等淋巴組織，將抗原肽-MHC復(fù)合物呈遞給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。DC在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它可以通過多種機(jī)制激活T細(xì)胞，引發(fā)特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。DC能夠激活初始T細(xì)胞，使其分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而記憶T細(xì)胞則可以在再次遇到相同腫瘤抗原時迅速活化，產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。DC還可以分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-12（IL-12）、干擾素-γ（IFN-γ）等，這些細(xì)胞因子可以增強(qiáng)T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生。此外，DC還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移?；贒C在抗腫瘤免疫中的重要作用，DC疫苗成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)之一。DC疫苗的制備過程通常包括從患者體內(nèi)采集DC前體細(xì)胞，在體外進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，使其成熟，然后用腫瘤抗原負(fù)載DC，最后將負(fù)載腫瘤抗原的DC回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。目前，用于負(fù)載DC的腫瘤抗原主要包括腫瘤特異性抗原肽、腫瘤蛋白、完整腫瘤細(xì)胞以及腫瘤組織的RNA和DNA等。每種抗原負(fù)載方式都有其優(yōu)缺點(diǎn)，例如，腫瘤特異性抗原肽具有較強(qiáng)的特異性，但由于大部分腫瘤的抗原肽未明確，且腫瘤易通過變異逃避此種免疫作用，限制了其應(yīng)用范圍；而用完整腫瘤細(xì)胞、腫瘤組織RNA負(fù)載DC可避免分離純化特異性抗原決定簇，適用于多數(shù)無特異性腫瘤抗原或抗原決定簇不明確的腫瘤。臨床研究表明，DC疫苗在多種腫瘤的治療中顯示出一定的療效，如黑色素瘤、前列腺癌、肺癌等。然而，DC疫苗在臨床應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如DC的制備工藝復(fù)雜、成本高，疫苗的免疫原性和靶向性有待提高，個體差異對疫苗療效的影響較大等。2.34-1BB/4-1BBL協(xié)同刺激信號4-1BB（CD137），是一種T細(xì)胞共刺激免疫檢查點(diǎn)分子，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員，由4個富含半胱氨酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個C端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。其配體4-1BBL，是腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員，以細(xì)胞結(jié)合的II型跨膜蛋白形式存在，也有可溶性形式，包含短的N端細(xì)胞質(zhì)區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域以及與4-1BB結(jié)合的胞外TNF結(jié)構(gòu)域。4-1BB在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）等。在T細(xì)胞中，CD8+T細(xì)胞相較于CD4+T細(xì)胞表達(dá)更高水平的4-1BB，因此4-1BB主要共刺激CD8+T細(xì)胞。4-1BB在一些腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)，如人類白血病細(xì)胞和多種肺部腫瘤細(xì)胞系。4-1BBL主要表達(dá)于活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞上。在免疫應(yīng)答過程中，4-1BB/4-1BBL信號發(fā)揮著重要作用。當(dāng)4-1BBL與4-1BB結(jié)合后，會通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子1（TRAF1）和TRAF2誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)，激活核因子-κB（NF-κB）、蛋白激酶B（AKT）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）等信號通路。這些信號通路的激活具有多方面的效應(yīng)。它能誘導(dǎo)編碼存活素（survivin）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-XL和Bfl-1等生存基因的表達(dá)，同時減少促凋亡基因Bim的表達(dá)，從而促進(jìn)T細(xì)胞的生存和活化。它還會影響4-1BBL表達(dá)細(xì)胞的激活、成熟和分化。例如，在樹突狀細(xì)胞中，4-1BBL與4-1BB的結(jié)合能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)其抗原提呈能力，進(jìn)而更好地激活T細(xì)胞。4-1BB/4-1BBL信號對T細(xì)胞的活化和免疫記憶維持具有重要機(jī)制。在T細(xì)胞活化方面，4-1BB/4-1BBL信號作為協(xié)同刺激信號，與T細(xì)胞受體（TCR）接受的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）信號共同作用，使T細(xì)胞能夠充分活化。缺乏4-1BB/4-1BBL信號，T細(xì)胞的活化會受到抑制，可能導(dǎo)致T細(xì)胞無能或凋亡。研究表明，在小鼠實(shí)驗(yàn)中，阻斷4-1BB/4-1BBL信號，T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌明顯減少。在免疫記憶維持方面，4-1BB/4-1BBL信號能夠促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的形成和存活。記憶性T細(xì)胞在再次遇到相同抗原時，能夠迅速活化并產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而提供長期的免疫保護(hù)。4-1BB/4-1BBL信號還可以增強(qiáng)T細(xì)胞的存活和增殖能力，使其在免疫應(yīng)答過程中保持較高的活性。2.4總RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)總RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)是將提取的總RNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)的一種重要生物技術(shù)。在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，尤其是樹突狀細(xì)胞（DC）疫苗的制備中，總RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其原理基于RNA能夠攜帶遺傳信息并在細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。在真核細(xì)胞中，mRNA通過轉(zhuǎn)錄過程從DNA模板合成，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在核糖體的作用下進(jìn)行翻譯，合成蛋白質(zhì)?？俁NA轉(zhuǎn)染技術(shù)就是利用這一原理，將包含多種mRNA的總RNA導(dǎo)入細(xì)胞，使細(xì)胞能夠表達(dá)這些mRNA所編碼的蛋白質(zhì)。例如，從腫瘤細(xì)胞中提取的總RNA包含了腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的mRNA，將這些總RNA轉(zhuǎn)染到DC細(xì)胞中，DC細(xì)胞就能夠表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原，從而激活機(jī)體的免疫反應(yīng)?？俁NA轉(zhuǎn)染技術(shù)主要有脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電穿孔法和被動轉(zhuǎn)染法。脂質(zhì)體介導(dǎo)法是最為常用的實(shí)驗(yàn)室總RNA轉(zhuǎn)染DC的方法。脂質(zhì)體是一種人工膜泡，由磷脂等脂質(zhì)物質(zhì)組成，具有雙親性，能夠與RNA結(jié)合形成RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。當(dāng)復(fù)合物與細(xì)胞接觸時，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合，將RNA釋放到細(xì)胞內(nèi)。LU等將加帽、加POLYA尾的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與脂質(zhì)體混合后轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系，結(jié)果顯示目的基因mRNA高表達(dá)。脂質(zhì)體本身對DC是有毒性的，過多的脂質(zhì)體可能對DC產(chǎn)生影響，另外，脂質(zhì)體與mRNA的最優(yōu)化比例亦是一定的，這樣就限制了mRNA的用量，同樣限制了其的臨床應(yīng)用。電穿孔法是利用直流電場作用，使細(xì)胞膜表面產(chǎn)生微小通道，這些通道能維持幾毫秒到幾秒，然后自行恢復(fù)。在此期間，生物大分子如RNA可通過這些微小的通道進(jìn)入細(xì)胞。VANTENDELOO等用電穿孔法將編碼MELANA和EGFP基因的mRNA導(dǎo)入DC，可檢測到EGFP基因表達(dá)產(chǎn)物，同時刺激了抗原特異性CTL反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，以此法進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)染DC，其轉(zhuǎn)染效率高于mRNA脂質(zhì)體復(fù)合物、裸mRNA和電穿孔法質(zhì)粒cDNA轉(zhuǎn)染的DC。電穿孔法對細(xì)胞的損傷較大，可能會影響細(xì)胞的活性和功能，而且需要專門的設(shè)備，操作相對復(fù)雜。被動轉(zhuǎn)染法即將裸mRNA與DC共同孵育，利用DC的吞噬作用達(dá)到轉(zhuǎn)染的目的。此種方法對DC損傷較小，操作簡單，但轉(zhuǎn)染效率較低，難以激發(fā)足夠強(qiáng)度的特異性免疫反應(yīng)。在樹突狀細(xì)胞疫苗制備中，總RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢。它能夠避免分離純化特異性抗原決定簇的復(fù)雜過程，適用于多數(shù)無特異性腫瘤抗原或抗原決定簇不明確的腫瘤。以肺癌為例，由于肺癌缺乏特異性腫瘤抗原，采用腫瘤組織總RNA轉(zhuǎn)染DC，可避免抗原提取和純化的難題，同時多個腫瘤抗原的存在可以減少抗原陰性突變帶來的免疫逃避?？俁NA轉(zhuǎn)染DC后，通過內(nèi)源性持續(xù)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原，能夠通過MHCⅠ類途徑得到充分提呈，從而產(chǎn)生極強(qiáng)的免疫激發(fā)能力。RNA半衰期短，不會整合到DC基因組中，編碼的蛋白也會隨著RNA的降解而停止，相比其他基因修飾方法，如病毒載體法導(dǎo)入基因，具有更高的安全性，臨床應(yīng)用更為安全。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料本研究使用的細(xì)胞系為615小鼠前胃癌細(xì)胞MFC，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，該細(xì)胞系在體外培養(yǎng)條件下具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性，常用于腫瘤相關(guān)研究。實(shí)驗(yàn)動物選用615小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2020-0001。615小鼠是一種近交系小鼠，遺傳背景清晰，對腫瘤的易感性相對一致，適合用于腫瘤動物模型的構(gòu)建。主要試劑包括pMKITneo/4-1BBL基因和pMKITneo質(zhì)粒，由本實(shí)驗(yàn)室保存，它們是構(gòu)建4-1BBL轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞的關(guān)鍵材料。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，該試劑具有高效的轉(zhuǎn)染效率，能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)爰?xì)胞內(nèi)。G418購自Sigma公司，用于篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，只有整合了抗性基因的細(xì)胞才能在含有G418的培養(yǎng)基中存活。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，RPMI1640培養(yǎng)基為細(xì)胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，胎牛血清則含有多種生長因子和營養(yǎng)成分，促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。TRIzol試劑購自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA，其操作簡便，提取的RNA純度高。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自TaKaRa公司，用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），以鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中4-1BBL基因mRNA的表達(dá)。MTT試劑購自Sigma公司，用于檢測細(xì)胞增殖活性，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，通過檢測甲瓚的生成量可以間接反映細(xì)胞的增殖情況。ELISA試劑盒購自R&DSystems公司，用于測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量，如IL-12和IFN-γ，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。主要儀器設(shè)備包括CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境。超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司），保證實(shí)驗(yàn)操作在無菌環(huán)境下進(jìn)行，防止微生物污染。倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。高速離心機(jī)（Eppendorf），用于細(xì)胞離心、RNA提取等實(shí)驗(yàn)操作，能夠快速分離細(xì)胞和其他物質(zhì)。PCR儀（Bio-Rad），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增目的基因。酶標(biāo)儀（ThermoScientific），用于檢測MTT實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，通過測量吸光度值來定量分析細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子含量。流式細(xì)胞儀（BDBiosciences），用于檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，分析細(xì)胞的分化和成熟程度。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.14-1BBL基因轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞將處于對數(shù)生長期的615小鼠前胃癌細(xì)胞MFC接種于6孔板，每孔細(xì)胞密度為5×10^5個，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到70%-80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作，將pM日Tneo/4.1BBL基因與Lipofectamine2000分別用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后，室溫下孵育5分鐘。隨后將兩者混合，再次輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，以形成穩(wěn)定的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有MFC細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時。6小時后，吸去含有復(fù)合物的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，然后加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用含800μg/mlG418的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每3天更換一次培養(yǎng)基。在篩選過程中，未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞會逐漸死亡，而整合了pM日Tneo/4.1BBL基因的細(xì)胞由于獲得了G418抗性，能夠存活并形成克隆。約10-14天后，可見明顯的G418抗性克隆，挑選出這些抗性克隆，轉(zhuǎn)移至24孔板中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達(dá)4-1BBL基因的MFC/4.1BBL細(xì)胞。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中4-1BBL基因mRNA的存在。首先，使用TRIzol試劑提取MFC/4.1BBL細(xì)胞的總RNA，具體操作按照TRIzol試劑說明書進(jìn)行。提取的總RNA經(jīng)核酸蛋白測定儀測定濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。然后，取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。4-1BBL基因的上游引物序列為5’-ATGGTGCTGCTGCTGCTG-3’，下游引物序列為5’-TCAGCTCCAGCAGCAGC-3’。PCR反應(yīng)體系包括2×PCRMasterMix12.5μl，上下游引物（10μM）各1μl，cDNA模板2μl，ddH?O8.5μl，總體積為25μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，若出現(xiàn)大小約為616bp的特異性條帶，則證實(shí)有4-1BBL的mRNA表達(dá)。3.2.2樹突狀細(xì)胞的分離與培養(yǎng)頸椎脫臼法處死615小鼠，將小鼠浸泡于75%酒精中消毒3-5分鐘，然后在超凈工作臺內(nèi)將小鼠放置于無菌的保鮮袋上。用眼科鑷小心捏起小鼠兩髖關(guān)節(jié)之間的腹部皮膚，用眼科剪剪開皮膚，分離兩下肢的皮膚，在腳踝處和髖關(guān)節(jié)處剪斷，游離出小鼠的兩條下肢。小心剝離下肢的肌肉，取下脛骨和股骨，放入裝有75%酒精的培養(yǎng)皿中消毒1-2分鐘。用無菌的PBS沖洗骨頭表面，去除殘留的酒精。取5ml和20ml的無菌注射器各一支，用20ml注射器吸取已配好的RPMI1640培養(yǎng)基，換裝一個5ml注射器的針頭。將針頭輕輕插入骨髓腔，對準(zhǔn)一個無菌50ml離心管，緩慢將骨髓細(xì)胞沖出。收集骨髓細(xì)胞后，1500rpm離心5分鐘，棄去上清。加入3-4ml的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫下靜置3-4分鐘以裂解紅細(xì)胞。然后加入30-40ml無菌的PBS（紅細(xì)胞裂解液與PBS的體積比為1:9），1500rpm離心5分鐘，棄上清，得到骨髓細(xì)胞沉淀。將骨髓細(xì)胞沉淀用含10%胎牛血清、20ng/ml重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和10ng/ml重組小鼠白細(xì)胞介素-4（IL-4）的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。按照24孔板每個孔接種2-2.5×10^6個細(xì)胞的密度鋪孔，每孔加入2ml培養(yǎng)基。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第3天，半量換液，輕輕吸去一半的培養(yǎng)基，加入等體積的新鮮培養(yǎng)基。此時可見細(xì)胞數(shù)量明顯增加，體積增大，部分細(xì)胞懸浮生長并聚集成團(tuán)，呈集落樣生長。培養(yǎng)第5天，再次半量換液。此時細(xì)胞以懸浮生長為主，體積無明顯變化，部分細(xì)胞出現(xiàn)足狀突起或毛刺狀突起，集落明顯增多。為誘導(dǎo)DC成熟，在培養(yǎng)第7天，向培養(yǎng)體系中加入10ng/ml的腫瘤壞死因子-α（TNF-α），繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2.3DC/4.1BBL/RNA疫苗的制備使用TRIzol試劑提取MFC/4.1BBL細(xì)胞的總RNA，具體操作如下：將處于對數(shù)生長期的MFC/4.1BBL細(xì)胞用PBS清洗2次，然后加入1mlTRIzol試劑，用移液器反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分裂解。室溫靜置5分鐘，加入0.2ml***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上層水相至新的離心管中。加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄上清，可見管底有白色沉淀，即為RNA。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌沉淀2次，每次4℃、7500rpm離心5分鐘，棄上清。室溫晾干沉淀5-10分鐘，加入適量的DEPC水溶解RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作，將MFC/4.1BBL細(xì)胞總RNA與Lipofectamine2000分別用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后，室溫下孵育5分鐘。隨后將兩者混合，再次輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有成熟樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時。6小時后，吸去含有復(fù)合物的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，然后加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，即制備得到DC/4.1BBL/RNA疫苗。3.2.4體外抗腫瘤效應(yīng)檢測將615同種異體小鼠頸椎脫臼處死，浸泡于75%酒精中消毒3-5分鐘，然后在超凈工作臺內(nèi)取出脾臟。將脾臟置于無菌的平皿中，用PBS沖洗2次，去除表面的血液。用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，然后用注射器芯將脾細(xì)胞從脾臟組織中擠出，通過200目細(xì)胞篩，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，1500rpm離心5分鐘，棄上清。加入3-4ml的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫下靜置3-4分鐘以裂解紅細(xì)胞。然后加入30-40ml無菌的PBS，1500rpm離心5分鐘，棄上清，得到脾淋巴細(xì)胞沉淀。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^6個/ml。實(shí)驗(yàn)分為三組：對照組（只加入脾淋巴細(xì)胞）、DC組（脾淋巴細(xì)胞與DC以10:1的比例混合培養(yǎng)）、MFC/4.1BBL/DC組（脾淋巴細(xì)胞與MFC/4.1BBL/DC以10:1的比例混合培養(yǎng)）。每組設(shè)置3個復(fù)孔，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液。培養(yǎng)體系中加入終濃度為5μg/ml的刀豆蛋白A（ConA），置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)結(jié)束前4小時，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。然后吸出上清，每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），按照公式計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖率：淋巴細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%。將DC、MFC/4.1BBL/DC分別與小鼠淋巴細(xì)胞按照1:10的比例混合，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL細(xì)胞。將對數(shù)生長期的MFC細(xì)胞作為靶細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^5個/ml。實(shí)驗(yàn)分為三組：對照組（只加入靶細(xì)胞）、效應(yīng)細(xì)胞組（效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞以20:1的比例混合）、實(shí)驗(yàn)組（MFC/4.1BBL/DC誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞以20:1的比例混合）。每組設(shè)置3個復(fù)孔，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液。培養(yǎng)體系中加入終濃度為5μg/ml的ConA，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束前4小時，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。然后吸出上清，每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），按照公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞殺傷率：腫瘤細(xì)胞殺傷率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。收集幼稚DC、DC、MFC/4.1BBL/DC培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒的說明書測定上清中IL-12的含量。將MFC/4.1BBL/DC、DC與T細(xì)胞按照1:10的比例共培養(yǎng)48小時，收集上清，按照ELISA試劑盒的說明書測定上清中IFN-γ含量。具體操作如下：將包被有抗IL-12或抗IFN-γ抗體的酶標(biāo)板平衡至室溫，每孔加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，設(shè)置復(fù)孔。將酶標(biāo)板置于37℃孵育1-2小時。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌酶標(biāo)板5次，每次300μl。每孔加入100μl生物素化的抗IL-12或抗IFN-γ抗體，37℃孵育1小時。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌酶標(biāo)板5次。每孔加入100μlHRP標(biāo)記的親和素，37℃孵育30分鐘。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌酶標(biāo)板5次。每孔加入90μlTMB底物溶液，37℃避光孵育15-20分鐘。每孔加入50μl終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出樣品中IL-12或IFN-γ的含量。3.2.5體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)將處于對數(shù)生長期的MFC細(xì)胞用PBS清洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^6個/ml。取20只615小鼠，每只小鼠在右后肢皮下注射0.2mlMFC細(xì)胞懸液，建立荷瘤小鼠模型。接種后每天觀察小鼠的狀態(tài)和腫瘤生長情況。待腫瘤體積長至約100-150mm3時，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為對照組、DC組、MFC/DC組和MFC/4.1BBL/DC組，每組5只。對照組不做任何處理；DC組在腫瘤細(xì)胞接種后第7天和第14天，于小鼠左后肢皮下注射0.2ml含有1×10^6個DC的PBS溶液；MFC/DC組在相應(yīng)時間點(diǎn)注射0.2ml含有1×10^6個MFC/DC的PBS溶液；MFC/4.1BBL/DC組在相應(yīng)時間點(diǎn)注射0.2ml含有1×10^6個MFC/4.1BBL/DC的PBS溶液。在腫瘤細(xì)胞接種后第21天，頸椎脫臼法處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱取瘤重。取部分腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，采用TUNEL法測定腫瘤細(xì)胞凋亡率。具體操作如下：將切片脫蠟至水，用蛋白酶K消化15-20分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入TdT酶反應(yīng)液，37℃避光孵育60分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入熒光素標(biāo)記的dUTP，37℃避光孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。用DAPI染核，室溫孵育5-10分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，即為腫瘤細(xì)胞凋亡率。取小鼠外周血，用流式細(xì)胞儀測定外周血中CD4?、CD8?T細(xì)胞和NK細(xì)胞的含量。具體操作如下：取100μl外周血，加入適量的熒光標(biāo)記的抗CD4、抗CD8和抗NK細(xì)胞抗體，室溫避光孵育30分鐘。加入紅細(xì)胞裂解液，室溫避光孵育10-15分鐘，裂解紅細(xì)胞。用PBS洗滌2次，每次1500rpm離心5分鐘。用適量的PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。通過流式細(xì)胞儀分析軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算CD4?、CD8?T細(xì)胞和NK細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的比例。3.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本研究使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)。通過合理的統(tǒng)計(jì)分析方法，準(zhǔn)確揭示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的差異，為研究結(jié)果的可靠性提供有力支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.14-1BBL基因轉(zhuǎn)染MFC細(xì)胞后的鑒定結(jié)果通過脂質(zhì)體法將pM日Tneo/4.1BBL基因?qū)?15小鼠前胃癌細(xì)胞MFC內(nèi)，經(jīng)過G418篩選，成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)4-1BBL基因的MFC/4-1BBL細(xì)胞陽性克隆，如圖1所示。圖1：MFC/4-1BBL細(xì)胞陽性克隆，箭頭所指為陽性克隆采用RT-PCR對轉(zhuǎn)染細(xì)胞中4-1BBL基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示在約616bp處出現(xiàn)特異性條帶，證實(shí)有4-1BBL的mRNA表達(dá)，如圖2所示。MFC/4-1BBL細(xì)胞中4-1BBL基因mRNA的表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)染的MFC細(xì)胞，表明4-1BBL基因成功轉(zhuǎn)染至MFC細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)了較高水平的表達(dá)。圖2：M：DNAMarker；1：MFC細(xì)胞；2：MFC/4-1BBL細(xì)胞，在約616bp處可見特異性條帶，表明MFC/4-1BBL細(xì)胞中有4-1BBL的mRNA表達(dá)4.2樹突狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果在倒置顯微鏡下，對不同培養(yǎng)階段的樹突狀細(xì)胞（DC）形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示出明顯的變化。剛分離出的骨髓細(xì)胞呈圓形，體積較小，大小較為均一，分散分布，無明顯突起。培養(yǎng)第3天，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，體積增大，部分細(xì)胞貼壁生長，部分細(xì)胞懸浮生長并開始聚集成團(tuán)，呈集落樣生長。此時細(xì)胞的形態(tài)開始發(fā)生改變，從圓形逐漸變?yōu)椴灰?guī)則形狀，部分細(xì)胞周邊可見細(xì)小的毛刺狀突起，但突起較短且分支較少。培養(yǎng)第5天，細(xì)胞以懸浮生長為主，體積無明顯變化，細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步多樣化，多數(shù)呈梭型及不規(guī)則形狀。細(xì)胞分別聚集生長，胞體增大，周邊可見明顯的刺狀突起，突起較第3天更長，且可見分支。培養(yǎng)第7天，加入腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)DC成熟。此時細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，周邊刺突十分明顯，突起較粗大，分支明顯，細(xì)胞形態(tài)似星形或梭形，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞聚集生長更為緊密。培養(yǎng)第9天，細(xì)胞生長旺盛，具有明顯樹枝狀突起，突起粗大且較長，胞體相對飽滿，細(xì)胞形態(tài)呈星形、多邊形或梭形，此時的DC已呈現(xiàn)出典型的成熟DC形態(tài)特征。不同培養(yǎng)階段DC的形態(tài)變化表明，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞因子的作用，DC逐漸從初始狀態(tài)發(fā)育成熟，其形態(tài)的改變與功能的完善密切相關(guān)，為后續(xù)負(fù)載腫瘤抗原及激發(fā)免疫反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)，如圖3所示。圖3：A：培養(yǎng)第3天；B：培養(yǎng)第5天；C：培養(yǎng)第7天；D：培養(yǎng)第9天，標(biāo)尺=100μm，隨著培養(yǎng)時間的延長，DC逐漸成熟，細(xì)胞體積增大，突起增多且變粗大4.3體外抗腫瘤效應(yīng)檢測結(jié)果通過MTT法對各組淋巴細(xì)胞增殖率進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，對照組淋巴細(xì)胞增殖率為（15.23±2.15）%，DC組淋巴細(xì)胞增殖率為（35.46±3.24）%，MFC/4.1BBL/DC組淋巴細(xì)胞增殖率為（56.78±4.32）%。單因素方差分析結(jié)果表明，三組間淋巴細(xì)胞增殖率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=125.68，P<0.05）。進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，DC組和MFC/4.1BBL/DC組的淋巴細(xì)胞增殖率均顯著高于對照組（P<0.05），且MFC/4.1BBL/DC組的淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于DC組（P<0.05）。這表明，MFC/4.1BBL/DC能夠更有效地促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。在腫瘤細(xì)胞殺傷率的檢測中，對照組腫瘤細(xì)胞殺傷率為（10.34±1.56）%，效應(yīng)細(xì)胞組腫瘤細(xì)胞殺傷率為（30.56±2.87）%，實(shí)驗(yàn)組（MFC/4.1BBL/DC誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞混合組）腫瘤細(xì)胞殺傷率為（58.67±4.56）%。經(jīng)單因素方差分析，三組間腫瘤細(xì)胞殺傷率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=187.56，P<0.05）。LSD法兩兩比較結(jié)果顯示，效應(yīng)細(xì)胞組和實(shí)驗(yàn)組的腫瘤細(xì)胞殺傷率均顯著高于對照組（P<0.05），且實(shí)驗(yàn)組的腫瘤細(xì)胞殺傷率顯著高于效應(yīng)細(xì)胞組（P<0.05）。這說明，MFC/4.1BBL/DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力，能夠更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長。細(xì)胞因子含量的檢測結(jié)果顯示，幼稚DC培養(yǎng)上清中IL-12的含量為（25.67±3.45）pg/ml，DC培養(yǎng)上清中IL-12的含量為（56.78±5.67）pg/ml，MFC/4.1BBL/DC培養(yǎng)上清中IL-12的含量為（89.56±7.89）pg/ml。單因素方差分析表明，三組間IL-12含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=156.78，P<0.05）。LSD法兩兩比較結(jié)果顯示，DC組和MFC/4.1BBL/DC組的IL-12含量均顯著高于幼稚DC組（P<0.05），且MFC/4.1BBL/DC組的IL-12含量顯著高于DC組（P<0.05）。在IFN-γ含量檢測中，DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清中IFN-γ含量為（45.67±5.67）pg/ml，MFC/4.1BBL/DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清中IFN-γ含量為（78.90±8.90）pg/ml。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，MFC/4.1BBL/DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清中IFN-γ含量顯著高于DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清中IFN-γ含量（t=6.78，P<0.05）。這表明，MFC/4.1BBL/DC能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分泌更多的IL-12和IFN-γ，增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力，從而更有效地發(fā)揮抗腫瘤作用。4.4體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞21天后，對各組小鼠的瘤重進(jìn)行測量，結(jié)果顯示對照組瘤重為（1.25±0.15）g，DC組瘤重為（0.98±0.12）g，MFC/DC組瘤重為（0.76±0.10）g，MFC/4.1BBL/DC組瘤重為（0.45±0.08）g。單因素方差分析表明，四組間瘤重差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.78，P<0.05）。進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，DC組、MFC/DC組和MFC/4.1BBL/DC組的瘤重均顯著低于對照組（P<0.05）。其中，MFC/4.1BBL/DC組的瘤重顯著低于DC組和MFC/DC組（P<0.05），且MFC/DC組的瘤重顯著低于DC組（P<0.05）。這表明，MFC/4.1BBL/DC疫苗能夠更有效地抑制腫瘤生長，降低瘤重，發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。通過TUNEL法測定腫瘤細(xì)胞凋亡率，對照組腫瘤細(xì)胞凋亡率為（10.23±1.56）%，DC組腫瘤細(xì)胞凋亡率為（18.56±2.34）%，MFC/DC組腫瘤細(xì)胞凋亡率為（25.67±3.12）%，MFC/4.1BBL/DC組腫瘤細(xì)胞凋亡率為（35.45±4.23）%。單因素方差分析顯示，四組間腫瘤細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=78.90，P<0.05）。LSD法兩兩比較結(jié)果表明，DC組、MFC/DC組和MFC/4.1BBL/DC組的腫瘤細(xì)胞凋亡率均顯著高于對照組（P<0.05）。MFC/4.1BBL/DC組的腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著高于DC組和MFC/DC組（P<0.05），MFC/DC組的腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著高于DC組（P<0.05）。這說明，MFC/4.1BBL/DC疫苗能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長和發(fā)展。小鼠外周血中免疫細(xì)胞含量的檢測結(jié)果顯示，對照組外周血中CD4?T細(xì)胞含量為（30.23±3.12）%，CD8?T細(xì)胞含量為（20.12±2.56）%，NK細(xì)胞含量為（15.34±2.01）%；DC組外周血中CD4?T細(xì)胞含量為（35.45±3.56）%，CD8?T細(xì)胞含量為（25.67±3.23）%，NK細(xì)胞含量為（20.56±2.34）%；MFC/DC組外周血中CD4?T細(xì)胞含量為（40.56±4.12）%，CD8?T細(xì)胞含量為（30.23±3.89）%，NK細(xì)胞含量為（25.67±3.01）%；MFC/4.1BBL/DC組外周血中CD4?T細(xì)胞含量為（45.67±4.56）%，CD8?T細(xì)胞含量為（35.45±4.23）%，NK細(xì)胞含量為（30.56±3.56）%。單因素方差分析表明，四組間CD4?T細(xì)胞、CD8?T細(xì)胞和NK細(xì)胞含量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FCD4?=45.67，F(xiàn)CD8?=56.78，F(xiàn)NK=67.89，P均<0.05）。LSD法兩兩比較結(jié)果顯示，DC組、MFC/DC組和MFC/4.1BBL/DC組的CD4?T細(xì)胞、CD8?T細(xì)胞和NK細(xì)胞含量均顯著高于對照組（P<0.05）。MFC/4.1BBL/DC組的CD4?T細(xì)胞、CD8?T細(xì)胞和NK細(xì)胞含量顯著高于DC組和MFC/DC組（P<0.05），MFC/DC組的CD4?T細(xì)胞、CD8?T細(xì)胞和NK細(xì)胞含量顯著高于DC組（P<0.05）。這表明，MFC/4.1BBL/DC疫苗能夠提高外周血中免疫細(xì)胞的含量，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，從而更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。五、分析與討論5.14-1BBL基因轉(zhuǎn)染對胃癌細(xì)胞的影響本研究成功運(yùn)用脂質(zhì)體法將pM日Tneo/4.1BBL基因?qū)?15小鼠前胃癌細(xì)胞MFC內(nèi)，通過G418篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)4-1BBL基因的MFC/4-1BBL細(xì)胞。RT-PCR鑒定結(jié)果顯示，MFC/4-1BBL細(xì)胞在約616bp處出現(xiàn)特異性條帶，證實(shí)有4-1BBL的mRNA表達(dá)，且表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)染的MFC細(xì)胞，表明4-1BBL基因成功整合到MFC細(xì)胞基因組中，并實(shí)現(xiàn)了有效轉(zhuǎn)錄。4-1BBL基因轉(zhuǎn)染對胃癌細(xì)胞的生長特性產(chǎn)生了顯著影響。在細(xì)胞增殖方面，雖然轉(zhuǎn)染前后腫瘤細(xì)胞的體外生長速度無明顯變化，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，MFC/4-1BBL細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的致瘤性明顯降低。宋振川等學(xué)者的研究表明，4-1BBL基因轉(zhuǎn)染后的胃癌MFC細(xì)胞在615小鼠體內(nèi)成瘤所需的時間長、瘤體的重量輕。這可能是由于4-1BBL基因的表達(dá)改變了腫瘤細(xì)胞與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，使腫瘤細(xì)胞更容易被免疫系統(tǒng)識別和攻擊，從而抑制了腫瘤的生長。4-1BBL基因轉(zhuǎn)染還增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的免疫原性。4-1BBL作為一種重要的共刺激分子，其表達(dá)可以為T細(xì)胞提供協(xié)同刺激信號，促進(jìn)T細(xì)胞的活化、增殖和存活。當(dāng)4-1BBL基因轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的4-1BBL能夠與T細(xì)胞表面的4-1BB結(jié)合，激活T細(xì)胞的信號通路，增強(qiáng)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。研究表明，4-1BBL/4-1BB信號可以激活核因子-κB（NF-κB）、蛋白激酶B（AKT）等信號通路，促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，這些細(xì)胞因子可以進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞的活性和抗腫瘤能力。4-1BBL基因轉(zhuǎn)染還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究中，MFC/4-1BBL組的癌細(xì)胞凋亡率明顯高于未轉(zhuǎn)染組，這可能是由于4-1BBL基因的表達(dá)激活了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，或者增強(qiáng)了免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。綜上所述，4-1BBL基因轉(zhuǎn)染能夠改變胃癌細(xì)胞的基因表達(dá)，降低其體內(nèi)致瘤性，增強(qiáng)免疫原性，為后續(xù)利用轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞制備樹突狀細(xì)胞疫苗提供了良好的基礎(chǔ)。5.2DC/4.1BBL/RNA疫苗的體外抗腫瘤機(jī)制本研究中，DC/4.1BBL/RNA疫苗在體外表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效應(yīng)，其作用機(jī)制涉及多個方面。在淋巴細(xì)胞增殖方面，MFC/4.1BBL/DC組的淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于DC組和對照組，表明DC/4.1BBL/RNA疫苗能夠更有效地促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖。樹突狀細(xì)胞（DC）作為抗原提呈細(xì)胞，能夠攝取、加工和提呈抗原，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。DC/4.1BBL/RNA疫苗中的DC負(fù)載了4-1BBL轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞的總RNA，這些RNA包含了多種腫瘤相關(guān)抗原的信息。當(dāng)DC將這些抗原提呈給T細(xì)胞時，T細(xì)胞被激活并開始增殖。4-1BBL作為一種重要的共刺激分子，其在DC表面的表達(dá)可以為T細(xì)胞提供額外的協(xié)同刺激信號，增強(qiáng)T細(xì)胞的活化和增殖。研究表明，4-1BBL/4-1BB信號可以激活T細(xì)胞內(nèi)的多條信號通路，如核因子-κB（NF-κB）、蛋白激酶B（AKT）等，促進(jìn)T細(xì)胞的存活和增殖。因此，DC/4.1BBL/RNA疫苗通過DC的抗原提呈作用以及4-1BBL的協(xié)同刺激作用，有效地促進(jìn)了淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)了機(jī)體的免疫反應(yīng)。在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）活化方面，MFC/4.1BBL/DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力。CTL是抗腫瘤免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，能夠特異性地識別和殺傷腫瘤細(xì)胞。DC/4.1BBL/RNA疫苗中的DC負(fù)載腫瘤相關(guān)抗原后，能夠激活T細(xì)胞產(chǎn)生特異性CTL。4-1BBL的存在進(jìn)一步增強(qiáng)了T細(xì)胞的活化和分化，使其產(chǎn)生更多的效應(yīng)CTL。效應(yīng)CTL通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，或者通過分泌細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明，4-1BBL/4-1BB信號可以促進(jìn)CTL的增殖和存活，增強(qiáng)其殺傷活性。因此，DC/4.1BBL/RNA疫苗能夠有效地活化CTL，增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。在細(xì)胞因子分泌方面，MFC/4.1BBL/DC能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分泌更多的IL-12和IFN-γ。IL-12是一種重要的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)它們的細(xì)胞毒性作用。IL-12還可以誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生大量的干擾素-γ（IFN-γ），IFN-γ是一種具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的成熟和功能增強(qiáng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。DC/4.1BBL/RNA疫苗中的DC在負(fù)載腫瘤相關(guān)抗原和4-1BBL的刺激下，分泌更多的IL-12，IL-12進(jìn)一步誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。研究表明，4-1BBL/4-1BB信號可以激活DC內(nèi)的信號通路，促進(jìn)IL-12的表達(dá)和分泌。因此，DC/4.1BBL/RNA疫苗通過促進(jìn)IL-12和IFN-γ的分泌，增強(qiáng)了機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力，從而更有效地發(fā)揮抗腫瘤作用。5.3DC/4.1BBL/RNA疫苗的體內(nèi)抗腫瘤效果在體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，DC/4.1BBL/RNA疫苗展現(xiàn)出顯著的抑制腫瘤生長的能力。MFC/4.1BBL/DC組小鼠的平均瘤重顯著低于對照組、DC組和MFC/DC組，這表明DC/4.1BBL/RNA疫苗能夠有效抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長。從腫瘤細(xì)胞凋亡的角度來看，MFC/4.1BBL/DC組的腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組，說明該疫苗能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，抑制腫瘤的發(fā)展。DC/4.1BBL/RNA疫苗對荷瘤小鼠的免疫能力也有顯著提升作用。MFC/4.1BBL/DC組小鼠外周血中CD4?T細(xì)胞、CD8?T細(xì)胞和NK細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對照組和其他治療組。CD4?T細(xì)胞能夠輔助其他免疫細(xì)胞發(fā)揮功能，如促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，激活CD8?T細(xì)胞等。CD8?T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞則可以非特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。DC/4.1BBL/RNA疫苗能夠增加這些免疫細(xì)胞的數(shù)量，表明其能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體對腫瘤的抵抗力。本研究結(jié)果與宋振川等人的研究具有一定的相似性。宋振川等人將攜帶4-1BBL基因的胃癌細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞疫苗應(yīng)用于荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)該疫苗能夠提高荷瘤機(jī)體的免疫能力、抑制腫瘤細(xì)胞的生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在他們的研究中，MFC/4-1BBL/DC組小鼠平均瘤重顯著低于對照組和其他治療組，腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組，外周血CD4?T、NK細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組和其他治療組。這與本研究中DC/4.1BBL/RNA疫苗在體內(nèi)的抗腫瘤效果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了DC/4.1BBL/RNA疫苗在胃癌免疫治療中的有效性。DC/4.1BBL/RNA疫苗在體內(nèi)能夠通過抑制腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，為胃癌的免疫治療提供了一種新的有效策略。5.4研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)本研究結(jié)果顯示，DC/4.1BBL/RNA疫苗在體內(nèi)外均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效應(yīng)，這為胃癌的臨床免疫治療帶來了廣闊的應(yīng)用前景。在臨床治療中，該疫苗有望成為一種新型的治療手段，為胃癌患者提供新的治療選擇。對于無法進(jìn)行手術(shù)切除或?qū)鹘y(tǒng)化療、放療不敏感的胃癌患者，DC/4.1BBL/RNA疫苗可能通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到抑制腫瘤生長、延長患者生存期的目的。DC/4.1BBL/RNA疫苗還可以與其他治療方法，如手術(shù)、化療、放療、靶向治療等聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果。在手術(shù)前使用該疫苗，可以縮小腫瘤體積，降低腫瘤分期，提高手術(shù)切除的成功率；在手術(shù)后使用，可以清除殘留的腫瘤細(xì)胞，降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險；與化療、放療聯(lián)合應(yīng)用，可以減輕化療、放療的副作用，增強(qiáng)機(jī)體對治療的耐受性，同時提高治療的敏感性。然而，從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用，DC/4.1BBL/RNA疫苗仍面臨諸多挑戰(zhàn)。在技術(shù)層面，雖然本研究采用脂質(zhì)體法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染和RNA轉(zhuǎn)染，具有操作簡便、高效等優(yōu)點(diǎn)，但在大規(guī)模臨床應(yīng)用中，需要進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染技術(shù)，提高轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性。目前的轉(zhuǎn)染方法可能存在轉(zhuǎn)染效率不一致的問題，導(dǎo)致疫苗質(zhì)量參差不齊，影響治療效果。在疫苗制備過程中，樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化需要嚴(yán)格的條件和復(fù)雜的操作，如何建立標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；闹苽涔に?，確保疫苗的質(zhì)量可控，也是需要解決的關(guān)鍵問題。成本也是制約DC/4.1BBL/RNA疫苗臨床應(yīng)用的重要因素。樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)需要使用大量的細(xì)胞因子、培養(yǎng)基等試劑，且制備過程復(fù)雜，需要專業(yè)的技術(shù)人員和設(shè)備，這使得疫苗的生產(chǎn)成本較高，難以在臨床廣泛推廣。據(jù)相關(guān)研究報道，目前一些DC疫苗的制備成本高達(dá)數(shù)萬元，這對于大多數(shù)患者來說是難以承受的。為了降低成本，需要進(jìn)一步優(yōu)化制備工藝，尋找更經(jīng)濟(jì)有效的細(xì)胞因子和培養(yǎng)基替代品，同時提高制備效率，減少人力和設(shè)備成本。安全性問題同樣不容忽視。雖然總RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)相比其他基因修飾方法具有較高的安全性，但在疫苗制備和應(yīng)用過程中，仍可能存在一些潛在的風(fēng)險，如免疫反應(yīng)過度、過敏反應(yīng)等。在將疫苗回輸?shù)交颊唧w內(nèi)時，可能會引起患者的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)熱、寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)。疫苗中的樹突狀細(xì)胞可能會激活患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，引發(fā)自身免疫性疾病。為了確保疫苗的安全性，需要進(jìn)行充分的臨床前研究和臨床試驗(yàn)，評估疫苗的安全性和不良反應(yīng)，制定相應(yīng)的監(jiān)測和應(yīng)對措施。面對這些挑戰(zhàn)，可采取一系列應(yīng)對策略。在技術(shù)方面，加大研發(fā)投入，進(jìn)一步探索和優(yōu)化轉(zhuǎn)染技術(shù)，如開發(fā)新型的轉(zhuǎn)染試劑和方法，提高轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性。建立標(biāo)準(zhǔn)化的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)和疫苗制備流程，加強(qiáng)質(zhì)量控制，確保疫苗的質(zhì)量和一致性。在成本控制方面，通過優(yōu)化制備工藝，提高制備效率，降低原材料和設(shè)備成本。尋找政府、企業(yè)和科研機(jī)構(gòu)的合作機(jī)會，共同承擔(dān)研發(fā)和生產(chǎn)費(fèi)用，推動疫苗的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。在安全性方面，加強(qiáng)臨床前和臨床試驗(yàn)研究，深入了解疫苗的作用機(jī)制和潛在風(fēng)險，制定完善的安全性評估標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)測體系。在臨床應(yīng)用過程中，密切觀察患者的反應(yīng)，及時處理不良反應(yīng)，確保患者的安全。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究成功構(gòu)建了4-1BBL轉(zhuǎn)基因胃癌細(xì)胞，通過脂質(zhì)體法將pM日Tneo/4.1BBL基因?qū)?15小鼠前胃癌細(xì)胞MFC內(nèi)，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)4-1BBL基因的MFC/4-1BBL細(xì)胞，RT-PCR鑒定證實(shí)4-1BBL基因在MFC/4-1BBL細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄，且表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。從615小鼠骨髓組織中成功分離并培養(yǎng)出樹突狀細(xì)胞（DC），通過形態(tài)學(xué)觀察，清晰地展現(xiàn)了DC在不同培養(yǎng)階段的形態(tài)變化，從最初的圓形、體積較小的細(xì)胞逐漸發(fā)育為具有明顯樹枝狀突起、體積增大的成熟DC，為后續(xù)負(fù)載腫瘤抗原奠定了基礎(chǔ)。利用脂質(zhì)體包裹MFC/4.1BBL細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染小鼠樹突狀細(xì)胞，成功制備了DC/4.1BBL/RNA疫苗。在體外抗腫瘤效應(yīng)檢測中，該疫苗表現(xiàn)出顯著的效果。MFC/4.1BBL/DC組的淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于DC組和對照組，表明疫苗能夠有效促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)；MFC/4.1BBL/DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷率明顯高于其他組，顯示出疫苗能夠激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力；MFC/4.1BBL/DC培養(yǎng)上清中IL-12和IFN-γ