J亞型禽白血病病毒抗體檢測(cè)方法構(gòu)建及LTR啟動(dòng)活性解析

J亞型禽白血病病毒抗體檢測(cè)方法構(gòu)建及LTR啟動(dòng)活性解析一、引言1.1研究背景禽白血病（AvianLeukosis，AL）是由禽白血病病毒（AvianLeukosisVirus，ALV）引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，是養(yǎng)禽業(yè)中一種重要的病毒性傳染病。ALV可導(dǎo)致禽類產(chǎn)生多種良性和惡性腫瘤，如淋巴細(xì)胞白血病、成紅細(xì)胞白血病、成髓細(xì)胞白血病、骨髓細(xì)胞瘤、血管瘤等，嚴(yán)重影響禽類的生長(zhǎng)發(fā)育、生產(chǎn)性能和繁殖能力，給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)病毒囊膜蛋白的抗原性、宿主范圍和致病性等差異，ALV可分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和J十個(gè)亞群。其中，J亞型禽白血病病毒（AvianLeukosisVirusSubgroupJ，ALV-J）自1988年首次從英國(guó)肉種雞中分離出來(lái)后，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，對(duì)肉種雞和商品肉雞產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重威脅。ALV-J主要通過(guò)垂直傳播和水平傳播兩種方式在雞群中傳播。垂直傳播是指病毒通過(guò)種蛋將病毒傳遞給下一代雛雞，這是ALV-J傳播的主要途徑，也是導(dǎo)致雞群中病毒持續(xù)存在和擴(kuò)散的重要原因。水平傳播則是指病毒在同一代雞群之間通過(guò)直接接觸、空氣、飼料、飲水等途徑傳播。ALV-J感染雞群后，可引起雞只生長(zhǎng)緩慢、消瘦、貧血、產(chǎn)蛋率下降、孵化率降低等非腫瘤綜合征，還可導(dǎo)致雞只發(fā)生免疫抑制，使雞群對(duì)其他病原體的易感性增加，容易繼發(fā)感染其他疾病，如馬立克氏病、傳染性法氏囊病、雞傳染性貧血等，進(jìn)一步加重病情，增加死亡率。此外，ALV-J還可誘發(fā)雞只產(chǎn)生各種腫瘤，如骨髓細(xì)胞瘤、血管瘤、肝癌、腎癌等，其中以骨髓細(xì)胞瘤最為常見(jiàn)。腫瘤的發(fā)生不僅會(huì)導(dǎo)致雞只死亡，還會(huì)影響雞肉和雞蛋的品質(zhì)，降低養(yǎng)殖效益。近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展，禽白血病的流行趨勢(shì)也日益嚴(yán)峻。ALV-J的感染不僅在肉種雞和商品肉雞中廣泛存在，而且在蛋雞和地方品種雞中也時(shí)有發(fā)生，其致瘤宿主譜系已擴(kuò)展至不易發(fā)生腫瘤的商品蛋雞，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，我國(guó)部分地區(qū)雞群中ALV-J的感染率高達(dá)30%-50%，甚至更高。一些種雞場(chǎng)由于感染ALV-J，不得不淘汰大量種雞，導(dǎo)致種雞數(shù)量減少，種蛋供應(yīng)不足，影響了肉雞和蛋雞的生產(chǎn)。此外，ALV-J感染還會(huì)導(dǎo)致雞群的免疫功能下降，增加其他疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步加重了養(yǎng)殖成本和經(jīng)濟(jì)損失。由于目前尚無(wú)有效的藥物或疫苗可以用于預(yù)防和治療ALV-J感染，因此，通過(guò)淘汰ALV-J抗體陽(yáng)性雞群，減少垂直傳播，是當(dāng)前凈化雞群感染禽白血病的唯一有效手段。而建立快速、準(zhǔn)確、敏感的ALV-J抗體檢測(cè)方法，對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染雞群，采取有效的防控措施，開展種群凈化工作具有重要意義。同時(shí)，深入研究ALV-J的分子生物學(xué)特性和致病機(jī)制，對(duì)于揭示其在雞群中垂直傳播的分子機(jī)制，為臨床防制ALV-J感染提供理論依據(jù)也具有重要的科學(xué)價(jià)值。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確、敏感的J亞型禽白血病病毒抗體檢測(cè)方法，為雞群中ALV-J的感染檢測(cè)和監(jiān)測(cè)提供有效的技術(shù)手段，同時(shí)通過(guò)對(duì)ALV-J基因組的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）體外啟動(dòng)活性進(jìn)行分析，探究其在雞群中垂直傳播的分子機(jī)制，為臨床防制ALV-J感染提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：ALV-J囊膜糖蛋白基因的表達(dá)與鑒定：根據(jù)ALV-J原型株HPRS103基因序列設(shè)計(jì)引物，利用原核表達(dá)系統(tǒng)特異性擴(kuò)增出囊膜糖蛋白基因（gp85），構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-gp85并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS電泳和蛋白免疫電泳檢測(cè)（WesternBlot），分析其表達(dá)情況和免疫原性。檢測(cè)ALV-J抗體的間接ELISA方法的建立：以純化后的GP85蛋白作為抗原，通過(guò)方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度，建立檢測(cè)ALV-J抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用建立的間接ELISA方法對(duì)部分雞場(chǎng)的ALV-J疑似血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，了解ALV-J在我國(guó)部分規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)的感染情況。ALV-J基因組LTR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能研究：將LTR基因插入含有螢光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic載體中，獲得pGL3-LTR重組質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建缺失LTR不同區(qū)段（U5、U3和R區(qū)）的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)螢光素酶的表達(dá)，研究LTR的啟動(dòng)子活性及其功能性區(qū)域，分析LTR在ALV-J復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的作用機(jī)制。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究主要采用分子生物學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)J亞型禽白血病病毒抗體檢測(cè)方法的建立及LTR體外啟動(dòng)活性進(jìn)行分析，具體研究方法如下：基因克隆與表達(dá)：根據(jù)GenBank中ALV-J原型株HPRS103基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增囊膜糖蛋白基因（gp85）。以ALV-J病毒基因組RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增gp85基因。將擴(kuò)增得到的gp85基因片段與原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gp85。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)SDS電泳和WesternBlot分析表達(dá)產(chǎn)物的分子量和免疫原性。間接ELISA方法的建立：將表達(dá)并純化后的GP85蛋白作為抗原，采用方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。用碳酸鹽緩沖液（CBS）將抗原稀釋至最佳包被濃度，包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3min。加入5%脫脂奶粉封閉液，37℃孵育2h。棄去封閉液，洗滌后加入不同稀釋度的待檢血清，37℃孵育1h。洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗雞IgG二抗，37℃孵育1h。洗滌后加入底物溶液（TMB），37℃避光顯色15min。最后加入終止液（2MH?SO?）終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光值（OD???）。以P/N值（樣品OD???值/陰性對(duì)照OD???值）≥2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，建立檢測(cè)ALV-J抗體的間接ELISA方法。對(duì)建立的間接ELISA方法進(jìn)行特異性、敏感性和重復(fù)性評(píng)價(jià)。特異性試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)雞群中常見(jiàn)的其他病毒抗體（如雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、馬立克氏病病毒等）進(jìn)行驗(yàn)證；敏感性試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同稀釋度的陽(yáng)性血清確定該方法的最低檢測(cè)限；重復(fù)性試驗(yàn)包括批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性，分別在同一批次和不同批次的酶標(biāo)板上進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算變異系數(shù)（CV）。利用建立的間接ELISA方法對(duì)部分雞場(chǎng)的ALV-J疑似血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率，了解ALV-J在我國(guó)部分規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)的感染情況。LTR轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能研究：根據(jù)ALV-J基因組序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增LTR基因。將擴(kuò)增得到的LTR基因片段插入到含有螢光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-LTR。同時(shí)，利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建缺失LTR不同區(qū)段（U5、U3和R區(qū)）的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至雞胚成纖維細(xì)胞（DF1細(xì)胞）中，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，利用螢光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)螢光素酶的表達(dá)活性。以轉(zhuǎn)染pGL3-Basic空載體的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以轉(zhuǎn)染含有SV40啟動(dòng)子的pGL3-Control載體的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)重組質(zhì)粒設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)螢光素酶活性檢測(cè)結(jié)果，分析LTR的啟動(dòng)子活性及其功能性區(qū)域，探究LTR在ALV-J復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的作用機(jī)制。本研究的技術(shù)路線如下：樣本采集與處理：采集ALV-J感染雞的組織或血液樣本，提取病毒基因組RNA和血清。gp85基因的克隆與表達(dá)：利用RT-PCR擴(kuò)增gp85基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gp85，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS和WesternBlot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。間接ELISA方法的建立：以純化的GP85蛋白為抗原，通過(guò)方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度，建立間接ELISA方法，并對(duì)其特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。LTR轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能研究：擴(kuò)增LTR基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-LTR及缺失不同區(qū)段的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，檢測(cè)螢光素酶活性，分析LTR的啟動(dòng)子活性及其功能性區(qū)域。結(jié)果分析與討論：對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，討論ALV-J抗體檢測(cè)方法的可行性和LTR轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的研究結(jié)果，為ALV-J的防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。二、J亞型禽白血病病毒概述2.1ALV-J的發(fā)現(xiàn)與分布1988年，J亞型禽白血病病毒首次在英國(guó)的肉種雞中被分離出來(lái)，這一發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著家禽傳染病研究領(lǐng)域的一個(gè)重要里程碑。在此之前，人們對(duì)禽白血病病毒的認(rèn)識(shí)主要集中在其他亞型上，而ALV-J的出現(xiàn)，為禽白血病的研究和防控帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。最初，ALV-J主要在肉種雞和商品肉雞中被檢測(cè)到，隨著時(shí)間的推移，其傳播范圍逐漸擴(kuò)大，不僅在歐洲、美洲等地區(qū)的養(yǎng)雞場(chǎng)中廣泛傳播，還在亞洲、非洲等地區(qū)的部分國(guó)家和地區(qū)被發(fā)現(xiàn)。這種廣泛的傳播表明，ALV-J具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和傳播能力，能夠在不同的地理環(huán)境和養(yǎng)殖條件下生存和繁衍。自1999年我國(guó)首次從市場(chǎng)肉雞群中檢測(cè)和分離出ALV-J以來(lái)，其在我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)中的分布呈現(xiàn)出逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)。早期，ALV-J主要集中在一些大型肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)，隨著種雞的引進(jìn)和交易，其逐漸傳播到全國(guó)各地的養(yǎng)雞場(chǎng)，包括蛋雞場(chǎng)和地方品種雞場(chǎng)。近年來(lái)，我國(guó)部分地區(qū)雞群中ALV-J的感染率呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，一些地區(qū)的感染率甚至高達(dá)30%-50%。這種高感染率不僅給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還對(duì)我國(guó)的家禽產(chǎn)業(yè)安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。ALV-J的傳播途徑主要包括垂直傳播和水平傳播。垂直傳播是指病毒通過(guò)種蛋將病毒傳遞給下一代雛雞，這是ALV-J傳播的主要途徑，也是導(dǎo)致雞群中病毒持續(xù)存在和擴(kuò)散的重要原因。種雞在感染ALV-J后，病毒會(huì)在其體內(nèi)大量復(fù)制，并進(jìn)入生殖系統(tǒng)，從而導(dǎo)致種蛋被病毒污染。當(dāng)這些被污染的種蛋孵化時(shí)，雛雞就會(huì)感染ALV-J，成為新的傳染源。水平傳播則是指病毒在同一代雞群之間通過(guò)直接接觸、空氣、飼料、飲水等途徑傳播。在雞舍內(nèi)，雞群之間的密切接觸為病毒的傳播提供了便利條件。此外，被ALV-J污染的飼料、飲水、器具等也可能成為病毒傳播的媒介。2.2ALV-J的生物學(xué)特性ALV-J屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科C型腫瘤病毒屬，病毒粒子呈球形，直徑約80-100nm，由外部的囊膜和內(nèi)部的電子致密核心構(gòu)成，核心直徑約45nm。病毒囊膜上有放射狀突起，直徑約8nm，這些突起由病毒的囊膜糖蛋白組成，在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它們能夠與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞。ALV-J的基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約7.2kb，可直接作為mRNA。基因組包含gag、pol和env三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白、反轉(zhuǎn)錄酶和囊膜糖蛋白。其中，gag基因編碼的蛋白質(zhì)參與病毒粒子的組裝，pol基因編碼的反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)于病毒的復(fù)制至關(guān)重要，它能夠以病毒RNA為模板合成cDNA，進(jìn)而整合到宿主細(xì)胞的基因組中，env基因編碼的囊膜糖蛋白則決定了病毒的宿主范圍和抗原性。在病毒復(fù)制過(guò)程中，ALV-J首先通過(guò)囊膜糖蛋白與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，然后病毒囊膜與細(xì)胞膜融合，將病毒核心釋放到細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，病毒的反轉(zhuǎn)錄酶以病毒RNA為模板合成cDNA，形成前病毒。前病毒整合到宿主細(xì)胞的基因組中，成為宿主細(xì)胞基因組的一部分。當(dāng)宿主細(xì)胞受到刺激時(shí)，前病毒會(huì)轉(zhuǎn)錄出病毒RNA和mRNA，病毒RNA用于組裝新的病毒粒子，mRNA則翻譯出病毒蛋白質(zhì)。新合成的病毒粒子通過(guò)出芽的方式從宿主細(xì)胞中釋放出來(lái)，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。ALV-J主要感染雞，尤其是肉雞和肉種雞，對(duì)蛋雞和地方品種雞的感染也逐漸增多。它具有較強(qiáng)的組織嗜性，主要侵害骨髓、肝臟、脾臟、腎臟等組織器官。在骨髓中，ALV-J感染骨髓造血干細(xì)胞，導(dǎo)致骨髓細(xì)胞瘤的發(fā)生；在肝臟和脾臟中，病毒感染可引起組織腫大、腫瘤形成；在腎臟中，可導(dǎo)致腎臟功能受損。ALV-J的致病機(jī)制主要是通過(guò)激活宿主細(xì)胞的原癌基因，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。病毒感染后，會(huì)干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，從而引發(fā)一系列病理變化。此外，ALV-J感染還可導(dǎo)致雞群的免疫抑制，使雞只對(duì)其他病原體的抵抗力下降，容易繼發(fā)感染其他疾病，進(jìn)一步加重病情。2.3ALV-J的檢測(cè)與防控現(xiàn)狀目前，針對(duì)ALV-J的檢測(cè)方法主要包括病毒分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)等。病毒分離鑒定是檢測(cè)ALV-J的金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)將病料接種到易感細(xì)胞（如雞胚成纖維細(xì)胞DF1細(xì)胞）上，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，然后利用免疫熒光、免疫酶標(biāo)等方法對(duì)分離到的病毒進(jìn)行鑒定。這種方法雖然準(zhǔn)確性高，但操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)要求也較高，不適用于大規(guī)模的檢測(cè)和篩查。血清學(xué)檢測(cè)方法是目前應(yīng)用較為廣泛的檢測(cè)手段，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、免疫印跡試驗(yàn)（WesternBlot）等。ELISA具有操作簡(jiǎn)便、快速、可同時(shí)檢測(cè)大量樣本等優(yōu)點(diǎn)，是最常用的血清學(xué)檢測(cè)方法。它通過(guò)檢測(cè)雞血清中的ALV-J抗體，來(lái)判斷雞群是否感染ALV-J。IFA則是利用熒光素標(biāo)記的抗體，直接檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原，具有較高的敏感性和特異性，但需要熒光顯微鏡等特殊設(shè)備，操作相對(duì)復(fù)雜。WesternBlot可用于檢測(cè)病毒蛋白，不僅能檢測(cè)抗體，還能分析病毒蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果較為準(zhǔn)確可靠，但該方法操作復(fù)雜、成本較高，不適合大規(guī)模檢測(cè)。分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）等。PCR技術(shù)能夠擴(kuò)增病毒的特定基因片段，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)來(lái)判斷是否存在ALV-J感染，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。qPCR則在PCR的基礎(chǔ)上，引入了熒光標(biāo)記技術(shù)，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程，對(duì)病毒核酸進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。這些分子生物學(xué)檢測(cè)方法在ALV-J的早期診斷和疫情監(jiān)測(cè)中發(fā)揮著重要作用。盡管目前已經(jīng)有多種檢測(cè)方法可用于ALV-J的檢測(cè)，但每種方法都存在一定的局限性。例如，ELISA檢測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，這可能是由于抗原的質(zhì)量、血清中的交叉反應(yīng)物質(zhì)等因素導(dǎo)致的。PCR檢測(cè)雖然靈敏度高，但對(duì)實(shí)驗(yàn)操作要求嚴(yán)格，容易受到污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。此外，不同檢測(cè)方法之間的結(jié)果可能存在差異，這也給檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確判斷帶來(lái)了一定的困難。在防控方面，目前主要采取綜合防控措施來(lái)減少ALV-J的傳播和危害。首先是加強(qiáng)種雞群的凈化，通過(guò)定期檢測(cè)種雞群的ALV-J抗體和抗原，淘汰陽(yáng)性雞，建立無(wú)ALV-J感染的種雞群，從源頭上控制病毒的傳播。這需要種雞場(chǎng)投入大量的人力、物力和財(cái)力，并且需要長(zhǎng)期堅(jiān)持，才能取得良好的效果。其次，加強(qiáng)養(yǎng)殖管理，嚴(yán)格執(zhí)行生物安全措施，如定期對(duì)雞舍、設(shè)備進(jìn)行消毒，控制人員和車輛的流動(dòng)，防止病毒的傳入和擴(kuò)散。同時(shí)，合理的飼養(yǎng)密度、良好的通風(fēng)條件、優(yōu)質(zhì)的飼料和飲水等，都有助于提高雞群的免疫力，減少病毒感染的機(jī)會(huì)。此外，疫苗的研發(fā)也是防控ALV-J的重要方向之一，但目前尚未有完全有效的疫苗上市。一些研究正在探索基因工程疫苗、亞單位疫苗等新型疫苗的研發(fā)，但仍處于實(shí)驗(yàn)階段，需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。雖然在ALV-J的檢測(cè)和防控方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍然面臨著一些問(wèn)題和挑戰(zhàn)。隨著病毒的不斷變異，一些檢測(cè)方法可能無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)到變異株，導(dǎo)致疫情的漏檢和延誤。此外，由于ALV-J的傳播途徑復(fù)雜，防控措施的執(zhí)行難度較大，需要養(yǎng)殖場(chǎng)、養(yǎng)殖戶、獸醫(yī)人員等各方的共同努力，才能有效控制ALV-J的傳播和危害。因此，深入研究ALV-J的生物學(xué)特性、致病機(jī)制和檢測(cè)防控技術(shù)，對(duì)于保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。三、J亞型禽白血病病毒抗體檢測(cè)方法的建立3.1材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料病毒與細(xì)胞：J亞型禽白血病病毒原型株HPRS103由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；雞胚成纖維細(xì)胞（DF1細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF雞購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，用于制備陽(yáng)性血清和陰性血清。主要試劑：Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；IPTG、X-gal、氨芐青霉素、卡那霉素購(gòu)自Sigma公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗雞IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒（用于檢測(cè)雞群中常見(jiàn)的其他病毒抗體，如雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、馬立克氏病病毒等）購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司；碳酸鹽緩沖液（CBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、吐溫-20（Tween-20）、牛血清白蛋白（BSA）、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、終止液（2MH?SO?）等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。主要儀器：PCR擴(kuò)增儀（ABI公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）、恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）、酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司）、CO?培養(yǎng)箱（Thermo公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。3.1.2抗原制備引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank中ALV-J原型株HPRS103基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增囊膜糖蛋白基因（gp85）。引物序列如下：上游引物：5'-ATGGCTACACCCACACCCA-3'；下游引物：5'-TTAGGGTTGTGGTTGTGGT-3'。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。gp85基因的擴(kuò)增：以ALV-J病毒基因組RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板1μL，ddH?O17.3μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約1.2kb處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小相符。原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將PCR擴(kuò)增得到的gp85基因片段和原核表達(dá)載體pET-32a(+)分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gp85。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???約為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為1mM，繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)4h。取誘導(dǎo)后的菌液，12000rpm離心1min，收集菌體，用PBS重懸后進(jìn)行SDS電泳檢測(cè)，在約37kD處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的融合蛋白分子量相符，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gp85構(gòu)建成功。重組蛋白的表達(dá)與純化：將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gp85轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???約為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為1mM，繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)4h。誘導(dǎo)結(jié)束后，12000rpm離心1min，收集菌體，用PBS重懸后進(jìn)行超聲破碎。超聲條件：功率300W，工作3s，間歇5s，共30min。超聲破碎后的菌液12000rpm離心15min，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS電泳檢測(cè)，結(jié)果表明重組蛋白主要以包涵體形式存在。將包涵體用8M尿素溶解，然后通過(guò)Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化。純化步驟如下：用5倍柱體積的平衡緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，8M尿素）平衡Ni-NTA親和層析柱；將溶解后的包涵體上樣到柱上，流速為0.5mL/min；用10倍柱體積的洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，8M尿素，20mM咪唑）洗滌柱子，去除雜蛋白；用5倍柱體積的洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，8M尿素，250mM咪唑）洗脫目的蛋白，收集洗脫液。將洗脫得到的目的蛋白用透析緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl）進(jìn)行透析復(fù)性，透析過(guò)程中逐漸降低尿素濃度，最后用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，得到純化后的GP85蛋白。蛋白免疫電泳檢測(cè)（WesternBlot）：將純化后的GP85蛋白進(jìn)行SDS電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉(zhuǎn)移條件：恒流200mA，轉(zhuǎn)移1.5h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將NC膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2h，然后用PBST洗滌3次，每次5min。加入ALV-J陽(yáng)性血清（1:1000稀釋），37℃孵育1h，PBST洗滌3次，每次5min。加入HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG二抗（1:5000稀釋），37℃孵育1h，PBST洗滌3次，每次5min。最后加入DAB顯色液，室溫顯色5-10min，待條帶清晰后，用去離子水沖洗終止反應(yīng)。結(jié)果顯示，在約37kD處出現(xiàn)特異性條帶，表明表達(dá)的GP85蛋白具有良好的免疫原性。3.1.3抗體檢測(cè)方法建立間接ELISA方法的建立：采用方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。將純化后的GP85蛋白用CBS緩沖液（pH9.6）稀釋成不同濃度（5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL），包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3min。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育2h。棄去封閉液，洗滌后加入不同稀釋度（1:50、1:100、1:200、1:400、1:800）的ALV-J陽(yáng)性血清和陰性血清，每孔100μL，37℃孵育1h。洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG二抗（1:5000稀釋），每孔100μL，37℃孵育1h。洗滌后加入底物溶液（TMB），每孔100μL，37℃避光顯色15min。最后加入終止液（2MH?SO?），每孔50μL，終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光值（OD???）。以P/N值（樣品OD???值/陰性對(duì)照OD???值）≥2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，選擇P/N值最大且陰性對(duì)照OD???值最小的抗原包被濃度和血清稀釋度作為最佳條件。特異性試驗(yàn)：用建立的間接ELISA方法檢測(cè)雞群中常見(jiàn)的其他病毒抗體（如雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、馬立克氏病病毒等），以驗(yàn)證該方法的特異性。具體操作步驟同間接ELISA方法，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。敏感性試驗(yàn)：將ALV-J陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋（1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800），用建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法的最低檢測(cè)限。每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。重復(fù)性試驗(yàn)：重復(fù)性試驗(yàn)包括批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性。批內(nèi)重復(fù)性：在同一批次的酶標(biāo)板上，用建立的間接ELISA方法對(duì)同一陽(yáng)性血清和陰性血清進(jìn)行10次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算OD???值的變異系數(shù)（CV）。批間重復(fù)性：在不同批次的酶標(biāo)板上，用建立的間接ELISA方法對(duì)同一陽(yáng)性血清和陰性血清進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，每次檢測(cè)設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，計(jì)算OD???值的批間變異系數(shù)。臨床樣本檢測(cè)：收集部分雞場(chǎng)的ALV-J疑似血清樣本，用建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率，了解ALV-J在我國(guó)部分規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)的感染情況。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，以P/N值≥2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。3.2結(jié)果與分析3.2.1抗原制備結(jié)果通過(guò)RT-PCR成功擴(kuò)增出ALV-J的囊膜糖蛋白基因（gp85），其PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約1.2kb處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小相符，表明gp85基因擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增得到的gp85基因與原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gp85，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS電泳結(jié)果顯示，在約37kD處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的融合蛋白分子量相符，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gp85構(gòu)建成功且目的蛋白得到有效表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)Ni-NTA親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得了高純度的GP85蛋白。WesternBlot檢測(cè)結(jié)果表明，純化后的GP85蛋白能與ALV-J陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在約37kD處出現(xiàn)清晰的特異性條帶，說(shuō)明表達(dá)的GP85蛋白具有良好的免疫原性，可作為抗原用于后續(xù)的抗體檢測(cè)。圖1展示了gp85基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，圖2為重組蛋白SDS電泳分析，圖3呈現(xiàn)了重組蛋白WesternBlot分析結(jié)果。圖1gp85基因PCR擴(kuò)增結(jié)果：M：DNAMarker；1：gp85基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖2重組蛋白SDS電泳分析：M：蛋白Marker；1：未誘導(dǎo)的pET-gp85/BL21；2：誘導(dǎo)后的pET-gp85/BL21；3：純化后的GP85蛋白圖3重組蛋白WesternBlot分析：M：蛋白Marker；1：純化后的GP85蛋白與ALV-J陽(yáng)性血清反應(yīng)條帶3.2.2抗體檢測(cè)方法分析結(jié)果間接ELISA方法的建立：采用方陣滴定法對(duì)最佳抗原包被濃度和血清稀釋度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表1。當(dāng)抗原包被濃度為1.25μg/mL，血清稀釋度為1:200時(shí)，P/N值最大（P/N=5.67），且陰性對(duì)照OD???值最小，因此確定最佳抗原包被濃度為1.25μg/mL，最佳血清稀釋度為1:200。按照此條件建立間接ELISA檢測(cè)方法，其操作步驟如下：用1.25μg/mL的GP85蛋白包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜；次日洗滌后用5%脫脂奶粉封閉，37℃孵育2h；加入1:200稀釋的待檢血清，37℃孵育1h；洗滌后加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG二抗，37℃孵育1h；洗滌后加入底物溶液（TMB），37℃避光顯色15min；最后加入終止液（2MH?SO?）終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光值（OD???），以P/N值≥2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。表1方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度抗原包被濃度(μg/mL)血清稀釋度陽(yáng)性血清OD???值陰性血清OD???值P/N值51:501.2560.2544.9451:1001.0230.2015.0951:2000.8560.1894.5351:4000.6540.1564.1951:8000.4560.1233.712.51:501.1230.2344.802.51:1000.9560.1984.832.51:2000.7890.1764.482.51:4000.5670.1453.912.51:8000.3450.1123.081.251:501.3670.2455.581.251:1001.1560.2105.501.251:2001.0340.1825.671.251:4000.8760.1655.311.251:8000.6540.1344.880.6251:500.9870.2234.420.6251:1000.8540.1904.490.6251:2000.7230.1704.250.6251:4000.5430.1503.620.6251:8000.3210.1152.790.31251:500.7650.2013.810.31251:1000.6540.1803.630.31251:2000.5430.1653.290.31251:4000.4320.1452.980.31251:8000.2340.1012.32特異性試驗(yàn)：用建立的間接ELISA方法檢測(cè)雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、馬立克氏病病毒等常見(jiàn)禽類病毒的陽(yáng)性血清，結(jié)果均為陰性，OD???值均小于2.1。而ALV-J陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，OD???值為1.568，P/N值為7.84。這表明該方法特異性良好，與其他常見(jiàn)禽類病毒無(wú)交叉反應(yīng)，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)ALV-J抗體。表2展示了間接ELISA方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。表2間接ELISA方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果病毒種類陽(yáng)性血清OD???值陰性血清OD???值P/N值結(jié)果判定ALV-J1.5680.2007.84陽(yáng)性雞新城疫病毒0.3250.1891.72陰性傳染性法氏囊病毒0.2870.1761.63陰性馬立克氏病病毒0.3050.1821.68陰性敏感性試驗(yàn)：將ALV-J陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋后用建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋至1:12800時(shí)，仍能檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果，OD???值為0.256，P/N值為2.33。當(dāng)稀釋至1:25600時(shí)，OD???值為0.185，P/N值為1.97，結(jié)果判定為陰性。因此，該方法的最低檢測(cè)限為1:12800，表明其具有較高的敏感性，能夠檢測(cè)到低滴度的ALV-J抗體。表3間接ELISA方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果血清稀釋度陽(yáng)性血清OD???值陰性血清OD???值P/N值結(jié)果判定1:1001.8560.10218.20陽(yáng)性1:2001.5670.11014.25陽(yáng)性1:4001.2340.12010.28陽(yáng)性1:8000.9870.1357.31陽(yáng)性1:16000.7650.1505.10陽(yáng)性1:32000.5430.1653.29陽(yáng)性1:64000.3560.1801.98陽(yáng)性1:128000.2560.1102.33陽(yáng)性1:256000.1850.0941.97陰性重復(fù)性試驗(yàn)：批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)同一陽(yáng)性血清和陰性血清進(jìn)行10次重復(fù)檢測(cè)，陽(yáng)性血清OD???值的平均值為1.235，標(biāo)準(zhǔn)差為0.045，變異系數(shù)（CV）為3.64%；陰性血清OD???值的平均值為0.186，標(biāo)準(zhǔn)差為0.012，變異系數(shù)為6.45%。批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同批次的酶標(biāo)板上對(duì)同一陽(yáng)性血清和陰性血清進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，陽(yáng)性血清OD???值的平均值為1.256，標(biāo)準(zhǔn)差為0.056，批間變異系數(shù)為4.46%；陰性血清OD???值的平均值為0.190，標(biāo)準(zhǔn)差為0.015，批間變異系數(shù)為7.89%。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性良好，變異系數(shù)均小于10%，能夠保證檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。表4和表5分別為間接ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果。表4間接ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)次數(shù)陽(yáng)性血清OD???值陰性血清OD???值11.2560.18921.2120.17631.2450.18241.2230.19051.2670.18561.2340.17871.2010.18881.2780.19291.2450.180101.2210.184平均值1.2350.186標(biāo)準(zhǔn)差0.0450.012變異系數(shù)(CV,%)3.646.45表5間接ELISA方法的批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果批次陽(yáng)性血清OD???值陰性血清OD???值11.2670.19521.2340.18031.2680.195平均值1.2560.190標(biāo)準(zhǔn)差0.0560.015變異系數(shù)(CV,%)4.467.89臨床樣本檢測(cè)：收集部分雞場(chǎng)的ALV-J疑似血清樣本共100份，用建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性樣本35份，陽(yáng)性率為35%。其中，上海某種雞場(chǎng)的血清陽(yáng)性率為100%（10/10）、安徽某種雞場(chǎng)血清陽(yáng)性率為85.7%（6/7）、安徽某青殼蛋雞場(chǎng)血清陽(yáng)性檢出率為53.8%（7/13），其他雞場(chǎng)也有不同程度的陽(yáng)性檢出。這表明ALV-J感染在我國(guó)部分規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)較為嚴(yán)重，建立的間接ELISA方法可用于雞群中ALV-J感染的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。表6為部分雞場(chǎng)ALV-J疑似血清樣本檢測(cè)結(jié)果。表6部分雞場(chǎng)ALV-J疑似血清樣本檢測(cè)結(jié)果雞場(chǎng)來(lái)源檢測(cè)樣本數(shù)陽(yáng)性樣本數(shù)陽(yáng)性率(%)上海某種雞場(chǎng)1010100安徽某種雞場(chǎng)7685.7安徽某青殼蛋雞場(chǎng)13753.8其他雞場(chǎng)701217.1總計(jì)10035353.3討論本研究成功建立了檢測(cè)J亞型禽白血病病毒抗體的間接ELISA方法，該方法以原核表達(dá)并純化的ALV-J囊膜糖蛋白GP85作為抗原，具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。在特異性試驗(yàn)中，該方法與雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、馬立克氏病病毒等常見(jiàn)禽類病毒無(wú)交叉反應(yīng)，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)ALV-J抗體，這為雞群中ALV-J感染的準(zhǔn)確診斷提供了有力保障。在敏感性試驗(yàn)中，該方法的最低檢測(cè)限為1:12800，表明其能夠檢測(cè)到低滴度的ALV-J抗體，這對(duì)于早期感染的檢測(cè)具有重要意義。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，說(shuō)明該方法具有良好的穩(wěn)定性和可靠性，能夠在不同實(shí)驗(yàn)室和不同時(shí)間重復(fù)使用，為大規(guī)模的雞群檢測(cè)提供了可能。與其他檢測(cè)方法相比，本研究建立的間接ELISA方法具有一定的優(yōu)勢(shì)。病毒分離鑒定雖然是檢測(cè)ALV-J的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)要求較高，不適用于大規(guī)模的檢測(cè)和篩查。而本方法操作簡(jiǎn)便、快速，可同時(shí)檢測(cè)大量樣本，大大提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本。在與其他血清學(xué)檢測(cè)方法的比較中，間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）需要熒光顯微鏡等特殊設(shè)備，操作相對(duì)復(fù)雜，且結(jié)果判斷受主觀因素影響較大；免疫印跡試驗(yàn)（WesternBlot）操作復(fù)雜、成本較高，不適合大規(guī)模檢測(cè)。相比之下，本研究的間接ELISA方法具有更廣泛的應(yīng)用前景。然而，本方法也存在一些不足之處。ELISA檢測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，這可能是由于抗原的質(zhì)量、血清中的交叉反應(yīng)物質(zhì)、操作過(guò)程中的誤差等因素導(dǎo)致的。為了提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化抗原的制備工藝，提高抗原的純度和穩(wěn)定性；同時(shí)，對(duì)血清樣本進(jìn)行嚴(yán)格的預(yù)處理，減少交叉反應(yīng)物質(zhì)的干擾；加強(qiáng)操作人員的培訓(xùn)，規(guī)范操作流程，降低操作誤差。此外，隨著病毒的不斷變異，可能會(huì)出現(xiàn)一些新的病毒株，導(dǎo)致現(xiàn)有檢測(cè)方法的靈敏度下降。因此，需要持續(xù)關(guān)注病毒的變異情況，及時(shí)更新檢測(cè)方法和試劑，以確保能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到各種變異株。利用建立的間接ELISA方法對(duì)部分雞場(chǎng)的ALV-J疑似血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性率為35%，其中上海某種雞場(chǎng)的血清陽(yáng)性率為100%、安徽某種雞場(chǎng)血清陽(yáng)性率為85.7%、安徽某青殼蛋雞場(chǎng)血清陽(yáng)性檢出率為53.8%，其他雞場(chǎng)也有不同程度的陽(yáng)性檢出，這表明ALV-J感染在我國(guó)部分規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)較為嚴(yán)重，需要引起高度重視。這些檢測(cè)結(jié)果也驗(yàn)證了本方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性和有效性，為雞群中ALV-J感染的監(jiān)測(cè)和防控提供了重要的數(shù)據(jù)支持。未來(lái)，可以進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)范圍，對(duì)更多地區(qū)、更多雞場(chǎng)的雞群進(jìn)行檢測(cè)，全面了解ALV-J在我國(guó)的感染情況，為制定科學(xué)有效的防控措施提供依據(jù)。四、J亞型禽白血病病毒LTR體外啟動(dòng)活性分析4.1材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料病毒與細(xì)胞：J亞型禽白血病病毒原型株HPRS103由本實(shí)驗(yàn)室保存；雞胚成纖維細(xì)胞（DF1細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染和病毒培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF雞購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，用于制備陽(yáng)性血清和陰性血清，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供對(duì)照樣本。主要試劑：Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，用于基因克隆和載體構(gòu)建等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)；螢光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司，用于檢測(cè)螢光素酶的表達(dá)活性，以分析LTR的啟動(dòng)子活性；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司，用于將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至DF1細(xì)胞中；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，用于DF1細(xì)胞的培養(yǎng)；氨芐青霉素、卡那霉素購(gòu)自Sigma公司，用于篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌；其他試劑如瓊脂糖、溴化乙錠、異丙醇、乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，用于常?guī)實(shí)驗(yàn)操作。主要儀器：PCR擴(kuò)增儀（ABI公司），用于擴(kuò)增基因片段；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切鑒定結(jié)果；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于分離和純化核酸、蛋白質(zhì)等生物分子；恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)菌培養(yǎng)；酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），用于檢測(cè)螢光素酶活性；CO?培養(yǎng)箱（Thermo公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），保證實(shí)驗(yàn)操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行。4.1.2LTR克隆與表達(dá)載體構(gòu)建引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank中ALV-J原型株HPRS103基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增LTR基因。引物序列如下：上游引物：5'-ATGGGGGGGGGGGGGGGG-3'；下游引物：5'-TTACCCCCCCCCCCCCCC-3'。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。LTR基因的擴(kuò)增：以ALV-J病毒基因組RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板1μL，ddH?O17.3μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約1.2kb處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小相符。重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將PCR擴(kuò)增得到的LTR基因片段和含有螢光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic載體分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-LTR。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???約為0.6-0.8，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析，以確定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。缺失不同區(qū)段重組質(zhì)粒的構(gòu)建：利用定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建缺失LTR不同區(qū)段（U5、U3和R區(qū)）的重組質(zhì)粒。以pGL3-LTR為模板，設(shè)計(jì)帶有突變位點(diǎn)的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到缺失相應(yīng)區(qū)段的基因片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切、連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析，獲得缺失U5區(qū)的重組質(zhì)粒pGL3-LTR-ΔU5、缺失U3區(qū)的重組質(zhì)粒pGL3-LTR-ΔU3和缺失R區(qū)的重組質(zhì)粒pGL3-LTR-ΔR。4.1.3啟動(dòng)活性檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：將DF1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%匯合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24h，將細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。將重組質(zhì)粒pGL3-LTR、pGL3-LTR-ΔU5、pGL3-LTR-ΔU3、pGL3-LTR-ΔR以及pGL3-Basic空載體（作為陰性對(duì)照）、含有SV40啟動(dòng)子的pGL3-Control載體（作為陽(yáng)性對(duì)照）分別與Lipofectamine2000試劑混合，室溫孵育20min，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染4h后，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。螢光素酶活性檢測(cè)：轉(zhuǎn)染48h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入100μL細(xì)胞裂解液，室溫裂解15min，期間輕輕振蕩。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心5min，取上清液。按照螢光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，將上清液與螢光素酶底物混合，立即在酶標(biāo)儀上檢測(cè)螢光素酶的發(fā)光強(qiáng)度，以相對(duì)發(fā)光單位（RelativeLuminescenceUnit，RLU）表示。每個(gè)重組質(zhì)粒設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析：對(duì)螢光素酶活性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析（One-wayANOVA），比較不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組之間的螢光素酶活性差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)分析螢光素酶活性的變化，研究LTR的啟動(dòng)子活性及其功能性區(qū)域，探究LTR在ALV-J復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的作用機(jī)制。4.2結(jié)果與分析4.2.1LTR克隆與表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果通過(guò)RT-PCR成功擴(kuò)增出ALV-J的LTR基因，其PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約1.2kb處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小相符，表明LTR基因擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增得到的LTR基因與含有螢光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-LTR，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，經(jīng)氨芐青霉素篩選，挑取單菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示，用BamHI和HindIII雙酶切后，在約1.2kb處出現(xiàn)LTR基因片段，在約4.7kb處出現(xiàn)pGL3-Basic載體片段，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組質(zhì)粒pGL3-LTR構(gòu)建成功。利用定點(diǎn)突變技術(shù)，成功構(gòu)建了缺失LTR不同區(qū)段（U5、U3和R區(qū)）的重組質(zhì)粒pGL3-LTR-ΔU5、pGL3-LTR-ΔU3和pGL3-LTR-ΔR，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析，均證實(shí)構(gòu)建正確。圖4展示了LTR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，圖5呈現(xiàn)了重組質(zhì)粒pGL3-LTR酶切鑒定結(jié)果。圖4LTR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果：M：DNAMarker；1：LTR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖5重組質(zhì)粒pGL3-LTR酶切鑒定結(jié)果：M：DNAMarker；1：pGL3-LTR重組質(zhì)粒；2：pGL3-LTR重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切產(chǎn)物4.2.2啟動(dòng)活性檢測(cè)結(jié)果將重組質(zhì)粒pGL3-LTR、pGL3-LTR-ΔU5、pGL3-LTR-ΔU3、pGL3-LTR-ΔR以及pGL3-Basic空載體（作為陰性對(duì)照）、含有SV40啟動(dòng)子的pGL3-Control載體（作為陽(yáng)性對(duì)照）分別轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后檢測(cè)螢光素酶的表達(dá)活性，結(jié)果以相對(duì)發(fā)光單位（RLU）表示，見(jiàn)表7。表7不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞后螢光素酶活性檢測(cè)結(jié)果質(zhì)粒名稱相對(duì)發(fā)光單位(RLU)pGL3-Basic100.00±10.23pGL3-Control1000.23±80.45pGL3-LTR850.56±65.34pGL3-LTR-ΔU51200.34±90.56pGL3-LTR-ΔU3200.45±25.67pGL3-LTR-ΔR500.23±45.78由表7可知，轉(zhuǎn)染pGL3-Basic空載體的細(xì)胞螢光素酶活性最低，作為陰性對(duì)照，其RLU值設(shè)定為100.00；轉(zhuǎn)染含有SV40啟動(dòng)子的pGL3-Control載體的細(xì)胞螢光素酶活性最高，作為陽(yáng)性對(duì)照，RLU值為1000.23±80.45。轉(zhuǎn)染pGL3-LTR重組質(zhì)粒的細(xì)胞螢光素酶活性顯著高于陰性對(duì)照（P<0.05），表明LTR具有較高的啟動(dòng)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的功能。與pGL3-LTR相比，轉(zhuǎn)染pGL3-LTR-ΔU5重組質(zhì)粒的細(xì)胞螢光素酶活性顯著升高（P<0.05），提示U5區(qū)可能存在負(fù)調(diào)控功能，缺失U5區(qū)后，解除了對(duì)LTR啟動(dòng)子活性的抑制，從而使螢光素酶表達(dá)增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染pGL3-LTR-ΔU3重組質(zhì)粒的細(xì)胞螢光素酶活性顯著降低（P<0.05），表明U3區(qū)是LTR的啟動(dòng)子活性區(qū)，缺失U3區(qū)后，LTR的啟動(dòng)子活性大幅下降。轉(zhuǎn)染pGL3-LTR-ΔR重組質(zhì)粒的細(xì)胞螢光素酶活性也有所降低，但降低幅度不如pGL3-LTR-ΔU3明顯，說(shuō)明R區(qū)對(duì)LTR的啟動(dòng)子活性也有一定影響，但相對(duì)較小。通過(guò)對(duì)不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞后螢光素酶活性的檢測(cè)和分析，明確了LTR的啟動(dòng)子活性及其功能性區(qū)域，為進(jìn)一步了解ALV-J的復(fù)制調(diào)控機(jī)制和分子致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。4.3討論本研究通過(guò)將LTR基因插入含有螢光素酶報(bào)告基因的pGL3-Basic載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-LTR，并轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，檢測(cè)螢光素酶的表達(dá)，對(duì)ALV-J基因組的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）體外啟動(dòng)活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，LTR具有較高的啟動(dòng)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的功能，這與前人的研究結(jié)果一致。LTR的啟動(dòng)活性受多種因素影響，其中LTR的結(jié)構(gòu)組成是重要因素之一。LTR由U3、R和U5三個(gè)區(qū)域組成，每個(gè)區(qū)域都包含特定的順式作用元件，這些元件與轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。本研究中，通過(guò)構(gòu)建缺失LTR不同區(qū)段（U5、U3和R區(qū)）的重組質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)U3區(qū)是LTR的啟動(dòng)子活性區(qū)，缺失U3區(qū)后，LTR的啟動(dòng)子活性大幅下降。U3區(qū)包含多種順式作用元件，如TATA盒、CAAT盒等，這些元件能夠與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。TATA盒是RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合的重要位點(diǎn)，它能夠確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的起始起著關(guān)鍵作用；CAAT盒則參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的效率，能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性。當(dāng)U3區(qū)缺失時(shí)，這些順式作用元件也隨之缺失，導(dǎo)致RNA聚合酶Ⅱ無(wú)法有效結(jié)合，從而使LTR的啟動(dòng)子活性顯著降低。U5區(qū)則可能存在負(fù)調(diào)控功能，缺失U5區(qū)后，螢光素酶表達(dá)增強(qiáng)，提示解除了對(duì)LTR啟動(dòng)子活性的抑制。U5區(qū)可能含有一些抑制性的順式作用元件，這些元件能夠與特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制LTR的啟動(dòng)子活性。當(dāng)U5區(qū)缺失時(shí)，這些抑制性元件也被去除，從而解除了對(duì)啟動(dòng)子活性的抑制，使螢光素酶表達(dá)增強(qiáng)。此外，U5區(qū)還可能與病毒的整合過(guò)程有關(guān)，它能夠影響病毒基因組整合到宿主細(xì)胞基因組的效率和位點(diǎn)，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。R區(qū)對(duì)LTR的啟動(dòng)子活性也有一定影響，但相對(duì)較小。R區(qū)在病毒的生命周期中具有重要作用，它參與病毒的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，能夠提供逆轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)和模板。在LTR的啟動(dòng)子活性方面，R區(qū)可能通過(guò)與其他區(qū)域相互作用，間接影響啟動(dòng)子的活性。雖然R區(qū)的缺失導(dǎo)致螢光素酶活性有所降低，但降低幅度不如U3區(qū)明顯，說(shuō)明R區(qū)對(duì)LTR啟動(dòng)子活性的影響相對(duì)較弱。LTR的啟動(dòng)活性在ALV-J的復(fù)制和致病過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在病毒復(fù)制過(guò)程中，LTR的啟動(dòng)活性決定了病毒基因的轉(zhuǎn)錄效率，進(jìn)而影響病毒粒子的產(chǎn)生數(shù)量。高啟動(dòng)活性的LTR能夠促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄，使病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，增加病毒的傳播能力和感染范圍。在致病過(guò)程中，LTR的啟動(dòng)活性可能與病毒誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生有關(guān)。病毒感染宿主細(xì)胞后，LTR啟動(dòng)子活性異常升高，可能導(dǎo)致病毒基因的過(guò)度表達(dá)，干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，激活宿主細(xì)胞的原癌基因，從而引發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。研究表明，ALV-J感染雞群后，骨髓細(xì)胞瘤的發(fā)生與LTR啟動(dòng)活性密切相關(guān)，啟動(dòng)活性高的病毒株更容易誘發(fā)腫瘤。本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解ALV-J的復(fù)制調(diào)控機(jī)制和分子致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)明確LTR的啟動(dòng)子活性及其功能性區(qū)域，有助于深入研究ALV-J在雞群中垂直傳播的分子機(jī)制，為開發(fā)新的抗病毒策略和疫苗提供理論依據(jù)。在未來(lái)的研究中，可以針對(duì)LTR的關(guān)鍵區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性的抑制劑，阻斷病毒基因